基因的分离与鉴定ppt课件

基因的分离与鉴定,1,DNA克隆片段的产生和分离 重组体DNA分子的构建及导入受 体细胞 基因克隆的实验方案 克隆基因的分离 重组子的选择与鉴定,2,DNA克隆片段的产生和分离 1. 利用限制性内切酶片段化基因组DNA 鸟枪法（shotgun approch）：用限制性内切酶消化给体基因组DNA，这种消化产物，不经过凝胶电泳分部分离，就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。 2. 凝胶电泳法和蔗糖梯度离心法分离,3,构 建 重 组 DNA 分 子 的 途 径,4,重组子分子导入受体细胞的途径 原核生物的转化与转染 真核生物的转染,5,原核生物的转化与转染 E.coli的钙转化 E.coli的电穿孔转化 转染 转导,6,E.coli的钙转化 细菌细胞在一定的生理状态（感受态），或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况下，都可吸收外源，利用这一特性可将重组导入受体细胞中，用质粒作载体的遗传工程一般使用这种方法。 由于E.coli不会自发地产生感受态，因此E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是将E.coli用冷CaCl2(0) 致敏，而后在高温（42 ）下热休克，这样可使外原DNA进入受体细胞。,7,E.coli的电穿孔转化 在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外原DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。,8,转染是指转化感染（Transfection来自于transfomation与infection） 凡是以噬菌体（如M13）或病毒为载体，以转化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转染。因此转染就方法来说与转化是一样的。,9,体外包装颗粒的转导 将重组的 噬菌体DNA或重组的柯斯载体DNA经体外包装成具有感染能体力的噬菌体颗粒，然后经由在受体细胞表面上的DNA接受位点，使这些带有目的基因序列的重组体DNA注入大肠杆菌。,10,真核生物的转染 1. 磷酸钙转染技术 2.电穿孔法 3.基因抢转染法 4.激光微束穿孔法 5.显微注射法 6.脂质体介导法 7.多聚物介导法,11,磷酸钙转染技术 主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。,12,电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样，主要用于植物细胞的转染。 基因抢转染法：主要用于植物细胞的转染。利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。,13,激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线粒体的基因工程操作。利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。 显微注射法：主要用于动物细胞或植物的原生质体，利用毛细管直接将DNA注入细胞内。,14,脂质体（liposome）介导法：主要用于动物细胞或植物的原生质体。将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。 多聚物介导法：用于动物细胞或植物的原生质体。利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。,15,基因克隆的实验方案 1. cDNA基因克隆 2. 基因组DNA克隆 3. 基因定位克隆,16,cDNA基因克隆,cDNA libraries,17,cDNA基因克隆 cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。,18,cDNA libraries,mRNA isolation, purification,Check theRNA integrity,Fractionate and enrich mRNA,Synthesis of cDNA,Treatment of cDNA ends,Ligation to vector,19,cDNA文库,没有原核生物的cDNA 文库 原核生物的 mRNA 非常不稳定； 原核生物的基因组文库比较容易构建，能包含所有基因的序列。,20,