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第三章高效液相色谱分析（HPLC）3.1高效液相色谱的特点一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。高效液相色谱是20世纪70年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离技术。（液相色谱+气相色谱理论+高压泵、高效固定相+高灵敏检测器）。二、特点1.高压:可达150350105Pa2.高速:例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20多小时，用HPLC只需1小时.3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米）4.高灵敏度：紫外检测器10-9g；荧光检测器10-11g,三、应用范围,气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70-80%。因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，不受试样挥发性的限制。,3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素与GC比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致；主要区别：流动相不同.液相色谱中对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素：一、柱内展宽1.涡流扩散项：He=2dp:填充不均匀因子；dp填充粒度直径高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱，填充很均匀，变得很小，所以He值比较小。,2.纵向扩散项65/-1：Hd=CdDm/u；当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时，由于分子本身运动所引起的纵向扩散同样引致色谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数Dm比在气体中小4-5个数量级，在LC中可忽略,GC中重要。,3、传质阻力项,组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡，从而引起峰扩展。（1）固定相传质阻力项（主要发生在液液分配色谱中）当流动相中的试样分子扩散进入到涂渍在载体表面的固定液内进行质量交换时，由于渗入固定液膜的深度不同，其返回到流动相中的时间也不同，因而引起峰扩展。,采取措施：1）液-液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。2）采用扩散系数大的液相固定相。3）减小流动相的流速，改善传质。,（2）流动相传质阻力项(二种形式:在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质)i.流动的流动相中的传质阻力项Hm当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，移动速度不一样从而引起峰形变宽。,ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。,由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：H=A+B/u+Cu由于B/u这一项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项，高效液相色谱的方程可写成：H=A+Cu提高柱效的方法：（1）减小固定相的颗直径，可明显提高柱效；（2）降低流动相粘度或提高柱温，可增大Dm；（3）在一定范围内减小流速，有利于于减小H；（4）提高装柱技术，提高柱内填充料的均匀性而减小A项。,1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m,5m目前应用最广泛）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，约1ml/min3.柱温的选择：选室温25左右,HPLC法中分离条件的选择,HPLC与GC的H-u曲线见图3-1：（1）两者曲线形状相似，都有一个H最小值；（2）HPLC的H最小值比GC的最小值小一个数量级以上，柱效更高；（3）HPLC的最佳流速u比GC的最佳流速u也小一个数量级以上。,二、柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展.a.柱前展宽：主要由进样所引起；进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或注入进样器的液流中。由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引起色谱峰不对称和展宽。解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心12mm处。b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起.解决：连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小.,3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型：液-液色谱；液-固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱,一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱1.特点：a.流动相和固定相都是液体b.两相应互不相溶，有明显的分界面2.分离机制：试样组分溶于流动相后,在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，溶质在两相间进行分配。K=cs/cm=kVm/Vs分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大.而且流动相的种类对分配系数有较大的影响.,3.解决固定液流失问题方法：1)采用正或反相色谱a.正相液-液色谱法：流动相的极性小于固定液的极性（流疏固亲；适用于分离极性物质）b.反相液-液色谱法：流动相的极性大于固定液的极性（流亲固疏；适用于分离非极性物质）2)采用化学键合固定相化学键合固定相：将固定相上的各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，形成化学键合固定相.目前反相键合相色谱法，已成为高效液相色谱中应用最广泛的一个分支。,二.液-固色谱法（或液-固吸附色谱法）1.特点：流动相为液体，固定相为吸附剂。2.分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离。吸附作用大即分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大,出峰晚，后出来.3.作用：a.适用分离相对分子质量中等油性试样。b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象.,三、离子对色谱法1.特点：离子对色谱法对各种强极性的有机酸或有机碱的分离，分离效能高，分析速度快，操作简便.2.分离机制：将一种或多种与溶质电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。X+水相+Y水相X+Y有机相试样离子X进入柱内以后，与对离子Y生成疏水性离子对XY，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。,3.离子对色谱法分类正相离子对色谱法(极性固定相，非常性流动相）反相离子对色谱法（非极性固定相，极性流动相v如含有对离子Y的甲醇水（或乙腈水）溶液）。,可见保留值随KXY和Y-水相的增大而增大。,4.应用：解决了以往难分离混合物的分离问题.如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱及药物的分离了。还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收或发荧光的基团，提高检测的灵敏度。,四.离子交换色谱法1.分离机制70/2；离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。,3.a.分配系数D愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。b.亲合力高的，在柱中保留值就愈大.4.应用：a.凡在溶剂中能够解离的物质。b.已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等.,五、离子色谱法1.构成：固定相:离子交换树脂流动相:电解质溶液检测器:电导检测器主配件：抑制柱（抑制流动相中强电解质背景离子的干扰）。2.流程图：fig3-2,双柱型原理：离子交换原理(以分离阴离子为例）。1)分离柱：离子交换(阴离子交换剂）ROH+Na+Br-(待测)RBr-+Na+OH-（交换）RBr-+Na+OH(洗脱剂)ROH-+Na+Br-（洗脱）2)抑制柱:消除本底电导影响（阳离子交换剂）RH+Na+OH-(流动相)RNa+H2ORH+Na+Br-(流动相)RNa+H+Br-洗脱液(NaOH)转化为低电导的水，消除本底电导影响；待测离子(Br-)转化为具有更大淌度的酸(HBr)，提高检测灵敏度。,a.双柱型：化学抑制型离子色谱法（高电导洗脱液：阳离子用无机酸如HCl,阴离子用NaOH)；b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液(阴离子用苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐等稀溶液，阳离子用稀硝酸、乙二胺硝酸盐稀溶液，不用抑制柱）；3.应用：离子色谱法是目前唯一快速、灵敏和准确的多组分分析的方法因而得到广泛重视和迅速发展。从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.,六、空间排阻色谱法1.固定相：凝胶2.机制73/-9：类似于分子筛作用，分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和分子大小有关.排阻法是建立在分子大小的基础上的。组分中太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，先出峰；组分中太小的分子可以进入所有胶体微孔中，最后出峰。洗脱次序将取决于相对分子质量的大小，相对分子质量大的先洗脱，相对分子质量小的后洗脱。分子的形状也对保留有重要的作用。,3.分离示意图，fig3-3a.排斥极限A点74/2;3:b.全渗透极限B点74/2;6:相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将按相对分子质量降低的次序被洗脱而可以分离.4.特点75/2;3:1）试样色谱峰全部在溶剂的保留时间前出峰。2）用于分离相对分子质量大的化合物（约为2000以上）；3）只能分离相对分子质量差别在10%以上的分子。,3.4液相色谱法固定相色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键.一、液-液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相1.全多孔型担体：直径小于10m,由nm级的硅胶微粒堆聚而成为5m直径的全多孔型担体。颗粒小，柱效高。2.表层多孔型担体：直径为3040m的实心核(玻璃微珠)，表层上附有一层厚度约为12m的多孔硅胶，填柱容易，重现性好，但试样容量低。目前510m直径是使用最广泛的高效填料。3.化学键合固定相（P76及P69）定义：用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面.,化学键合固定相,根据在硅胶表面的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型（Si-O-C)；硅氧硅碳键型（Si-O-Si-C);硅碳键型（Si-C)；硅氮键型（Si-N)。硅烷化反应：,化学键合固定相的特点：,（1）表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；（2）无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；（3）可以键合不同的官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；（4）有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。分离机制77/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是按键合量的多少而各有侧重.,二、液-固吸附色谱法固定相目前较常用5-10m的硅胶微粒（全多孔型）.三、离子交换色谱法固定相1.薄膜型离子交换树脂，以薄壳玻珠为担体，表面涂1%离子交换树脂.2.离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。a.键合薄壳型：担体，薄壳玻珠；b.键合微粒担体型：担体，微粒硅胶.四、排阻色谱法固定相a.软质凝胶：葡萄糖凝胶；琼脂糖凝胶；(水流动相,常压)b.半硬质凝胶：交联聚苯乙烯凝胶；(有机溶剂，较高压)c.硬质凝胶：多孔硅胶；多孔玻珠；(高速),3.5液相色谱法流动相1.重要性：GC载气仅三四种，要提高柱效选择性，主要是改变固定相的性质；LC则不同，当固定相选定时，流动相的种类，配比能显著地影响分离效果，因此流动相的选择很重要。2.选择流动相应注意的因素79/2：5点，,选择流动相的注意因素：（1）流动相的纯度：一般是采用分析纯试剂，必要时需进一步纯化，以除去干扰的杂质。（2）应避免使用会引起柱效损失或保留值特性变化的溶剂。（固定相不能吸附溶剂或与流动相互溶。）（3）对试样要有适宜的溶解度，否则会在柱头易产生沉淀。（4）溶剂的粘度小些为好，否则会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。（5）应柱检测器相匹配（溶剂不能被相应的检测器检测出来）,3.溶剂的选择79/-3：a.依据：溶剂的极性是重要依据。b.溶剂极性顺序，水最大，煤油最小。c.采用多元组合溶剂系统作为流动相（底液和洗脱液）（底剂决定基本的色谱分离情况；洗脱剂则调节试样组分的滞留并对几个具有选择性的分离作用）d.根据不同的方法选择合适的底液和洗脱液,选用溶剂的依据：溶剂的极性。,正相色谱：底剂（弱极性）洗脱剂（极性较强）反相色谱：水（主体）有机溶剂调节剂。离子交换色谱：组分保留值通过流动相的离子强度（盐的浓度）和pH来控制。增加盐的浓度，保留值降低；阳离子交换柱流动相pH增加，保留值增加，阴离子交换柱相反。排阻色谱：所用的溶剂必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。,3-6高效液相色谱仪highperformanceliquidchromatograph,液相色谱仪（2）,液相色谱仪（3）,液相色谱仪（4）,3.6高效液相色谱仪一、概述80/1：高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。二、结构示意图，fig3-4.三、部件介绍1.高压泵（压力150350105Pa）要求：a.流量要稳定；80/-1b.压力平稳无脉动；81/2.c.对流速要有一定的可调范围.81/4.,动画,类型：a.往复式柱塞泵是目前广泛使用的恒流泵.机理特点81/-2;6:1)不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相；2）可方便地通过改变柱塞冲程的大小或往复的频率来调节流量；3）由于死体积小（约0.1mL），更换溶剂方便，很适用于梯度洗提.不足：1）输出有脉冲波动，会干扰检测器正常工作；2）由于产生基线噪声而影响检测的灵敏度.,b.气动放大泵恒压泵原理：p1SA=p2SB其工作原理:这是一种恒压泵。特点82/-6:1）能供给无脉冲的稳定流量的输出.2）液缸体积大，更换流动相不方便；3）不便于梯度洗提.4）适合匀浆法填装色谱柱。,2.梯度洗提（梯度洗脱、梯度淋洗）装置82/a.作用：与GC中的程序升温一样.（P22、23）b.定义83/1：所谓梯度洗提，就是载液中含有两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。应用梯度洗提还可以使分离时间缩短，分辨能力增加，还可提高最小检测量和定量分析的精度。外梯度（低压梯度）：先混合后输入色谱柱；内梯度（高压梯度）：先泵入梯度混合室再入色谱柱；,3.进样装置a.重要性83/1：进样方式及试样体积对柱效有很大影响.要获得良好的分离效果和重现性，需要将试样“浓缩”地瞬间注入色谱柱入担体的中心成一个点。b.进样方式1）注射器进样装置：由于不能承受高压，所以需用停流进样方法，但该方式无法取得精确的保留时间，峰形的重现性亦较差.,2）高压定量进样阀通过进样阀（通常是六通阀）直接向压力系统内进样而不必停止流动相的一种装置（fig3-7）a.进样准备：1和6，2和3连通，试样由5、4注入定量管；b.进样：阀芯顺时针旋转600，这时1和2，3和4，5和6连通，试样送入柱中.特点：进样准确，重现性好，适于定量分析.,4.色谱柱a.参数：id，4.6或3.9mm；L=15-30cm；填料颗粒度，5-10m；n=5000-10000b.发展趋势1）减小填料粒度，3-5m；2）减小柱内径，1mm；c.装填方式1）干法，填料粒度大于20m；2）湿法（匀浆法），粒度小于20m；(生成匀浆，高压装柱）,5.检测器要求84/-1：具有灵敏度高、重现性好、响应快、现性范围宽、适用范围广、对流动相和温度波动不敏感、死体积小等特点.a.紫外光度检测器85/11）原理，被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度关系遵守比尔定律2）光路图，图3-8；3）特点85/3；a.具有很高灵敏度；b.对温度和流速不敏感，可用于梯度洗提.缺点：不适用于对紫外光不吸收的试样.4）发展85-1；光电二极管211/1024个阵列检测器.,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：211/1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,b.荧光检测器86/1）原理：许多物质，特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光，某些不发射荧光的物质亦可通过化学衍生转变成能发出荧光的物质而得到检测。2）光路图：图3-11；3）特点：荧光检测器比紫外光度检测器的灵敏度要高2个数量级。但线性范围仅103，利用可调谐的激光作光源（激光诱导荧光）可使检测灵敏度和准确度都得到提高。,荧光检测器（fluorescencedetector）,高灵敏度、高选择性应用：对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应,c.差示折光检测器通用型87/1）原理：借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差，表示试样在流动相中的浓度。2）类型：偏转式；反射式3）定量方法：偏转式是利用测量折射角偏转值的大小来测定试样的浓度。4）特点88/-1：几乎每种物质都有各自不同的折射率，因此都可用差示折光检测器来检测，如同GC中热导池一样，它是一种通用型的浓度检测器。5）不足89/1：a.对温度变化敏感；b.不能梯度洗提.,d.电导检测器89/1）特点：是离子色谱法中使用最广泛的检测器.不足：电导检测器的响应受温度的影响较大，因此要求严格控制温度.2）原理：利用物质电离后产生的电导变化来测定电离物质含量.（参P72）3）类型：a.两电极电导检测器用于低电导背景的抑制型离子色谱.b.五电极式电导检测器90/用于单柱型离子色谱，它有效地消除了极化和电解效应的影响，在高背景电导下仍能获得极低的噪声水平，适用于单柱型离子色谱系统。,（5）蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团。蒸发光散射检测器灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联用。蒸发光散射检测器已被广泛应用于碳水化合物、类脂、脂肪酸和氨基酸、药物以及聚合物等的检测。,工作原理雾化：液体流动相在载气压力的作用下在雾化室内转变成细小的液滴，从而使溶剂更易于蒸发。液滴的大小和均匀性是保证检测器的灵敏度和重复性的重要因素。蒸发：载气把液滴从雾化室运送到漂移管进行蒸发。在漂移管中，溶剂被除去，留下微粒或纯溶质的小滴。检测：光源采用650nm激光，溶质颗粒从漂移管出来后进入光检测池，并穿过激光光束。被溶质颗粒散射的光通过光电倍增管进行收集。电信号的强弱取决于散射室中溶质颗粒大小与数量。,Step1.Eluentisnebulizedandsmalldropletsareselectedtominimizebackgroundnoise.,Step2.Smalldropletsareevaporatedatlowtemperaturestoavoidlossofcompounds.,Step3.Thesoluteparticlesarefocussed,usinggas-supportedfocusing(GSF)forenhancedsignal-to-noiseratiosandlessmaintenance,anddetectthelightscattering,Step1:Nebulization,ColumneffluentpassesthroughnebulizerneedleMixeswithnitrogengasFormsdispersionofdroplets,Step2:MobilePhaseEvaporationDropletspassthroughaheatedzoneMobilephaseevaporatesfromthesampleparticleDriedsampleparticlesremain,Step3:DetectionSampleparticlespassthroughanopticalcellSampleparticlesinterruptlaserbeamandscatterlightPhotodiodedetectsthescatteredlight,3.7高效液相色谱分离类型的选择90/1.应考虑的因素：a.试样的性质:分子质量,化学结构极性,溶解度参数；b.色谱分离类型的特点及应用范围；c.实验室条件：仪器、色谱柱等.2.应用范围a.以分子量划分1）低分子量，挥发性高的试样用GC；2）分子量2002000的试样标准LC；3）分子量大于2000空间排阻色谱法；b.以试样在溶剂中溶解情况划分3.汇总（table33）,色谱分离方法的选择:表3-3,3.8高效液相色谱法应用实例HPLC更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、生理活性以及相对分子质量较大的物质；因而已应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、生物大分子、表面活性剂、抗氧剂、杀虫剂、除莠剂等分析中；在化工、环保、临床药物等领域广泛应用；目前在生命科学中又显示出其突出地位.具体认真观察、分析P9197各图.,3.9液相制备色谱97/1.作用：制备色谱是以色谱技术来分离、制备较大量纯组分的有效方法。2.实现液相制备色谱主要问题：a.色谱柱的柱容量b.液相制备色谱方法c.液相制备色谱仪,3.10毛细管电泳1.定义：在外加电场的影响下，带电的胶体粒子或离子在分散介质中作定向移动的现象称为电泳。2.分类：a.毛细管区带电泳；b.毛细管凝胶电泳；c.胶束电动力学毛细管色谱；d.毛细管等电聚焦；e.毛细管等速电泳；f.毛细管电渗色谱.本章作业：思考3,5，6,8题.,本章学习结束.,第三章思考题解答,1.从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。,解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联用。二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。,2.液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些?与气相色谱相比较,有哪些主要不同之处?,解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。,3.在液相色谱中,提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么?,解:液相色谱中提高柱效的途径主要有:1.提高柱内填料装填的均匀性;2.改进固定相减小粒度;选择薄壳形担体;选用低粘度的流动相;适当提高柱温其中,减小粒度是最有效的途径.,4.液相色谱有几种类型?它们的保留机理是什么?在这些类型的应用中,最适宜分离的物质是什么?,解:液相色谱有以下几种类型:液-液分配色谱;液-固吸附色谱;化学键合色谱;离子交换色谱;离子对色谱;空间排阻色谱等.,液-固吸附色谱是通过组分在两相间的多次吸附与解吸平衡实现分离的.最适宜分离的物质为中等相对分子质量的油溶性试样，凡是能够用薄层色谱分离的物质均可用此法分离。,其中;液-液分配色谱的保留机理是通过组分在固定相和流动相间的多次分配进行分离的。可以分离各种无机、有机化合物。,化学键合色谱中由于键合基团不能全部覆盖具有吸附能力的载体,所以同时遵循吸附和分配的机理,最适宜分离的物质为与液-液色谱相同。,离子交换色谱和离子色谱是通过组分与固定相间亲合力差别而实现分离的.各种离子及在溶液中能够离解的物质均可实现分离，包括无机化合物、有机物及生物分子，如氨基酸、核酸及蛋白质等。,在离子对色谱色谱中,样品组分进入色谱柱后,组分的离子与对离子相互作用生成中性化合物,从而被固定相分配或吸附进而实现分离的.各种有机酸碱特别是核酸、核苷、生物碱等的分离是离子对色谱的特点。,空间排阻色谱是利用凝胶固定相的孔径与被分离组分分子间的相对大小关系,而分离、分析的方法。最适宜分离的物质是：另外尚有手性色谱、胶束色谱、环糊精色谱及亲合色谱等机理。,5.在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？,解：采用正相及反相色谱是为了降低固定液在流动相中的溶解度从而避免固定液的流失。,6.何谓化学键合固定相?它有什么突出的优点?,解:利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面形成的固定相称为化学键合固定相.优点:固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的多.无固定相流失,增加了色谱柱的稳定性及寿命.可以键合不同的官能团,能灵活地改变选择性,可应用与多种色谱类型及样品的分析.有利于梯度洗提,也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集.,7.何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱?试述它们的基本原理.,解:在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制型离子色谱法.,但是如果选用低电导的流动相（如10-510-4M的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐），则由于背景电导较低，不干扰样品的检测，这时候不必加抑制柱，只使用分析柱，称为非抑制型离子色谱法,例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相，钠离子的干扰非常严重，这时可在分析柱后加一根抑制柱，其中装填高容量H+型阳离子交换树脂，通过离子交换，使NaOH转化为电导值很小的H2O，从而消除了背景电导的影响,何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？,解：在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提是改进液相色谱分离的重要手段梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段,高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？,解：在液相色谱中为了承受高压，常常采用停流进样与高压定量进样阀进样的方式,10以液相色谱进行制备有什么优点？,解：以液相色谱进行制备时，分离条件温和，分离检测中不会导致试样被破坏，切易于回收原物,11.在毛细管中实现电泳分离有什么优点？,解：毛细管由于散热效率很高，可以减少因焦耳热效应造成的区带展宽，因而可以采用较高的电压，克服了传统电泳技术的局限，极大地提高分离效率，而且分离时间缩短，试样分析范围宽，检测限低对于大分子的分离往往比色谱方法具有更高的柱效,12.试述CZE,CGE,MECC的基本原理,毛细管区带电泳（CZE)是在指外加电场的作用下，溶质在毛细管内的背景电解质溶液中以一定速度迁移而形成一个一个独立的溶质带的电泳模式，其分离基础是淌度的差别因为中性物质的淌度差为零，所以不能分离中性物质。带电粒子的迁移速度为电泳速度与电渗流的矢量和在缓冲溶液中带正电的粒子由于迁移方向与电渗流相同，流动速度最快，最先流出，负电荷粒子的运动方向与电渗流相反，最后流出，中性粒子的电泳速度与电渗流相同，因而迁移速度介于二者之间这样各种粒子因差速迁移而达到区带分离，这就是CZE的分离原理,毛细管凝胶电泳(CGE)是毛细管内填充凝胶或其他筛分介质，如交联或非交联的聚丙烯酰胺。荷质比相等，但分子的大小不同的分子，在电场力的推动下在凝胶聚合物构成的网状介质中电泳，其运动受到网状结构的阻碍。大小不同的分子经过网状结构时受到的阻力不同，大分子受到的阻力大，在毛细管中迁移的速度慢；小分子受到的阻力小，在毛细管中迁移的速度快，从而使它们得以分离。这就是CGE的分离原理,胶束电动色谱(MECC)是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术与色谱技术的结合。多数MECC在毛细管中完成，故又称为胶束电动毛细管色谱。MECC是在电泳缓冲液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基因聚集在一起形成胶束(假固定相)，溶质不仅可以由于淌度差异而分离，同时又可基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离，这样一般毛细管电泳中不能分离的中性化合物在MECC中可以分离,
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