PDA培养基的配制方法

PDA 培养基的配制方法 一 目的要求 1 学习并掌握配制培养基的一般方法和步骤 2 学习并掌握棉塞的制作方法 二 培养基的配制原理 培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质 用以培养 分离 鉴定 保存各种微生物或积累代谢产物 在自然界中 微生物种类繁多 营养类型多样 加上实 训 和研究的目的不同 所以培养基的种类很多 但不论是何种培养基 均应含有水分 碳源 氮源 能源 无机盐等 不同微生物对 pH 值要求不一样 所以配制培养基时 还应根据 不 同微生物对 pH 值的要求 将培养基调到合适的 pH 值范围 三 实训材料和用具 琼脂 可溶性淀粉 葡萄糖 10 NaOH 10 HCl 1mol L NaOH lmol L HCl KNO 3 NaCl K 2HPO4 3H20 MgSO4 7H 20 FeSO 4 7H2O 试管 三角瓶 烧 杯 量筒 玻璃棒 天平 牛角匙 PH 试纸 棉花 牛皮纸 记号笔 纱布 四 操作方法与步骤 一 培养基的配制 PDA 培养基的配制 其配方如下 土豆 200g 葡萄糖 20g 琼脂 15 20g 水 1000mL pH 值自然 1 称量和熬煮 药品实际用量计算后 按培养基配方逐一称取去皮土豆 土豆切成小 块放入锅中 加水 1000ml 在加热器上加热至沸腾 维持 20 30min 用可用 2 层纱布趁 热在量杯上过滤 滤渣弃取 滤液补充水分到 1000ml 2 加热溶解 把滤液放入锅中 加入葡萄糖 20g 琼脂 15 20g 提前搞碎 然后 放在石棉网上 小火加热 并用玻棒不断搅拌 以防琼脂糊底或溢出 待琼脂完全溶解后 再补充水分至所需量 3 分装 按实训要求 将配制的培养基分装入试管或 500ml 三角瓶内 分装时可用 三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染 分装量 固体培养基约为试管高度的 1 5 灭菌后制成斜面 分装入三角瓶内以不超 过其容积的一半为宜 半固体培养基以试管高度的 1 3 为宜 灭菌后垂直待凝 4 加棉塞 培养基分装完毕后 在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞 或泡沫塑料塞或 试管帽等 以阻止外界微生物进入培养基内造成污染 并保证有良好的通气性能 5 包扎 加塞后 将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好 再在棉塞外包一层牛皮纸 以防 止灭菌时冷凝水润湿棉塞 其外再用一道线绳或橡皮筋扎好 用记号笔注明培养基名称 组别 配制日期 二 棉塞的制作 棉塞的作用有二 一是防止杂菌污染 二是可过滤空气 保证通气良好 并可减缓培养基 水分的蒸发 所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环 正确的棉塞是形状 大小 松 紧应与试管口 或三角烧瓶 完全适合 过紧则妨碍空气流通 操作不便 过松时 空气会毫无 障碍地进入试管 或三角烧瓶 中 达不到灭菌的目的 棉塞过小往往易掉进试管内 因此棉塞 质量的优劣对实训的结果有很大的影响 正确的棉塞头较大 加塞时 应使棉塞长度的 1 3 留在试管口外 2 3 在试管口内 见实训图 6 4 目前 有条件的实训室已使用坚固的塑料 试管帽 金属试管帽 硅胶泡沫塞替代棉塞 制作棉塞要选纤维较长的棉花 一般不选用脱脂 棉 因为它容易吸水变湿 造成污染 而且价格也贵 棉塞制作方法见图 6 5 实图 6 4 棉塞 实图 6 5 棉塞的制作方 法 三 斜面与平板培养基的制作 斜面与平面培养基是常用的琼脂固体培养基 将熬制好的琼脂培养基趁热装入试管灭 菌后摆鞋面 凝固后即成斜面培养基 斜面培养基常用于菌种培养 菌种保藏等工作 将 灭菌后的琼脂培养基倾注于无菌培养皿中 凝固后即成平板培养基 平板培养基常用于分 离菌种 菌落计数 菌落形态观察及菌种鉴定等 斜面与平板培养基的制作过程大致为 溶解原料 融化琼脂 调 PH 分装 灭菌和制斜面或平板 1 溶解原料 为加速原料的溶解 最好用热水 先将原料依次加入到占配制量一半的水中 待全 部溶解后在加足水量 如配方中有马铃薯 麸皮 胡罗卜 豆芽等天然原料 需将其熬 制约 30min 取出定量滤液 在将所需的其他原料加入滤液中 2 融化琼脂 琼脂的用量可灵活掌握 用作保藏菌种的培养基 琼脂用量可提高至 2 5 以增加 持水性 冬季的气温低 琼脂用量可适当减少 琼脂用前可剪成小段 以利于融化 待 溶液煮沸是再加入 不断搅拌至完全无琼脂块状物时再停止加热 3 调整 PH 用洁净干燥的玻璃棒沾一点培养基滴在试纸上 立即与比色板比较 一般用 10 NaOH 或 HCl 调节 4 分装 将培养基趁热倒入垫有纱布的漏斗中 使培养基直接滤至试管或三角瓶中 试管装量一 般为管高的 1 4 左右 三角瓶的装量约为其容量的一半 勿使培养基玷污容器口部 口 部塞有棉塞 试管每 7 或 9 支扎一捆 棉塞外面包牛皮纸 以防在灭菌过程中被水汽打 湿 5 灭菌 分装后的培养基应随即灭菌 除特殊情况外 一般培养基均用高压蒸汽灭菌 在 104kPa 压力下 灭菌 20 30min 6 制作斜面或平板 将灭菌后的试管趁热斜置于棍条上 倾斜度以试管中的培养基约占试管长度的 1 2 为宜 凝固后即成斜面培养基 待灭菌后三角瓶内的培养基冷却至 45 50 时 以无菌操 作法向无菌培养皿中倒入培养基 装置以刚覆盖整个培养皿底部为宜 约 15ml 凝固 后即成平板培养基 五 高压蒸汽灭菌法 该法使用高压灭菌锅 在 121 O 105MPa 压力下灭菌 15 30min 微生物实训所 需的一切器皿 器具 培养基 不耐高温者除外 无菌水 工作服等物品都可用此法灭菌 高压蒸汽灭菌锅是能耐一定压力的密闭金属锅 有立式或卧式 实图 8 1 2 两种 灭菌锅上附有压力表 排气阀 安全阀 加水口 排水口等 卧式灭菌锅还附有温度 计 有的还有蒸汽人口 灭菌锅的加热源有电 煤气和蒸汽三种 高压蒸汽灭菌的操作过程 1 加水 将灭菌锅内层灭菌桶取出 再向外层锅内加入适量的水 以水面与三角架 相平为宜 立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下 1 3 处 有加水口者由加水口加入至止 水线处 2 装料 将装料桶放回锅内 装入待灭菌的物品 放置装有培养基的容器时要防止 液体溢出 瓶塞不要紧贴桶壁 以防冷凝水沾湿棉塞 3 加盖 摆正锅盖 对齐螺口 然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺 栓 打开排气阀 4 排气 用电炉或煤气加热 待水煮沸后 水蒸气和空气一起从排气孔排出 一般 认为 当排气流很强并有嘘声时 表明锅内空气已排净 沸后约 5min 5 升压 当锅内空气排净时 即可关闭排气阀 压力开始上升 实图 7 1 立式灭菌锅 实图 7 2 卧式灭菌锅 1 安全阀 2 压力表 3 放气阀 4 软管 5 紧固螺栓 6 灭菌桶 7 筛架 8 水 6 保压 当压力表指针达到所需压力刻度时 控制热源 开始计时并维持压力至所 需时间 本实训用 121 20rnin 灭菌 7 降压 达到所需灭菌时间后 关闭热源 让压力自然下降到零后 打开排气阀 放净余下的蒸汽后 再打开锅盖 取出灭菌物品 排掉锅内剩余水 8 无菌检查 将已灭菌培养基冷却后置于 37 恒温箱内培养 24h 若无菌生长 则 放人冰箱或阴凉处保存备用 4 化学药品灭菌 化学药品消毒灭菌法是用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消 毒灭菌的方法 能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂 如重金属离子等 仅阻抑细菌代谢机能 使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂 如磺胺类及大多抗生素等 化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果 还与化学药品浓度的高低 处理 微生物的时间长短 微生物的种类及微生物所处的环境等有关 微生物实训室中常用的化学药品有 2 煤酚皂溶液 来苏尔 O 25 新洁尔灭 0 1 升汞 3 5 的甲醛溶液和 75 乙醇溶液等 5 注意事项 1 使用高压灭菌锅应严格按照操作程序进行 避免发生事故 灭菌时 操作者切勿擅 自离开 务必待压力降到零后 才可打开锅盖 2 干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤 以免阻碍空气流通而影响灭菌效果 灭 菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触 以防包装纸烤焦 3 记述高压蒸汽灭菌的操作过程及注意事项 六 实验报告 思考题 1 培养基根据什么原理配制成 牛肉膏蛋白胨培养基中不同成分各起什么作用 2 配制培养基有哪几个步骤 在制备培养基的过程中应注意些什么问题 为什么 3 记录本实训配制培养基的名称 数量 并图解说明其配制过程 指明要点 4 培养基配制完成后 为什么必须立即灭菌 已灭菌的培养基如何进行灭菌检查