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多聚酶链式反应扩增DNA片段教学目标（一）知识与技能1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用（二）过程与方法在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件（三）情感、态度与价值观通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神教学重难点教 学重点：PC R的原理和PCR的基本操作教学难点：PCR的原理教学工具多媒体教学过程（一）引入新课在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术PCR技术。（二）进行新课241基础知识WPCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：t11细胞内DNA复制条件分析：c12细胞内DNA复制过程H（1）DNA的反向平行结构：（结合投影图）y核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）h由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。ZDNA双螺旋结构的反向平行结构：A（2）DNA的复制过程:0解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。i引物结合：在DNA单链3端与DNA反向配对结合，确保引物3端与DNA单链准确配对。GDNA聚合酶结合：y子链合成：DNA聚合酶从引物3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。X后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）9子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“53合成”。Y感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。F思考DNA分子能准确复制的原因有哪些？fDNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。7思考细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。n13DNA分子复制的人工控制7解开螺旋：在80100时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。H恢复螺旋：在50左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。w复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。=反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。=思考缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）14PCR的反应过程 变性：在95时DNA解旋复性：在50时引物与DNA单链结合延伸：在72时合成DNA子链（两个引物间的序列）2实验操作21 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水22 实验操作步骤23 按照PCR反应体系配方配制反应液；（2）将PCR反应体系50L用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；（3）将微量离心管放到PCR仪中；（4）设置PCR仪的工作参数。（5）DNA在PCR仪中大量扩增。24 水浴法：将微型离心管依次在95、55、72的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3实验注意事项31避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。32缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。33每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。863600334混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。4结果分析与评价41反应液稀释：取2uLPCR反应液，添加98uL蒸馏水；2分光光度计调零：将100uL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。42将100uL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。43计算：DNA含量50光吸收值稀释倍数课后小结课后习题1DNA分子复制时，解旋的两条链中（ ）A仅一条作为复制模板 B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（ ）互补碱基对之间氢键断裂互补碱基对之间形成氢键DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对子链与母链盘旋成双螺旋状结构A B C D3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（ ）8636003DNA复制RNA复制转录翻译逆转录A B C D4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（ ）酶游离的脱氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA适宜的温度适宜的酸碱度A B C D5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（ ）A 2 B 4 C 8 D 16，答案： CDADA
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