资源描述
Cloningvectors,Cloningvectors,plasmidsbacteriophagesCosmidBAC,YACanimalandplantvirusesbaculovirus,retroviruses,质粒,2-200kb发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。,质粒特性：携带编码多种基因:医学、农业、工业、环境细菌进化的重要因子可以在种内或种间转移生命和非生命的分水岭：既没有蛋白质外壳，又没有生命外细胞周期，比病毒更简单的原始生命形态，探索生命起源的重要基石。,Becapableofvectors,Replicatedandisolatedindependentlyofthehostsgenomeexprsssionvectors:strongpromotersselectablemarker.,Asimportanttools：easytoisolateeasytomanipulateandtransformateinvitrodevelopmentforDNAclonemethodtoexpressforeigngenesinprokaryotesandeukaryotes,质粒的表型效应致育性1946年，Lederbeger发现大肠杆菌有性生殖，F质粒或性质粒（sexplasmid)接合作用(conjugation)说明了“自然界存在着天然的基因工程。绿脓杆菌、抗药性因子(R因子)、大肠杆菌素因子和樟脑分解质粒、放线菌Scp1质粒,产生抗菌物质和毒素col（大肠杆菌素因子）：大肠杆菌素-蛋白质性质的抗菌物质；大肠杆菌、索氏志贺氏菌、葡萄球菌pGKL1和pGKL2：线型DNA质粒，致死效应乳酸克鲁维酵母scp1：产生抗生素编码毒素：产毒素大肠杆菌（人类和动物腹泻）；金黄色葡萄球菌（烫伤皮肤综合症）；Bt,对药物和重金属离子抗性R因子R1质粒(94kb)使宿主对氯霉(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄(Ap)和卡那霉素(Km)抗性对金属离子抗性碲(Te+6)、砷(As3+)、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等,利用异常营养物Pseudomonas、克氏杆菌、短黄杆菌等将许多化学毒物降解。降解酶由降解性质粒编码特殊有机物：樟脑、水杨酸、二甲苯、辛烷环保对植物的致病性Ti、Ri,其他共生质粒：豆科植物共生固氮的根瘤菌结瘤(nod)和固氮(fix)基因EcoRI:大肠杆菌Ry13质粒编码乳糖的利用等特性也与质粒有关隐秘质粒(crypticplasmid):不显示任何表型效应的质粒,detection如何判断细菌表现的遗传性状是染色体基因还是质粒基因编码的?根据:质粒遗传学特性和分子结构特性,遗传学特性a.消除(curing)b.遗传转移c.分子杂交,理化因子消除,丫淀橙、EB、利福平、丝裂霉素C、亚硝基胍、高温、紫外线消除作用不是药物对质粒DNA的破坏，而是对DNA复制的抑制质粒消除常自发地发生,生物学方法：原生质体形成和再生,理化因子对高度稳定的质粒消除不易奏效用溶菌酶处理等形成原生质体，再生后菌株便以很高的频率(94%)消除了质粒，如葡萄球菌、枯草杆菌、链霉菌、沙门氏菌等。消除机制尚不清楚，有人认为去壁形成原生质体时导致了质粒消除,另有认为质粒在原生质体再生过程中丢失的。,结构特性DNA结构和物理学特征：质粒与染色体不同a.离心:密度不同b.agarose电泳:分子量大小c.电镜观察:1mdsDNA=3000bpd.再转化,质粒的拷贝数质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系：质粒拷贝数=质粒DNA量/染色体DNA量MWc/MWp质粒的不相容性（incompatibility）在没有选择压力的条件下，两种不同质粒不能共存于同一宿主细胞内的现象。不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。,plasmidvectors1、是一独立的复制子；2、有筛选标记；3、具有酶切位点或多克隆位点；4、分子量小，拷贝数高。,质粒载体的设计,双抗生素蓝白斑筛选多克隆位点表达载体,构建质粒载体(1)分子量尽量小。15kb时转化效率低。小质粒优点:容易提取；较为抵抗机械(超声波)切割；多拷贝，给克隆基因提供了剂量效应；对内切酶提供多切点的机会大为减少。(2)了解载体上基因位置/限制酶作用位点。(3)包含可供选择的标记性状(基因)(4)应有另一个遗传标记基因（抗生素常用），(5)最大限度地具有MCS的单切点,质粒载体多种用途,转录、测序、亚克隆、表达转化E.coli容易，可重复性高容易大量分离提纯,质粒载体筛选方法,插入失活互补：IPTG,X-GAL直接筛选：抗生素表达筛选（抗体筛选）Probe筛选,质粒载体缺点,aCl2转化效率低克隆片段小于kb大量筛选时需要细胞裂解,phagevector48.5kb双链DNA。cos位点（cohesiveendsite):在DNA两端各有12nt的5单链突出，彼此序列互补。它是包装时的切割信号。插入型载体：在DNA非必需区插入外源片段。携带的外源片段小于2kb。取代型载体：外源片段取代了DNA非必需区，可携带20kb的外源片段。,Cosmidvector,带有cos位点的质粒载体4-6kb，带有选择标记，在构建cDNA文库中很有用。可携带大的外源DNA片段，克隆45kb真核基因。,Phasmid载体,含有噬菌体att位点（插入位点）的质粒。含有质粒的ori和噬菌体的ori。,YACvectorsBACvectors,PlantcloningvectorsTi质粒:侵染广泛的双子叶植物T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(T-DNAbordersequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。长度约35kb，和T-DNA处于不同位置,转移过程：农杆菌感染后，植物细胞接受刺激释放信号分子，反过来激活农杆菌Ti质粒上的vir基因；农杆菌粘附到植物细胞壁。植物激素诱导vir基因表达，其表达产物引起T-DNA脱离质粒，并位移进入植物细胞中,进入植物细胞的T-DNA整合并表达。改建理由：野生型Ti质粒分子量过大、缺乏合适的克隆位点、导致植株产生冠瘿病掌握原则:保留T-DNA的转移功能、取消T-DNA的致瘤性、通过简便手段可使外源DNA插入T-DNA之中。,CaMV克隆载体,含1个约8kb的环状双链DNA分子；用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移；其感染对植物有害，不能直接做载体；CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35SRNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。,Cloningvectorsofanimalcell动物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物5243bp共价闭合环状分子感染率高，几乎100寄主细胞能被感染能提供完整的真核基因转录所需的成分侵染性具有寄主特异性改建：野生型最多只能包装其基因组长度的1.05倍的DNA分子其他：痘苗病毒DNA作载体，表达乙肝表面抗原用家蚕的核多角体病毒表达人-干扰素,反转录病毒克隆载体,反转录病毒是一类含RNA的病毒，进入受体细胞后，RNA反转录成DNA，通过两端由数百bp组成的长末端重复序列，整合到染色体上，成为原病毒。只要将外源目的基因组入原病毒DNA的合适克隆位点，就能在感染的动物细胞中表达。,
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