细菌DNA提取方法

细菌dna提取方案细菌DNA提取方案细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌，如E.coli，一般有三种可以选择的方法。一、水煮模板法主要用于PCR反应1、接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养1824小时。2、刮取12接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。3、12000转/分钟 离心10分钟，取上清，20摄氏度保存备用。操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。二、CTAB/NaCl 法1、接种一单菌落于5mlLB中,30培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20保存备用。5、取3.5ml菌悬液,加入184l10%SDS,混匀,加入37l10mg/ml蛋白酶K,混匀,37温育1小时6、加入740l5mol/LNaCl,再加入512lCTAB/NaCl,混匀,65温育10分钟。7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。8、上清中加入等体积的酚氯仿异戊醇(25241),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20g/mlRNaseA,4保存。CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20g/ml RnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些，得到的DNA可用于Southern blot。编者建议：长时间保存DNA可放于-20，但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。三、盐析法1、1.5ml对数期菌液2、12000rpm 30 s3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr4、66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min8、上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇9、-20C，20min，14000rpm， 15min10、400ul 70%冷乙醇洗涤11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min12、2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤13、干燥，溶于100ul TE介于方法一和方法二之间，CTAB虽然取出糖分效果较好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。实验注意：提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。 1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4保存备用。2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50放置3h5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1TE或ddH2O中。31) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。3) 菌体裂解：加入6l 50mg/ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l，20mg/ml的蛋白酶K 3l，50作用3h或37过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇(25241)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50l ddH2O中，取2-5l电泳。作PCR模板用。4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.3) Freeze cell suspension at -20C4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.51) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。2) 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37保温1小时。3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65保温20分钟。5) 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。6) 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。7) 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。8) 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。2)氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：仪器：同方法一 二：试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；NaCL；20mg/ml蛋白酶；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；及100%乙醇三：操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，5000rpm,1min 沉淀 溶于500l TE缓冲液中混匀 30l 10%SDS,3L蛋白酶，混匀，37,1小时 100l NaCL(5M) 混匀 80l的CTAB/NaCL,*混匀；65 10min（可不做） 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心12000rpm,4-5min 取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。注意 ，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。 2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,可以获得较为完整的DNA分子。第4页 共4页