《单底物酶促反应》PPT课件.ppt

第四章单底物酶促反应动力学,酶动力学是研究酶促反应的速度问题，即研究各种因素对酶促反应速度的影响。酶动力学理论与实验在生物化学领域，特别在酶学研究中，有十分重要的作用。例如，根据某些因素对酶促反应速度的影响，可推断该酶促反应的机制。又例如，要准确测定酶活力单位，就需要对最佳反应条件及各种因素的影响进行研究。酶促反应有单底物反应和多底物反应之分。单底物酶促反应包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反应。,第一节动力学方程推导,酶反应的基本动力学关系，是指酶反应速度与酶和底物间的动力学关系。因为酶和底物是构成酶反应系统最基本的因素，它们决定酶反应的基本性质、酶反应的速度规律，而其他各种因素也正是通过它们产生影响的；而且，这种动力学关系是整个酶反应动力学的基础。描写这种基本动力学关系的是米氏方程(Michaelis-Mentenequation)。,v=vmaxS/(Km+S),酶促反应速度的测定与酶的活力单位,1、测定酶促反应的速度必需测初速度2、酶活力,3、酶活力的表示方法4、酶活力测定方法：终点法动力学法,检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。,酶活力测定方法,终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。,酶活力的表示方法,活力单位（activeunit）习惯单位（U）:底物(或产物)变化量/单位时间国际单位（IU）:1moL变化量/分钟Katal（Kat）：1moL变化量/秒,转换系数（Kcat）底物（moL）/秒每个酶分子,比活力（specificactivity）,各种因素对酶反应速度的影响,2、底物浓度3、pH（最适pH的概念）4、温度（最适温度的概念）5、激活剂6、抑制剂,1、酶浓度,当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=kE,底物浓度对酶反应速度的影响,酶反应速度与底物浓度的关系曲线（MichaelisMenten曲线）米氏方程的提出及推导米氏常数的意义米氏常数的测定,单分子酶促反应的米氏方程及Km,推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想进行推导。,米氏方程:,米氏常数:,酶反应速度与底物浓度的关系曲线,米氏方程的推导,令：,将（4）代入（3），则：,ES生成速度：,，ES分解速度：,即：,则：,由于酶促反应速度由ES决定，即,将（2）代入（1）得：,(3),当酶反应体系处于恒态时：,当Et=ES时，,第二节米氏方程的讨论,一、米氏方程的特性二、米氏方程中v和S的关系当vVmax时，v与S无关，只和E0成正比，这时表明酶的活性部分已全部被底物占据。当v0.5Vmax时，表示活性部位有一半被占据。当一个酶的Km已知，则任何底物浓度下酶活性部位被占据的分数：,称为该酶促反应的相对速度。,米氏方程所作曲线的曲度，不随Km和Vmax的变化而变化。所以任何酶只要服从米氏方程。则到达任何两个Vmax分数的对应底物浓度之比为一常数。例如：,S0.9=9Km，同理S0.1=1/9Km，所以：S0.9/S0.19Km/1/9Km81，即达90Vmax与达10Vmax所需底物浓度之比总是81。同样也可得到达70Vmax与达10Vmax所需底物浓度之比总是21。在酶促反应初速度区即在一级速度区，由于SKm，v=VmaxS/Km=kS。从这个方程可知，一级速度常数k=Vmax/Km。,k的物理意义：底物在单位时间转变成产物的量。例如k=0.02min-1，就意味着底物在一分钟内会有2转变成产物；若k2.3min-10.0383sec-1，那就意味着每秒钟有3.83的底物变成产物。要测定任一时间范围内底物的消耗量或产物的生成量，可用一级速度方程积分。得：,lgS=-kt/2.3+lgSt,第三节实验数据的处理分析酶促反应速度的作图法,一、Lineweaver-Burk法(双倒数作图法),将实验所得的一些初速度数据v和S取倒数，得各种1/v和1/S，将1/v对1/S作图，得一直线。该直线纵截距1/Vmax，斜率Km/Vmax，横截距-1/Km。应用双倒数作图法处理实验数据求Km和Vmax等动力学常数比较方便，也是最广泛应用的一种方法，但欲要获得较准确的结果，实验时必须注意底物浓度范围，一般所选底物浓度需在Km附近。,1.下图是根据S在0.332.0Km范围时的实验结果而作的双倒数图，从此图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。,S在0.332.0Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。,2.如果所选底物浓度比Km大得多，则所得双倒数图的直线基本上是水平的。这种情况虽可测得1/Vmax，但由于直线斜率近乎零，-1/Km则难以测得。,S在3.320Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。,3.如果S比Km小得多，则所作双倒数图的直线与两轴的交点都接近原点，使-1/Km和1/Vmax，都难以测准。,S在0.0330.2Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。,二、其它线性作图法1.Hanes-Woolf作图法即把米氏方程重排成线性方程,2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法将米氏方程重排为线性方程：,3.Eadie-Scatchard作图法将米氏方程重排为线性方程,以上三种作图法也应注意选择底物浓度，不要使S比Km高得多或低得多。上述几种线性作图法各有其优缺点。双倒数作图法应用最广泛。但此法有两个缺点：第一，在vS图上，由相等增值而给出的等距离各点，在双倒数图上变成非等距离的点，且多数点集中在1/v轴附近，而远离1/v轴的地方只有少数几个点，恰好这些点又正是主观目测以确定直线最权重的那些点。第二，在测定v时产生的小误差，当取倒数时会放大。在低底物浓度下更为敏感，因在高1/S值所得的一两个不准确的点，会给图的斜率带来显著误差。第一个缺点可通过选择适当的S，使1/S为等距离增值而得到克服。对第二个缺点关键要注意在低底物浓度下使所测初速度误差尽可能减小。,S/v对S作图，S未取倒数。另两个线性作图法，v未取倒数。前者对等距离S增值所测数据作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。,三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该法是把S值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在纵轴上，然后把相应的v和S连成直线，这样所得的一簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。,四、米氏方程的积分形式及其对数据的处理米氏方程是一个微分方程，其v=dP/dt或v=-dS/dt。根据从米氏方程重排得到的线性方程作图求Km和Vmax时，在实验过程中所取数据必须限于初速度阶段，即只能是小于5的St转变为P的阶段。但有些情况，例如，产物浓度过低难以测定；或产物根本不能直接测定，而必须测定底物浓度的降低来反映产物的量(即PSt-S)。若只限于5的底物发生反应就难以测准其降低的量。在这些情况下，如用积分速度方程处理，就不受这种限制。例如，在1090的St转变为P的数据均可使用。因为积分方程在反应全过程中都是准确的。最简单的积分方程是在假定无产物抑制(即KmsKmp)，并且Keq很大的情况下导出:,重排成各种线性形式，如,可直接测得Vmax/Km和Vmax，从而可算出Km，这样的处理方法，可从比Km大几倍的St(如St10Km)开始，将反应进行到S显著低于Km(如S=0.1Km)止。,五、Lee和Wilson改良双倒数方程对数据的处理改良的双倒数方程形式与双倒数方程相似，为,其中,是t这一段时间内的平均速度；,为反应过程中底物浓度的算术平均值。由于积分方程对任何反应程度的数据处理都是准确的,处理实验数据的准确性如何，,用,可以通过,与,对比：,从以上计算可以看出，用改良的双倒数方程作图法处理实验数据时，即使反应已进行到30，所引入的误差也不过1左右。很明显，如果所有酶是饱和的，而且反应显著不可逆，而且没有产物抑制的情况，用改良双倒数法处理实验数据来测定Km和Vmax，可获得准确结果。如有必要，可用捕获剂或偶联酶使产物不断移去，迫使反应不可逆，并使产物抑制成为最小。,第四节酶的分析和检测,一、酶促反应初速度随Et的变化酶促反应的初速度随Et的变化而变化。通常在离体测定条件下，Et一般为10-1210-7mol/L，而St为10-610-2mol/L。可将米氏方程转变为以下形式：,这样，当S为常数时，则初速度v与Et成正比。但一个酶促反应速度，常因S的改变而改变。因此反应时间必须尽可能短，使S几乎处于恒态(即只有5以下的底物形成产物)，才能得到真正的初速度，v与Et之间的关系才会是线性的。,二、酶活力单位和比活力是指酶在一定作用条件下，单位时间内，使底物转化的量或产物生成的量。也就是说，酶量的多少是采用其催化能力来度量；换句话说，是采用酶催化反应的速度来度量，因为在适当的条件下，vE。为了使酶单位的文献报道能统一，并具有可比性，国际酶学会议曾制订了一个标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1微摩尔底物所需的酶量为一个酶单位。所谓特定条件，温度定为25，pH、底物浓度等其它条件均定为最适条件。该酶单位称为国际单位IU)。酶制剂中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。酶的比活力(specificactivity)是指每毫克蛋白中所含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。,三、酶的转换数转换数可用两种方法表示。其一是以分子活性(molecularactivity)来定义，即在最适条件下、每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数(即每微摩尔酶的酶单位数)。其二是许多酶为寡聚体。含几个亚基，因此可用另一种方式来表示转换数，即在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中心每分钟所转变的底物摩尔数。这两个值有时简单以min-1表示，即：,酶的kp值约在50107min-1。碳酸酐酶是己知转换数最高的酶之一(36106min-1)。1/kp=1.7sec，即该酶一个催化周期为1.7微秒。,第五节酶促反应的稳态前动力学,一、快反应技术酶促反应动力学研究有两条途径：一是稳态动力学。它是监测整个反应，得到关于反应的笼统信息。二是稳态前动力学，它能更直接地研究整个反应中的基本步骤或部分反应，提供可用于分析复杂反应机制的更有效的数据，但需要特殊的仪器来测量快反应。所谓快反应，是相对于普通的混合和观察方法所需要的时间而言。完成总反应量的一半，即所谓反应半时间，为秒或更短时间，则属快反应。采用手工混合启动反应，用普通的分光光度计等仪器所能测量的反应半时间为分和小时。而酶促反应常常是反应半时间短于一秒的快反应，采用普通方法是不行的。限制仪器测定能力的主要因素有：混合样品并充满反应池所需的时间，观察和记录变化所需的,时间。快速反应动力学技术因此应运而生，并得到不断发展。目前，甚至已能测定反应半时间与分子振动和转动所需时间相当的反应。化学反应半时间不可能短于10-11秒，故可认为已没有哪个化学反应是快得无法测定的。流动法和弛豫法，是为研究溶液中快反应动力学而建立起来的方法。前者包括常流法、加速流动法、停流法和淬灭法；后者包括温度、压力、电磁场的跳变或周期性变化法等。由于这些方法采用与停流相似的液体处理系统和相同的快响应探测和数据采集系统，所以常在一台仪器上更换相应的附件实施上述多种测量，构成组合式仪器。,