PCR与DNA提取一般方法.ppt

PCR原理+流程,乌桕DNA提取方法国内外相关文章,PCR原理,聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：PolymeraseChainReaction）(又称：多聚酶链式反应），聚合酶链式反应，其英文PolymeraseChainReaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。,特点,具有特异性强灵敏度高操作简便省时等特点。,用途,可用于基因分离克隆和核酸序列分析等基础研究还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方,(1)扩增各种蛋白的基因：(2)PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列(3)用于分子进化和种系发育的研究，研究其分子进化及种系发育是很有用的4)分析和诊断遗传性疾病(5)对人类HLA基因的多肽性分析，对于某些基因突变，如肿瘤发生的研究等均很有用。,主要过程,PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成,模板DNA的变性,模板DNA经加热至92左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,模板DNA与引物的退火(复性),模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,引物的延伸,DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。,PCR扩增物,PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。,所需材料,1.试剂和溶液(1)10PCR缓冲液500mM氯化钾100mMTris-Cl(室温时pH8.3)15mM氯化镁(2)10mM脱氧三磷酸核苷(dNTPs)溶液含有所有四种dNTPs(pH8.0),3)耐热的DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有53DNA聚合酶和53外切酶活性，但是缺乏35外切酶活性。rTthDNA聚合酶是Thermusthermophilus(Tth)和Thermococcuslitoralis(Tli)两种菌中耐热DNA聚合酶的混合。这种混合酶特别具有53DNA聚合酶和35外切酶(校正)的双重活性。当按推荐量使用时，此酶可提高保真度及长链PCR的产量。,(4)琼脂糖凝胶(5)10M的上游和下游引物(6)DNA模板(7)对照DNA(含有靶序列的DNA)(8)DNA长度标准参照物,2.设备,(1)0.2mlPCR扩增管,(2)可预先设定扩增方案的温度循环器(PCR仪),实验操作,1、按以下次序，将各成分加入0.2ml灭菌扩增管中：成分体积终浓度10PCR缓冲液5l110mMdNTP溶液(pH8.0)1l每种0.2mM10M上游引物2.5l0.5M10M下游引物2.5l0.5M5单位/l耐热DNA聚合酶0.5l2.5单位DNA模板1-10l1pg-1g消毒的蒸馏水至50l,2将小管中的混合物混匀并加入50l矿物油或硅化油覆盖小管中的混合物。3盖紧小管，短暂离心，以使PCR混合物沉于管底。,4小管在温度循环器(PCR仪)中94C温育3分钟，以使模板DNA完全变性。,5.按以下方法进行25-35个循环的PCR扩增：变性94C30秒退火55C30秒延伸72C1分钟/1kb,672C温育PCR样本10分钟，可于4C维持。样本可贮存于-20C直至使用。7采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，溴化乙锭染色显影DNA，用合适分子量标准的DNA作参照。,电泳,PCR荧光定量,结果,植物DNA提取方法,1.CTAB法2.SDS法3.高盐法,乌桕DNA提取方法,1.CTAB法2.SDS法,CTAB法提取植物基因组DNA,这种方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。,一材料、试剂和仪器,1材料新鲜的组织材料或-80冻存的材料叶子和种子的胚乳为材料,2试剂,(1)2CTAB溶液CTAB(W/V)2%Tris-HCL100MMOL/LPH8EDTA20MMOLPH8NACL1.4MOL/LPVP1%灭菌备用,(2)氯仿/异戊醇（24:1）(3)RNaseA10mg/ml(4)乙醇或异丙醇(5)-巯基乙醇（6）氯仿/异戊醇（25/24/1）（7）70%乙醇,3.仪器:,a、离心机,b、恒温水浴,c、电泳装置,实验步骤,1.在2mL离心管中，加入500l的2CTAB和20l-巯基乙醇,65预热。2、嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。,3.加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10000rpm离心10min，移上清至另一新管中。4.向管中加入1/100体积的RNaseA溶液，置3720-30min。5.加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30min或-80放置10min，12000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。6.用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。7.0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。,SDS法,原理：SDS（十二烷基苯磺酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸；通过提高盐浓度并降低温度，使SDS-蛋白质复合物的溶解度变得更小，从而使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,试剂,(1)提取缓冲液Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）EDTA50mmol/L（pH8.0）NaCl500mmol/L灭菌后加-巯基乙醇至10mmol/L,(2)裂解液20%SDS(3)高盐溶液5mol/LKAc(4)RNaseA10mg/ml(5)异丙醇(6)灭菌ddH2O或TE,实验程序,1、取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500L提取液的离心管中,轻轻混匀。2、向管中加入50L20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65保温10min，并不时摇动。3、加入150L5mol/LKAc，混匀，置冰上20-30min。,4、4,15000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20沉淀30min。5、12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。6、加入1/10体积的RNaseA，37保温20min，除去RNA7、CI抽提后，加2V乙醇，-20沉淀30min。12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。8、用400L70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。,9、电泳检测完整性。,采用琼脂糖凝胶电泳方法，观察电泳图来判断DNA完整性若：电泳图呈现干净、光滑的单一一条带，没有拖尾现象，则说明DNA的完整性很好。可用于后续PCR分子生物学操作。若：电泳图有拖尾现象，不止单一一条带，则DNA完整性不是很好，用于后续实验操作效果较差。,DNA完整性良好,国内外相关文章,乌桕基因组DNA提取方法研究,张帅王晓光邓先珍罗治建程军勇卢小三【摘要】：以改良CTAB法和SDS法提取乌桕基因组DNA,对提取条件进行了正交试验,优化出乌桕基因组DNA提取的适宜条件,采用紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳分析及限制性内切酶进行了检测。结果表明:改良CTAB法的A1、B2、C2、D2组合提取的基因组DNA纯度高,无拖尾现象,OD260/280值在1.82.0,OD260/230在2.0。,【作者单位】：华中农业大学;湖北省林业科学研究院;【分类号】：S792.99,方法：采用若干乌桕叶片和种子，采用改良的CTAB法和SDS发分别提取乌桕基因组DNA，并对提取液分别进行紫外光分光光度计检测、检测糖凝胶电泳检测、限制性内切酶EcoRI检测结果：在条件相同的情况下，使用改良的CTAB法提取的乌桕嫩叶和种子DNA泳带平直清晰，亮度高，呈块壮，无明显拖尾痕迹，点样孔较干净，采用SDS发提取的DNA泳带呈块状，点样孔处残留少量杂质。纯度不高。适量的-ME（坏）、PVP（好）都对乌桕的DNA提取效果有影响,