植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析

分子生物学 实验报告 实验一 植物基因组 DNA 的提取及其定性 定量分析 实验目的 通过本实验学习利用 CTAB 法从植物组织中提取 DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外 分光光度法对 DNA 进行定性定量分析 实验原理 CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子型去污剂 可溶解细胞膜 在高离子强度 下 大于 0 7 M NaCl 与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来 利用液氮对植物组织进行 研磨 从而破碎细胞 然后加入 CTAB 缓冲液将 DNA 溶解出来 再用酚 氯仿抽提的方 法去除蛋白 最后经乙醇沉淀得到 DNA 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段的常用技术 把 DNA 样品加入到一块包含电 解质的多孔支持介质 琼脂糖凝胶 的样品孔中 并置于静电场上 DNA 分子在高于等电点 的 pH 溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应 由于糖 磷酸骨架在结构上的重复性质 相同数量的双链 DNA 几乎具有 等量的净电荷 因此 在一定的电场强度下 DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应 即 DNA 分子本身的大小和构型 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系 分子量小的 DNA 分子比分子量大的 DNA 分子迁移速率快 迁移距离远 由此得到分离 凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同 但构型不同的 DNA 分子 超螺旋质粒 DNA cccDNA 泳动最快 其次为线状 DNA L DNA 最慢的为开环质粒 DNA ocDNA 核酸分子 DNA 或 RNA 由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键 在 260 nm 波长处有特异 的紫外吸收峰 其吸收强度与核酸的浓度成正比 这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供 了基础 1 OD260 相当于 dsDNA 50 g mL ssDNA 33 g mL和 ssRNA 40 g mL 可以此来计 算核酸样品的浓度 紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度 还可通过测定 260 nm 和 280 nm 的紫外线吸收值的比值 A260 A280 估计核酸的纯度 若 DNA 的 A260 A280 比值高于 2 0 则可能有 RNA 污染 低于 1 8 则有蛋白质污染 仪器 材料与试剂 一 仪器及耗材 离心机 恒温水浴器 台式离心机 电子天平 水平电泳槽 电泳仪 凝胶成像分析 系统 高压灭菌锅 紫外线透射仪 微波炉 紫外分光光度仪 微量移液器 10 100 1000 L 量程各一支 100 mL 或 250 mL 锥形瓶 量筒 液氮 研磨棒 点样 板或 parafilm 吸头 1 5 mL EP 管 PE 手套和乳胶手套 二 药品 三羟甲基氨基甲烷 Tris CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 巯基乙醇 氯仿 苯酚 乙醇 氯化钠 NaCl 盐酸 液氮 硼酸 乙二胺四乙酸 EDTA 溴酚蓝 蔗糖 琼脂糖 核酸染料 三 试剂 1 2 CTAB buffer 1 2 70 乙醇 2 3 RNaseA 天根 3 4 0 5 TBE 缓冲液 工作浓度 4 5 6 loading buffer 5 6 核酸染料 赛百盛 7 DNA marker DL 2000 Takara 8 酚 氯仿 1 1 V V 6 实验步骤 1 取约 100 mg 新鲜的拟南芥嫩叶放入 1 5 mL EP 管 在液氮冷冻条件下研磨成粉末状 2 加入 0 6 mL 2 CTAB 提取液 用前加入 0 2 的巯基乙醇 混匀 65 水浴 30 min 每 10 min 颠倒混匀一次 3 取出离心管 冷却后加入 0 6 mL 酚氯仿混合液 混匀 4 11 500 rpm 室温离心 8 min 若没离好可重复一次 5 将上清液 约 400 L 转移到另一新的 1 5 mL 离心管中 6 加入与上清等体积的氯仿 混匀 11 500 rpm 离心 8 min 取上清 约 350 L 7 加入 600 L 无水乙醇 上下颠倒混匀 80 放置 30 min 8 4 15 800 rpm 离心 20 min 弃上清 9 1 mL 70 乙醇 预冷 洗涤沉淀 2 次 上下颠倒几次 不能 vortex 7 000 g 离心 3 min 弃上清 风干 10 加入 30 L无菌水 含 20 g mL RNase A 37 溶解 DNA 30 min 11 取 5 L DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测 1 制备琼脂糖凝胶 称取 0 3 g 琼脂糖 放入三角瓶中 加入 30 mL 0 5 TBE 缓冲液 置微波炉中加热至 完全熔化 取出摇匀 则为 1 琼脂糖凝胶液 2 胶板的制备 取有机玻璃内槽 洗净 晾干 用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好 一定封严 不能留缝隙 形成一个模具 将有机玻璃内槽放置于一水平位置 并在固定位置放好样品梳子 待琼脂糖凝胶液冷却到 60 左右时 加入核酸染料 1 5 L 摇匀 缓缓倒入有机 玻璃内槽 直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面 注意不要形成气泡 室温下静置直至凝胶完全凝固 室温下 30 45 min 垂直轻拔梳子 取下胶带 将 凝胶及内槽放入电泳槽中 加入 0 5 TBE 电泳缓冲液至电泳槽中 使缓冲液没过胶面约 1 mm 3 加样 在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液 上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于 1 用 10 L微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内 将 DNA marker 分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内 每加完一个样品 应更换一个加样头 以防污染 加样时勿碰 坏样品孔周围的凝胶面 注意 加样前要先记下加样的顺序 4 电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源 DNA 片段从负极 黑色插头 向正极 红色插头 移动 DNA 的迁移速度与电压成正比 但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低 因此 最高电压不超过 5V cm 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1 2cm 处 停止电泳 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带 戴手套操作 采用凝胶成像系统拍照保存 12 紫外分光光度法测定 DNA 浓度及纯度 1 用 0 1 TE 对待测 DNA 样品按 1 20 或合适的倍数稀释 2 开机 仪器会自动对光路及分析软件进行检测 待显示屏上出现 instrument Ready 时 进入核酸测定窗口 3 调零 先用 0 1 TE 缓冲液注入样品杯 放入样品槽 关闭盖板 点击 set ref 键 仪器自动校正零点 将样品槽内的样品杯取出 换上待测样品 4 吸 70 L已稀释的 DNA 样品转入石英样品杯 放入样品槽 关闭盖板 如果样品很 少 可以用 5 7 L的石英样品杯 点击 enter 键 仪器即进入分析状态 窗口同时显示 260 nm 和 280 nm 处的光密度 OD 值 及 A260 A280 nm 和 A280 A260 nm 的比率以及 DNA 样品的浓度等 5 打开盖板 取出石英样品杯 吸出样液 用超纯水清洁石英样品杯 风干后 再加 入下一个待测样品 6 DNA 纯度 以 A260 A280 比值来反映 当 A260 A280 比值2 0 说明样品存在 RNA 污染 可以用 RNA 酶处理样品去除 RNA 实验结果与分析 1 1 的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组 DNA 1 的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的 DNA 5 l 样品 电泳结果如图所 示 有 DNA 条带出现 表明已经成功提取到了拟南芥的基因组 DNA C 组 电泳结 果如图所 示 2 DNA 样品的 OD 检测 检测 OD 值 C1 浓度 1061 7 ng OD260 OD280 1 87 表明 C1 接种 DNA 质量良好 如下图所示 C2 浓度 1017 6ng OD260 OD280 1 86 表明 C2 接种 DNA 质量良好 如下图所示 C3 浓度 711 0ng OD260 OD280 1 86 表明 C3 接种 DNA 质量良好 如下图所示 注意事项 1 磨样时要反复插入液氮中冷冻 但要避免液氮进入管中 2 取酚氯仿混合液时要吸取下层 3 加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀 4 氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层 5 晾干沉淀时 要尽可能的吸除酒精 实验二 PCR 扩增目的片段 实验目的 通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术 实验原理 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction PCR 是一种体外核酸扩增系统 其原 理类似 DNA 分子的天然复制过程 是将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的两个寡聚核苷 酸引物 经变性 退火和延伸若干个循环后 DNA 扩增 2n 倍 典型的 PCR 反应体系由如下组分组成 DNA 模板 反应缓冲液 dNTP 两个合成的 DNA 引物 耐热 DNA 聚合酶 PCR 的工作程序实际上是一个在模板 DNA 一对已知序列的 寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下 DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应 整个 扩增过程分三步 变性 加热使模板 DNA 双链间的氢键断裂而形成两条单链 即变性 阶段 退火 快速降低温度至 50 60 后 模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合 即退火阶段 延伸 溶液反应温度升至 72 耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板 在 引物的引导下 利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸 dNTP 按 5 3 方向复制 出互补 DNA 即引物的延伸阶段 完成以上三步为一个循环 每经过一个循环 样本中 的 DNA 量就增加一倍 新形成的 DNA 链又成为下一轮循环的模板 经过 25 30 个循环后 DNA 可扩增 106 109 倍 PCR 扩增的特异性取决于引物与模板 DNA 的结合 仪器 材料与试剂 一 仪器及耗材 PCR 热循环仪 台式离心机 电泳仪 凝胶成像系统 移液器 0 1 2 5 L 200 L PCR 管 吸头 离心管 手套 制冰机 微量移液器 10 100 1000 L 量程各一支 100 mL 或 250 mL 锥形瓶 量筒 点样板或 parafilm 吸头 PE 手套和乳胶手套 二 试剂 1 10 缓冲液 2 DNA 模板 1 ng L 以实验一 提取的拟南芥基因组 DNA 为模板 3 dNTP Mix Takara 4 引物 P3 5 CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG 3 P5 5 ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC 3 引物溶液浓度 2 M 5 rTaq 酶 5 U L 6 低熔点琼脂糖 7 去离子水或 TE pH7 6 7 实验步骤 1 在 200 L PCR 管内配制 20 L 反应体系 反应物 体积 L ddH2O 11 3 10 PCR 缓冲液 2 0 dNTP 1 6 终浓度 20 200 M 引物 1 2 0 引物终浓度 0 2 M 引物 2 2 0 引物终浓度 0 2 M 模板 DNA 1 0 rTag 酶 0 1 Total 20 视 PCR 仪有无热盖 不加或添加石蜡油 2 将上述试剂依次加入 PCR 薄壁管 加样后用手轻弹混匀 6 000 rpm 离心 15 sec 使 反 应成分集于管底 3 PCR 反应热循环程序设置 94 预变性 3 min 94 变性 30 sec 64 退火 30 sec 30 cycles 72 延伸 1 min 72 延伸 10min 16 pause 反应结束后短暂离心 置 4 保存备用 4 配制 1 的琼脂糖凝胶 5 取 5 L PCR 产物 加 1 L的 6 loading buffer 上样缓冲液 轻弹混匀后进行电泳检 测 6 如果 PCR 产物非常特异 可以直接用于与载体的重组连接 实验结果 本实验扩增片段长 652 bp 注意事项 1 加样时要精确用移液器 2 检查 PCR 仪是否热盖 3 每种试剂弹化后要离心 做 MIX 时 最后加酶 分装之前要混匀 分装后需离心混匀 实验二的 PCR 扩增 实验结果与分析 用 1 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物 电泳结果如图所示 有 DNA 条带 约 600 bp 或者无 DNA 条带