愈伤组织培养ppt课件

第五章 愈伤组织的培养,第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子,1,第一节 愈伤组织的诱导和分化,1 愈伤组织的诱导 2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素,2,愈伤组织(callus)：离体组织或器官进行离体培养时，进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的无定形的薄壁细胞。,From embryo culture,From root,1 愈伤组织的诱导,3,4,5,2 愈伤组织的形成,从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：,6,2. 1 起始期：,细胞准备进行分裂的时期。 外植体的细胞处在静止状态。 一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成, 诱导细胞开始分裂。,7,起始期细胞内发生的变化,激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成增加, 诱导细胞开始分裂。 每个细胞的蛋白质总增加量可达200 % 酶活性增强，气体交换增加，如氧气的吸收增加 细胞的大小没有多大改变,8,2. 2 分裂期:,分裂期：外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂增生子细胞的过程。 脱分化：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能,9,分裂期外植体的特征:,细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。,10,外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外层细胞数目增加， 细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。逐步回到分生组织状态。 随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。 细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。,细胞的主要表现:,11,2. 3 形成期：,指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。,12,细胞分裂部位和方向发生改变：内部细胞发生分裂，形成像维管束或类似分生组织，组成的鸟巢状结构。 细胞的体积相对稳定，不再减少。 出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。 生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。,细胞特点：,13,14,Red,White callus,Green callus,Yellow callus,根据愈伤色泽划分为：,愈伤组织的分类,15,易碎的愈伤,坚硬的愈伤,生根的愈伤,渗出粘性多糖的愈伤,根据愈伤质地划分为：,16,文心兰的根（a）茎（b）叶（c）诱导的愈伤组织,根据愈伤发生部位：,17,胚性愈伤组织 表面呈颗粒状、组织结构紧凑、再生力强。,非胚性愈伤组织 表面粗糙、组织结构疏松。,根据愈伤难易程度：,胚性愈伤组织容易形成胚状体,非胚性愈伤组织诱导率可达100，胚性愈伤组织诱导率相对较低。,18,愈伤组织生长周期,愈伤组织生长周期为24周。 在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。 转移到新鲜培养基：定期地将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，可以长期保持旺盛的生长。,19,第一节 愈伤组织的诱导和分化,1 愈伤组织的诱导 2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素,20,（1）不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异。 不同植物种类、同一植物不同器官来源及其生理状况、年龄的外植体的脱分化（形成愈伤组织）能力有很大差别。 烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难； 花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难； 幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。,2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素,21,（2）培养基种类对愈伤组织诱导的影响。 诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。 （3）外源激素对愈伤组织诱导的影响-重要因素。 （4）培养条件对愈伤组织诱导的影响: 湿度条件、温度条件、光照条件。,22,2,4-D和BA浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长的影响,23,各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应 （各种生长素浓度为10mol/L）,24,25,第五章 愈伤组织的培养,第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子,26,1 愈伤组织形态 发生方式,愈伤组织器官发生,通过体细胞胚胎/胚状体途径再生植株,第二节 愈伤组织中的形态发生,27,2 愈伤组织器官发生,先不定芽，在茎基部长根 先长根 后长芽 在不同部位分别形成根和芽,28,29,影响愈伤组织器官发生的因素：,植物激素的作用 外植体自身因素,30,（1）外植体自身因素（内因）,母体植株的遗传基础 被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物成功报道最多； 无性繁殖植物比有性繁殖植物的容易； 同种植物不同品种（基因型）的培养效果不同,31, 外植体的类型 影响培养的难易：一般生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞容易培养。,32,例：百合：鳞茎的鳞片分化能力：外层中层内层,33,34,高：有利于根的形成和愈伤组织的形成； 适中：有利于根芽的分化； 低：有利于芽的形成,生长素 细胞分裂素,适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。,（2）植物激素的作用（外因）,35,芦荟的植物组织培养过程,1 2 3 4 5,6 7 8 9,10 11,36,芽（单芽、丛芽）,37,1 愈伤组织形态 发生方式,愈伤组织器官发生,通过体细胞胚胎/胚状体途径再生植株,第二节 愈伤组织中的形态发生,38,3.1 胚状体/体细胞胚（embryoid） ：指植物细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚一样的细胞群。 经过：球形胚心形胚鱼雷形胚成熟胚,3 体细胞胚发生途径,39,Development of the Arabidopsis Embryo,40,石龙芮胚状体发生的过程,41,香蕉心形体细胞胚,玫瑰心形体细胞胚,42,43,3.2 体细胞胚的产生方式,1）直接在器官上发生 2） 悬浮培养细胞发生途径 3）愈伤组织发生途径 : 幼胚、胚和子叶 4）单细胞发生途径：花药培养中的小孢子发育成 4）原生质体发生途径,胚性愈伤组织,44,1）生长素 2）其他植物生长物质的作用 3）氨源形态的影响 4）其他培养条件对胚状体发生的影响,3.3 体细胞胚状体诱导的影响因素,45,3.4 体细胞胚状体诱导的影响因素,1）生长素 形成体细胞胚的关键是除去或降低培养基中的生长素成分（如2,4-D）。 愈伤组织在生长素0.51mg/L的培养基上分化形成分生细胞团（称胚性细胞团）； 转移到生长素含量很低或没有生长素的培养基上，就能发育为胚状体。,46,原因：2,4-D等生长素可以诱导内源乙烯（Eth）产生；内源Eth不影响愈伤增殖，但抑制愈伤组织进一步分化成胚。 乙烯也会导致纤维素酶或（和）果胶酶活性的增强，从而破坏胚性细胞团，使原胚不能发生组织分化。,47,2）其他植物生长物质的作用 细胞分裂素有利于胚状体的形成 0.1gL-1 玉米素促进胡萝卜体细胞胚发生。 GA3、ABA抑制成胚；,48,3）氨源形态的影响 还原N（NH4+） 氧化N（NO3-） 有机氮 （氨基酸、水解酪蛋白等） 野生胡萝卜叶柄节段的培养中，只有在含一定数量还原态氮的培养基时，才能有胚胎发生， 用NH4+ 和水解酪蛋白优于NO3- 或谷氨酰胺。,49,4）其他培养条件对胚状体发生的影响 液体培养 适宜pH5-6 光照：不需要光或半天光照时间 温度25 左右,50,光照强度50-60 E m2 s-1,光照强度5-10 E m2 s-1,(图 光对大豆不同品种子叶体细胞胚发生的影响 ),51,3.4 体细胞胚途径再生植物的优点,1）数量比不定芽多 2）获得速度快 3）结构完整 4）胚状体可制成人工种子，便于运输和保存； 5）胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。,52,第五章 愈伤组织的培养,第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子,53,人工种子是指外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。 胚状体或芽：有生命的物质结构。 人工胚乳：供胚状体维持生命力。 人工种皮：保护作用。,1 定义与结构,第三节 人工种子,54,1）结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作； 2）不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生产；,人工种子的优点:,3) 有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料； 4) 加入抗生素、农药、菌肥等成分，提高人工种子活力和品质； 5) 由无性繁殖体系产生胚， 固定杂种优势。,55,2 制作,人工种子制作过程,胚状体,人工胚乳,其他物质,人工种皮,包埋技术,56,第一步胚状体诱导,1）选取目标植物 2）诱导愈伤组织 3）愈伤组织增生 4）胚状体诱导,57,胚状体同步增殖：,DNA合成抑制剂 低温处理 调节渗透压 分离过筛 调节植物激素配比,58,第二步人工胚乳制作,人工胚乳的成分 无机盐混合物 碳水化合物：淀粉和糖 蛋白质 各种附加成分：如固氮细菌、杀虫剂、杀菌剂、除草剂和植物激素等,59,第三步 人工种皮制作,1）包埋介质的选择： 无毒、透气、保水性好 有足够硬度（不胀大），保证安全（不泄露营养物） 包埋材料： 琼脂、琼脂糖、藻酸盐、明胶、淀粉、动物胶、角叉胶、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、果胶、蛋白胶、黄芪胶等种类。,60,2）包埋技术 用褐藻酸钠等水溶性凝胶经与Ca2+进行离子交换后凝固，用于包埋单个胚状体。,61,62,63,贮藏与发芽 一般将人工种子贮藏在4-7低温、相对湿度小于67%的条件下。实际上，随贮藏时间的延长，人工种子的萌发率会显著下降。,64,现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡胶等几十种植物的人工种子试种成功，但由于成本较高，中国尚未应用于生产。,黄连,65,人工种子取得了很大的进展，但至今仍有一些问题没有解决： 人工种皮尚不尽如人意，贮藏困难 生产成本高 流程复杂,4 局限性：,66,第五章 愈伤组织的培养,第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子,67,1.名词解释：愈伤组织 胚状体,2.愈伤组织培养对外植体有何要求？,3.愈伤组织形态发生有哪些情况？,思考题,68,器官培养（Organ culture ） ： 主要指植物根、叶、茎、花、果实等器官在离体条件下，在无菌的人工环境种做进一步培养发育，最终长成幼苗的过程。 特点：能保持它们所具有的特征性结构，通过器官培养可快速大量地繁殖。,第六章 营养器官培养,69,第六章 营养器官培养,第一节 根的培养 第二节 茎的培养 第三节 叶的培养,70,