测定α-淀粉酶活力的方法

实验五 激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、 目的要求 通过实验加深对酶性质的认识，了解测定-淀粉酶活力的方法。二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。 能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。 酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。 食品级-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称-淀粉酶为液化淀粉酶。-淀粉酶不能水解淀粉支链的-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和-1,6键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响（一）试剂及材料 1、1：30唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸馏水稀释。 2、0.2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至100mL。 3、1%NaCl溶液 称取1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至100mL 。 4、1%CuSO4溶液 称取1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。5、标准稀碘液 称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。吸取2mL 上述碘液，加入10 g碘化钾，用水稀释至500 mL。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法 取试管3根，编号后按下表配置实验样液。试管序号0.2%可溶性淀粉1%NaCl1%CuSO4蒸馏水混匀，放入37水浴中保温10min。立即加入唾液淀粉酶。1：30唾液淀粉酶12.0 mL1.0 mL/1.0 mL22.0 mL/1.0 mL/1.0 mL32.0 mL/1.0 mL1.0 mL 用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。四、温度与PH值对-液化淀粉酶活力的影响（一）试剂与材料 1、2%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉2.0g（预先在105烘干），预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。 2、PH4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液 （1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。 （2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。 3、供试酶液的制备 称取固体-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液100mL (缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成)，于40恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm / min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。 4、标准比色液 甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g，溶解并定容至500mL。 乙液：称取铬黑T 40.00mg，溶解并定容至100mL。 使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新配置。 5、标准稀碘液。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法 1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。 2、不同温度对-液化淀粉酶活力的影响 取4根25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0缓冲液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根试管分别放入50、60、70、80恒温水浴中预热10min分别加供试酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL反应完成时间记录（min）50607080加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内 ，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。 3、不同PH值对-液化淀粉酶活力的影响 取5根25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号2%可溶性淀粉缓冲溶液恒温水浴60预热10min。 供试酶液反应完成时间记录（min）120mLPH4.0 5.0 mL0.5 mL320mLPH6.0 5.0 mL0.5 mL420mLPH7.0 5.0 mL0.5 mL520mLPH8.0 5.0 mL0.5 mL其它操作与温度对酶活力影响实验相同。五、结果计算和讨论 淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数。 酶活力单位(U/g)=式中：20可溶性淀粉的用量（mL）； t酶解反应完成所需的时间（min）； 0.5测定时稀释酶液用量（mL）； 0.02可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）； n酶制剂稀释倍数1、不同温度对-液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果50607080酶活力（U/g）2、不同pH值对-液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0酶活力（U/g）分别以PH值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制PH值酶活力单位、温度酶活力单位图。讨论分析实验结果。六、思考题1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？