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MiR-181b and NF-KB In vitro and in vivo study,1,2,细胞实验一：miR-181b对HUVEC功能影响 1、TNF-影响miR-181b表达,(A) Real-time qPCR analysis of miR-181b in response to TNF- (10 ng/ml) in HUVECs.,短时间作用 不同时间点作用,3,2、TNF-作用下，miR-181b影响HUVEC粘附因子表达,4,蛋白、mRNA、 细胞上清 三个层面证明,ICAM-1、VCAM-1、E-selectin是影响ECs与WBC粘附的主要分子,5,3、TNF-作用下，miR-181b影响细胞粘附,6,细胞实验二：miR-181b靶点的确定 1、TNF-(+)(-)，WB筛查靶点,只使用了miR-181b-m及对照,7,2、荧光素酶报告系统实验,1、仅使用miR-181b ；2、载体使用浓度梯度 3、用真核细胞表达载体将miR-181b导入细胞,8,3、miR-181b与靶点结合区域的确认,(D) Normalized luciferase activity of a reporter containing 3 UTR of importin-3, predicted miR-181bbinding sites, or mutated miR-181bbinding sites. The reporter was cotransfected with either pcDNA3.1 empty vector or pcDNA3.1miR-181b. *P 0.05.,9,4、miRNP-IP分析靶点mRNA富集,(E) miRNP-IP analysis of enrichment of importin-3 mRNA in HUVECs transfected with miRNA negative control or miR-181b mimics. *P 0.01.,10,11,细胞实验三：miR-181b对下游通路的作用 1、荧光素酶报告系统检测miR-181b对NF-B及VCAM1影响,TNF-(+)(-)条件下，HUVECs中miR-181b对 NF-B活性及VCAM1promoter活性的影响,12,2、miR-181b通过作用于靶蛋白影响NF-B活性,(F) Luciferase activity of reporters containing the NF-B concatemer in cells transfected with miRNA negative control or miR-181b mimics in the absence or presence of importin-3 gene lacking its 3 UTR. *P 0.05.,13,3、miR-181b对HUVECs NF- B活性的影响,14,4、TNF-(+)，miR-181b影响NF-B下游mRNA表达,瞬时转染 稳定转染,15,3、对下游蛋白表达的影响,16,In vivo 1：miR-181b对粘附因子表达的影响 VCAM-1 mRNA及蛋白水平检测,尾静脉注射，瞬时转染,17,VCAM-1组织原位杂交,18,组织水平确定miR-181b靶蛋白,19,
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