资源描述
三重组DNA分子构建与筛选,一、粘末端DNA片段的连接,（一）具有相同粘末端的连接,（二）具有不同粘性末端的连接用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。,HindIII,二、平末端DNA片段的连接,（一）直接用T4连接酶连接,（二）同聚物加尾法,优点：接“尾”后的载体不能自身环化，提高了转化效率。缺点：可能改变目的基因或载体的阅读框，影响外源DNA表达外源DNA无法收回,（三）衔接物连接法,衔接物是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。,（四）DNA接头连接法接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端,（五）PCR引入酶切位点,防止载体自身环化的措施1、碱性磷酸酶脱磷酸基法2、双酶切法3、过量法：基因片段：载体（5:1or10:1),三、重组DNA连接注意事项,第三节基因转移,一、重组DNA导入大肠杆菌转化、电激法二、重组DNA导入植物细胞的方法载体介导、基因枪法三、重组DNA导入动物细胞的方法转染,一、重组DNA导入大肠杆菌,（一）转化,将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。,为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高，被称为感受态细胞。,1、转化过程E.coli：感受态细胞重组DNA分子加入LB扩增涂布选择性平板,2、DNA分子转化受体细胞过程吸收：DNA分子吸附于受体菌表面转入：双链DNA分子解链，单链DNA进入，另一条链降解自稳：进入细胞内的单链又复制成双链环状DNA表达：目的基因随载体同时被复制，转录，翻译,3、质粒DNA的大小及构型对转化效率的影响,（1）大小10Kb，转化效率很低（2）构型超螺旋环形线状,热激法（HeatShockMethod）,（三）电激法(electroperation),电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。,可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。,不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。,1.电转化流程,（1）电转化感受态细胞的制备,（2）电转化操作程序电击复苏涂布,（3）电击杯清洗,二、重组DNA导入植物细胞的方法,（一）载体介导的转化方法,1、共培养法(cocultivation),（1）原生质体共培养法,取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。,（2）叶盘共培养法,优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。,2、活体接种(inoculationinvivo),（1）基因枪法,80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。,该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。,基因枪所用材料：（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。,（2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。,（3）所用动力系统：火药爆炸力电弧放电高压气体,基因枪法的特点：（1）转化效率高。,（2）受体广泛。,（3）操作简单。,（2）微注射法（micro-injection）,微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头道进入。,显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。,常用的细胞固定方法有3种：一、琼脂糖包埋法二、多聚赖氨酸粘连法三、吸管支持法,（2）DEAE-葡萄糖转染技术,（3）电穿孔转染技术,（4）脂质体载体法,（5）细胞核的显微注射法,三、重组DNA导入动物细胞的方法,（1）磷酸钙转染技术,（6）活体电穿孔技术,（6）活体电穿孔技术,活体电穿孔法(invivoelectroporation)是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。,活体电穿孔法的特点：靶器官的选择面广对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB或十几KB的表达载体,到100200KB的YAC、BAC基因组,都有成功导入并获得表达的报道。活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。,活体电穿孔法在基因治疗方面的应用,脑瘤的治疗人单核细胞趋化物蛋白基因到大鼠脑瘤治疗机体的内分泌系统疾病骨骼肌导入促红细胞生成素基因,第四节重组DNA分子的筛选,外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：,（1）,（2）,（3）,转化,E.coli,一、重组体的筛选,遗传检测方法抗药性标记插入失活-半乳糖苷酶显色反应免疫化学方法放射性抗体检测核酸杂交方法转译筛选法,（一）遗传检测方法原理：根据载体DNA分子上的筛选标记赋予受体细胞在筛选平板上表型的变化。如抗药性引起生长与不长；颜色变化等。方法：插入失活抗生素平板筛选法（pBR322系统）由于外源DNA的插入引起抗药性失活插入失活,插入失活-环丝氨酸筛选法,四环素+环丝氨酸,氨苄青霉素,放射免疫筛选法1.放射免疫筛选过程A、制备抗原：培养菌落（噬菌斑）B、制备抗体：免疫动物C、抗原抗体反应D、检测：放射自显影E、选出重组体,2.放射免疫筛选法优点：可以选出无表型特征的克隆3.放射免疫筛选法缺点：必须是表达载体需要放射性物质同位素：污染昂贵,(三)核酸杂交方法,探针（probe）：用来探知被测物存在的小分子DNA或RNA。,标记物：探针上结合的易被检测的化合物。,分子杂交（molecularhybridization）：探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫分子杂交。,一、基本概念,二、核酸探针类型,双链DNA探针DNA探针核酸探针单链DNA探针RNA探针单链RNA探针放射性标记探针探针标记非放射性标记探针,核酸探针的类型和称谓常有以下几种：,非放射性标记原理,三、菌落原位杂交,菌落生长转移到NC膜上DNA释放和变性固定杂交洗膜放射自显影查找阳性克隆,四、斑点杂交（Dotblot）,模板制备点膜固定杂交洗膜放射自显影查找阳性克隆,四、斑点杂交（Dotblot）,五、转译筛选法,无细胞翻译系统,1、杂交阻断转译,要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA。,原理：,2、杂交释放转译,
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