小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 摘要 目的:1.通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。2.进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色的过程。3.强化科研思维的培养及实验技能的训练。方法:将高转移力小鼠腹水型肝癌细胞(HCa - F)经 615 小鼠右腋中线皮下接种， 定期观察右腋皮下肿瘤的生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，并于接种后 21 天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结称重并测量大小，同时观察肿瘤的形态特点，生长方式，肺、肝、肾等脏器，并将瘤体、淋巴结及脏器做切片处理以作染色和镜下观察。结果:21 天 观察，实验使用 10 只小鼠，最终存活 8只，其中形成肿块 7 只（3只形成的肿 块较大），成瘤率 70%，淋巴结转移率 70%。肉眼观察，较大肿瘤 2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。结论:高转移力小鼠腹水型肝癌细胞通过淋巴道转移，无器官转移，且具有高转移力。 关键词HCa-F（高转移力小鼠腹水型肝癌细胞); 615小鼠; 高淋巴道转移 前言研究背景:原发性肝癌的发生率地区差异大，在亚非国家较常见，我国的发病率较高，属于常见的肿瘤之一。近年来，我国对肝癌的防治研究取得了明显的成绩，一些直径在1cm一下的小肝癌已被发现并及时治疗取得满意的疗效1。随着临床治疗经验的积累，逐渐意识到即使是小肝癌根治性切除，转移复发仍然是一个十分严峻的问题，术后 5 年复发率可高达 50% 。存在的问题:本次试验采用的方法是将瘤细胞移植于615小鼠右腋中线皮下，观察肿瘤生长及转移状态2。所以移植瘤没有展现自发性肿瘤从正常组织转变成肿瘤、随后出现转移的全过程,没有了解疾病完整的自然史。实验的意义:为了探究肝癌的实质性问题，即肿瘤本身的生物学特性，尤其是其转移的生物学特性，本次试验对肝癌转移的生物学行为进行实验性研究。即将肿瘤细胞直接接种到小鼠的皮下组织然后观察肿瘤细胞在小鼠体内的生长及转移情况。它基本上模拟了从肿瘤生长到转移瘤形成的一系列步骤，又涉及宿主的反应性，因此结果可靠，近似于临床病人的实际情况，对提高恶性肿瘤患者的生存率和预后有重要的意义3。正文一、材料 1、细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。2、实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6-8周龄，体重18-22g，由大连医科大学实验动物中心提供。 3、主要试剂及器皿搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、 75%酒精棉、10%甲醛固定液等。二、方法 1、细胞系获取 从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-F）塑料冷冻管，立即放入40摄氏度的温水中，1分钟内是冷冻液全部融化，立即送入无菌室。取出细胞悬液放入离心管中，用生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，再加1ml生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0.2mlHCa-F细胞悬液，于第6天无菌条件去腹水。 2、615小鼠皮下接种肿瘤细胞 取615小鼠癌性腹水0.1ml，内含2*106 个活瘤细胞，接种于615小鼠右腋中线皮下。局部严格消毒。选择右腋皮下接种。定期检查右腋皮下肿瘤生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，于接种后21天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧淋巴结称重，同时观察肺、肝、肾等脏器。将上述组织固定于10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜观察。 3、组织取材将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成23mm的小于2cm*1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定2448小时。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木精-伊红染色。 4、切片染色石蜡切片法、HE染色法。 脱水程序及时间：组织固定，冲洗，然后：1） 脱水：以下列顺序进行：60%酒精30分钟80%酒精12小时95%酒精24小时或过夜95%酒精24小时100%酒精24小时100%酒精24小时或过夜。2） 透明：二甲苯I 3045分钟；二甲苯 3045分钟。3） 浸蜡。蜡碗、（各3045分钟）；包埋。4） 修蜡块：修蜡块，贴号。5） 切片。6） 烘烤。烘烤切片6070摄氏度，1小时。7） 染色。HE切片染色程序与方法1） 切片脱蜡水洗：将烘干的切片浸入二甲苯、各510分钟。 无水酒精3-10分钟（消除二甲苯）95%酒精13分钟80%酒精13分钟70%酒精13分钟50%酒精13分钟自来水冲洗5分钟以上（洗去切片上的酒精，切片透明）蒸馏水清洗（防止污染苏木精染液）。 脱蜡是水化过程，目的是通过酒精的缓冲作用，易于水洗与染色。因为染剂是水，从无水酒精直接放入染液中，容易引起激烈的扩散作用，造成切片漂浮脱落或损伤组织。而经各级浓度酒精缓冲后即可避免发生这种现象。2） HE染色苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的过染，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核呈明显的蓝色，胞质及背景无色。再经水洗后用伊红染胞质，染成深浅不同程度的粉红色至红色。苏木染色（染核）515分钟自来水冲洗35分钟0.5%盐酸酒精溶液分化数秒钟自来水洗15分钟弱碱性水溶液显蓝3060秒自来水冲洗510分钟蒸馏水洗12次伊红1分钟蒸馏水洗12次。3） 脱水、透明、封固：脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固，便于观察和长期保存。 80%酒精3040秒95%酒精3060秒无水酒精15分钟无水酒精15分钟二甲苯15分钟二甲苯15分钟中性树胶封固。 5、镜下观察。三、结果21天观察10只小鼠，最终存活8只，其中形成肿块7只，3只形成的肿块较大。成瘤率70%，淋巴结转移率70%。肉眼观察：淋巴结较正常增大，皮下瘤体较大，与皮下组织粘附紧密，肝和肾脏可见肿瘤结节，较大肿瘤2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。四、讨论将小鼠右腋皮下腋下作为肿瘤细胞的接种部位是其由于此处的淋巴结相对较多，且有血循环丰富，利于肿瘤的转移。人体内对抗癌细胞的功能主要由免疫系统承担。免疫系统被肿瘤细胞阻塞，淋巴液就会向相反的方向流动，导致不符合常规的转移现象。小鼠腹水型肝癌细胞瘤株属于小鼠肝细胞癌。由于615小鼠淋巴系统比较发达且有许多近交系，部分近交系有其特定的自发性肿瘤，可利用其自发肿瘤与人体肿瘤的相似之处做为动物模型进行肿瘤发生、发展和治疗的研究。同时，胸腺严重缺陷的裸小鼠可接受人类各种肿瘤细胞的植入，成为活的癌瘤细胞试管，是研究人类肿瘤生长发育、转移和治疗的绝佳动物。在本实验中观察到的肿瘤细胞的异型性准要表现在以下几个方面：1肿瘤细胞的多形性表现为瘤细胞大小不一，形态不规则，甚至出现胞体特大的瘤巨细胞。少数分化差的肿瘤细胞较相应组织的正常细胞小，圆形，且大小较一致。2核的多形性细胞核大小不一，形态不规则，甚至出现多核、巨核、畸形核瘤细胞。肿瘤细胞核明显增大，因而使核/浆比例增大，从正常的1:46增至1:1.52,甚至1:1。核染色质呈粗大颗粒状，分布不匀，常靠近核膜分布，使核膜显得增厚。核仁肥大,数目增多。核分裂像多见，并可出现病理性核分裂，即多极性、不对称性、顿挫型核分裂。恶性肿瘤细胞核多形性与染色体呈多倍体或非整倍体有关。3胞质的改变恶性肿瘤细胞的胞质一般由于分化低而减少,但有时也可以增多。由于胞质内核蛋白体增多，故多呈嗜碱性染色。 此次试验便是通过建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCaF细胞模型，对肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性有所了解。通过模型的建立，染色制片，镜检等一系列的过程建立了科研的学术观念，掌握了相关的专业知识。恶性肿瘤细胞转移的可能机制有1、淋巴道转移 2、血道转移 3、种植性转移。本实验中重点研究淋巴道转移，恶性肿瘤侵入淋巴管后，随淋巴流首先到达局部淋巴结。局部淋巴结发生转以后，可继续转移至下一站的其他淋巴结，最后，可经胸导管入血再继发血道转移。值得注意的是，有的肿瘤可以逆行转移或者越过相应的引流淋巴结发生跳跃式转移。肿瘤细胞一般经血液和淋巴道转移，在实验中经过HE染色可以观察到肝脏和肾脏有转移瘤，因而可以推断小鼠腹水型肝癌细胞经过了转移，而且在淋巴结中也发现了肿瘤细胞，也能说明小鼠腹水型肝癌细胞经过淋巴道转移。本实验结果可以为预防恶性肝癌转移提供较为清晰的预防思路。参考文献1李甘地,来茂德.病理学.人民卫生出版社,2001: 2612李连宏,唐建武,孙雷.医学形态实验学.人民卫生出版社,2009 ：973孙成荣，唐建武，孙明忠，采用定量蛋白组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白.生物化学与生物物理进展,2007,34(8):856864 4 张宏颖,刘春平,唐建武,许国旺,等.姜黄素对小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株(HCa-F)生物学行为的影响.中国科学院上海冶金研究所; 材料物理与化学(专业) 博士论文 2000年度 5Sobel MW.J Natl Cancer Inst,1990;82:267 6Saigoh K, Wang YL, Suh JG, et al. Intragenic deletion in the gene encoding ubiquitin carboxy-terminalhydrolase in gad mice J. Nat Genet. 1999, 23(1):4751.6、BurelillSA,et al.Br J Cancer,1995;71:278 7李海燕,方肇勤,梁尚华.小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中医药抗肿瘤中的应用.中国中医基础医学杂志,2000,6,1,27 8凌茂英,刘希风,郑怀祖,等.小鼠肝癌细胞系H22-F25/L的建立及其生物学特性.中华肿瘤杂志,1991,13(1):13.9陈桑, 凌茂英, 刘希风,等. 小鼠腹水型肝癌高、低转移克隆稳定性的研究 J . 大连医学院学报, 1992, 14: 32- 37. 10张宏颖，唐建武，朱文婷，胡春秀，许国旺.小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCaP/L6细胞模型的建立及其药物敏感性的评价.大连医学院学报，2008，30（5）：465-468.