分子生物学实验常用工具酶总结

现代分子生物学实验手册 工具酶 基因工程 在人工可以控制条件下 将基因剪切或重新组合 再导入另一 生物体内 使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术 核心 对基因 进行人工切割 连接和重新组合 构建重组 DNA 工具酶 在基因工程的重组 DNA 过程中 所需要用到的酶的统称 1 限制性内切酶 restriction endonuclease 主要功能 对外源性的双链 DNA 进行切割 水解 不允许外源性 DNA 存 在于细菌自身细胞内 这种酶能对在自身细胞内存在的 DNA 种类给予限 制 限制性内切酶 限制 修饰系统 合成限制性内切酶的细胞 其自身的 DNA 不受酶的切割 这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶 可以对自身 DNA 进行修饰 即改变 DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构 从而不被限制性内 切酶识别及切割 水解 保护自身遗传物质稳定的机制 限制性内切酶 从原核生物中发现的 约 600 种 可识别 108 种不同的特 定 DNA 顺序 以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键 产生 DNA 片段的 5 端 为 P 3 端为 OH 命名 获得该酶的细菌属名的第一个字母 大写 该菌种名的前两个字母 小写 株系的字母 小写 或数字 罗马数字 同一株菌种不同内切酶的编号 例 细菌属名 细菌种名 菌株名称 限制酶名称 Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13 EcoR I Bacillus amyloliquefaciens H HamH I Haemophilus influenzae Rd Hind III 一 三种常用内切酶 1 I 型限制性内切酶 同时兼有切割 DNA 的功能和修饰酶的修饰功能 在酶的识别位点上 若 DNA 两条链菌没有发生甲基化 则行使内切酶的 功能 对 DNA 进行切割 同时转变成 ATP 酶 若 DNA 双链中有一条链已发 生甲基化 则此类酶显示修饰酶的作用 对另一条 DNA 进行甲基化修饰 然 后在行切割功能 实际上 有内切酶 修饰酶 ATP 酶及解旋酶四种功 能 I 型限制性内切酶在 DNA 链上的识别位点和切割位点不一致 也不固定 没有时间应用价值 DNA 甲基化 DNA 化学修饰的一种形式 能在不改变 DNA 序列的前提下 改变遗传表现 外遗传机制 多发生于 CpG 二核苷序列上 在甲基转移 酶的催化下 DNA 的 CG 两个核苷酸中的胞嘧啶被选择性添加甲基 形成 5 甲 基胞嘧啶 甲基化位点可随 DNA 的复制而遗传 DNA 复制后 甲基化酶 可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化 DNA 甲基化可引起基因组 中相应区域染色质结构变化 使 DNA 失去限制性内切酶的切割位点 以及 DNA 酶的敏感位点 使染色质高度螺旋化 凝缩成团 失去转录活性 2 III 型限制性内切酶 具有内切酶和甲基化修饰酶作用 具有专一的识别顺序 其切割位点在识别顺序旁边的几个核苷酸对的固定 位置上 可识别短的不对称序列 切割位点与识别序列约距 24 26bp 3 II 型限制性内切酶 也具有限制 修饰系统 但由限制酶和修饰酶这两种不同的酶共同来执行这 一系统的功能 即 II 型限制性内切酶有在识别位点的切割功能 而不具备甲基 化修饰活性 修饰作用由相应的修饰酶完成 两种酶识别同一 DNA 特定序 列 却发挥不同作用 能识别双链 DNA 的特异顺序 并在该顺序内的固定位置上进行切割 产 生特异的 DNA 片段 II 型限制性内切酶的识别位点和切割位点是专一和固定的 对相同的基因 片段的切割 总是得到同样核苷酸顺序的小 DNA 片段 这些切割后的不同大 小的 DNA 片段 可以与统一内切酶切割后的来源不同的其他 DNA 片段实行连 接 而构建重组 DNA 基因工程技术的核心 II 型限制性内切酶识别的专一核苷酸顺序 最常见的是 4 6 个碱基对 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序 反转重复顺序 具 有 180 的旋转对称性 识别顺序有一个中心对称轴 从这个轴朝两个方面读序 都是相同的 这类酶切割 DNA 可有两种形式 交错切割方式 每种酶切割后个产生两个 DNA 片段 每一个片段个含有一个单链末端 单链 末端是互补的 可以通过形成 氢键 而黏合 不同来源的两条 DNA 片段经同一种酶切割后 产生互补的黏性末端 通 过选择合适的 DNA 链接 可将两条异源性 DNA 片段组合在一起 重组 DNA 的最基本原理 用选择专一性不同而产生相同黏性末端的两种酶切割两条不同的 DNA 片 段 可使重组后的 DNA 片段不再被原来的酶所切割 如 Sal I 酶切割后产生的黏性末端 Xho I 酶切割后产生的黏性末端 两者经连接酶连接产生的序列 既不被 Sal I 酶切割 也不被 Xho I 酶切割 在同一位置上切割 DNA 双链 产生平头末端 如 二 其他类型内切酶 1 同工酶 Boschizomer 来源不同的两种 II 型内切酶 它们识别核苷酸顺序 及切割位点都相同 差别只在于当识别核苷酸序列中有甲基化的核苷酸时 一 种内切酶可以切割 而另一种不能 如 Hpa II 和 Msp I 识别顺序都是 5 CCGG 3 若其中有 5 甲基胞嘧啶 则只有 Msp 酶可切割 GGmCC 2 Subset 酶 识别顺序及切割位点相互有关的酶 互称 Subset 酶 如 Sam I 酶所识别的 6 个核苷酸顺序中含有 Hpa II 酶识别的 4 个核苷酸顺序 所以这两个酶可以相互代替使用 它们所切割的 DNA 片段可以相互连接 3 可变酶 特殊的 识别核苷酸顺序一般都大于 6 个 但其中一个或几个核 苷酸时可以变化的 4 远距离切割酶 识别核苷酸顺序的位置与切割的位点不一致 一般切割位点 与指标核苷酸顺序的位置之间有 10 个左右核苷酸的距离 与 I 型内切酶相似 不过 I 型内切酶识别位点与切割位点的距离更远一些 三 甲基化酶 不属于内切酶 使识别顺序中的某个核苷酸发生甲基化 保护 DNA 不被限制性内切酶切 开 M5C 5 甲基胞嘧啶 大多数以 M5CpG 的形式存在 即 CpG 岛中的 C 最 容易是甲基化的底物 而甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关 因此 研究 CpG 岛的甲基化是研究基因调控的一个重要方向 当甲基化酶和限制性内切酶共同使用时 常常可以使有多个识别位点的内切酶 只对其中一个识别位点有切割效果 其他位点因被甲基化酶修饰而不能被切割 如 限制性内切酶 Ava 的识别顺序是 Py 可以是任何一种嘧啶 pu 可以是任何一种嘌呤 因此可以有 4 种识别顺序 如果同时使用甲基化酶 Taq 和甲基化酶 Hpa 则 Ava 的识别顺序将只是 5 CCCGAG 3 如上图 一个基因片段被 Ava I 酶切割时 片段中有三个 Ava I 酶识别顺序 该片段 被切割成 4 个片段 但若先用 Taq I 甲基化酶和 Hpa II 甲基化酶作用该片段时 片段中 某些核苷酸发生甲基化修饰而不能被切割 再用 Ava I 酶切割时 只能被切割成两个片段 一甲基化酶对 DNA 的某位点进行甲基化修饰 进而抵御内切酶的切割 构建重组质 粒 4 与 内切酶相关的几个概念 1 酶活性单位及标准反应体系 酶活性单位 在一定温度 PH 及离子强度下 1h 内完全酶解 切割 特 定底物 DNA 所需限制内切酶的量 底物 DNA 多用 噬菌体 DNA 又是可以用某一种酶在 噬菌体 DNA 上的切割位点 来推算用这种酶切割这种 DNA 时所需的活性单位 标准反应体系 在 50 l反应体系及指定温度下 使用特定的缓冲体系 用 1 个活性单位的限制内切酶 酶解 1 g底物 DNA 反应 1 个小时 若底物 比 1 g多或少 可参照标准体系比例增加或减少酶用量 但增加酶用量时 需 注意不可加量过多 内切酶中通常含有甘油防冻剂 加入酶量过多 其中的 甘油会降低内切酶识别顺序的特异性 也可通过延长反应时间来保证完全的 酶切 2 星号活力 限制性内切酶在非标准反应条件下 切割一些与特异性识别顺序相类似的 顺序活性 该酶的第二活性 产生许多不想得到的片段 内切酶的识 别切割能力下降 识别特异性下降 引起星号活力的因素 过高的甘油含量 5 低盐离子强度 25mmol L 高 PH 值 8 0 含有有机溶剂 含有非 Mg 二价离子 酶量过大 酶解 1 g底物 DNA 用的内切酶大于 100 个活性单位 3 限制性内切酶底物位点优势效应 限制性内切酶对同一 DNA 片段切割时 在对其可以识别的位点上表现出不 同的切割速率的现象 4 限制性内切酶质量 有良好的酶活性 不存在任何其他核酸内切酶和外切酶的污染 长 时间的酶切反应不发生识别顺序特异性的降低 被某一酶切割后的 DNA 经重 新连接后 仍能被同一酶再次识别并再次切割 内切酶质量的鉴定 50 l反应体系中以等量内切酶分别以 1h 和 12h 过夜 时间来切割底物 DNA 用凝胶电泳检查酶切结果 若不出现条带数目的差别 则内切酶质量好 在 T4DNA 连接酶作用下 重新连接被内切酶切割后的 DNA 片段 再用同 一酶切割 若所产生的 DNA 片段的大小和数目和第一次切割的结果完全一样 则说明酶的质量好 可鉴定是否混有其他内切酶和磷酸脂酶 DNA 被内切酶切割后 只有各个片段的 3 OH 和 5 P 基团完好才能再次连接 连接的 DNA 仍能提供同一酶的相同切割位点 才会出现上面所说的两个完全 相同的结果 2 DNA 重组常用的其他酶类 1 DNA 聚合酶 DNA polymerase 将一个脱氧三磷酸核苷酸加到引物 primer 的 3 OH 上 再释放出一个 焦磷酸分子 ppi 1 大肠杆菌 DNA 聚合酶 E coli DNApolymerase 聚合酶 I II III 聚合酶 I II 主要参与 DNA 修复 III 主要参与 DNA 复制 三种都有沿模 板按 5 3 方向合成互补 DNA 链的活性和按 3 5 向的外切酶活性 聚合酶 I 还有 5 3 向的外切酶活性 5 3 聚合酶活性 填补 DNA 链上的缺口 或参与修复 DNA 合成过程中切 除 RNA 引物后留下的空缺部分 3 5 外切酶活性 消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸 5 3 外切酶活性 切除受损的 DNA 部分 Klenow 酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 109000Da 经舒替兰酶 枯草杆菌蛋 白酶 水解获得的 76000Da 片段 具有 5 3 聚合酶活性和 3 5 外切酶活性 可用于填补 DNA 单链末端成为双链 可用于合成 cDNA 第二链 切口平移 切口产生 3 羟基和 5 磷酸基团 DNA 延伸合成 3 端 5 端 被小片段降解 缺口位点沿着双链向 3 端移动 是在体外向 DNA 分子引入放 射性标记核苷酸的技术 2 噬菌体 DNA 聚合酶 T4 DNA 聚合酶 也具有 5 3 聚合酶活性和外切酶活性 外切酶活性比 大肠杆菌 DNA 聚合酶外切酶活性强 200 倍 可用于探针的放射性核素标记 3 噬热水生菌 DNA 聚合酶 从噬热水生菌 Themus aquaticus YT 1 菌株中分离得到 耐热 其中 Taq DNA 聚合酶使用最多 70 75 生物活性最高 在 75 80 条 件下 每个酶蛋白分子每秒可以延长 150 个核苷酸 被广泛应用于体外扩增 特异性 DNA 片段的技术 聚合酶链式反应 PCR 2 RNA 聚合酶 能利用 DNA 作为模板 催化四种核糖核苷三磷酸 NTP 底物合成 RNA I 核仁中 转录 rRNA 顺序 II 细胞质中 转录大多数基因 蛋白质基因和部分核内小 RNA 基 因 转录是需要 TATA 框 酶开始结合的位置 启动子 II 型转录单位特有的 当双链 DNA 分子的一条链上 产生切口时 E coli 聚合酶 I 就可以将核苷酸连接到切口 的 3 OH 末端 同时该酶具有 5 3 的核酸 外切酶活性 能从切口的 5 端除去核苷酸 由于在切去核苷酸的同时又 在切口的 3 端补上核苷酸 从而使切口沿 DNA 链向 3 端 移动 RNA 聚 合酶 III 细胞核质中 转录 tRNA 5SrRNA 基因等少数几个基因 核质 由单一密闭环状 DNA 分子反复回旋卷曲盘绕组成的松 散 网状结构 无核膜 核仁 3 DNA 连接酶 基因工程比用的工具酶 T4 DNA 连接酶 T4 DNA ligase Mg 2 依赖性酶 催化双链 DNA 上具有相邻的 3 羟基和 5 磷酸末端单链缺口的修复 以及 具有黏性末端或平端的 DNA 片段的端端连接的酶 DNA 连接既可发生在 DNA 分子之间 也可发生在分子内部 高浓度的 DNA 末端有利于分子间连接 低浓度则有利于环状 DNA 分子的形成 DNA 连接酶只能连接双链 DNA 而不能连接单链 DNA 4 反转录酶 逆转录酶 reverse transcriptase 以 RNA 为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补 DNA cDNA 的酶 需要 Mg2 Mn 2 作为辅助因子 反转录酶可用来把任何基因的 mRNA 反转录成 cDNA 拷贝 然后可大量扩 增插入载体后的 DNA 可用来标记 cDNA 作为放射性的分子探针 5 核糖核苷酸 A RNase A ribnuclease A 核酸内切酶 特异的攻击 RNA 上嘧啶残基的 3 端 切割与相邻核苷酸 形成的磷酸二酯键 产生 3 磷酸嘧啶核苷酸和以 3 磷酸嘧啶核苷酸结尾的寡 核苷酸 一类只有 20 个以下碱基的短链核苷酸的总称 寡核苷酸可以很容 易地与它们的互补对链接 所以常用作探针确定 DNA 或 RNA 的结构 高浓度时 可对单链 RNA 的任何位点进行切割 低浓度时 只切割 C 和 U 的位点 检测寡核苷酸片段中是否含有 C 和 U 有显著的细胞毒性 RNase A 可用于检测基因突变 利用 RNA 探针与突变基因形成 RNA DNA 杂交体时 突变点处不能产生碱基互补 局部单链 这一特点 用 RNase A 进 行切割 切割产物可通过跑变性胶得到分离 可用放射自显影等其他方法检查 片段数目及大小 从而推知发生突变的位点 RNA 探针可通过将相应的 DNA 片段克隆至含有 SP6 或 T7 启动子的载体中得到 在操作 RNA 的实验时一定要戴口罩和手套 RNase A 存在非常广泛 人唾 以 RNA 为模板时 在反转录酶 作用下 先合成单链 DNA ss DNA 再在反转录酶和 DNA 聚合酶 I 作用下 以单链 DNA 为模板合 成 发夹 型的双链 DNA ds DNA 最后在核酸酶 S1 作用下 切割 成两条单链 DNA 液 汗液中均含有 以避免有 RNase 的污染 所用的容器及蒸馏水也都必须 经去 RNase 处理 用 DEPC 处理 0 1 100 比例加 DEPC 37 12h 高温 5min 除去 DEPC 残留 含 Tris 的溶液不能用 0 1 DEPC 处理 DEPC 会和 Tris 的 氨基反应而降解 失去灭活 RNase 的能力 通常可改用 DEPC 处理过的水来配 DEPC 已配好的可用 1 DEPC 处理 不过会有 DEPC 残留 6 核糖核酸酶 T1 RNase T1 核酸内切酶 特异地攻击鸟苷酸 3 侧的磷酸基团 切割与其相邻核苷酸的 5 磷酯键 产生 3 磷酸鸟苷和以 3 磷酸鸟嘌呤核苷酸结尾的寡核苷酸 主要用于 RNA 测序和指纹图谱分析 也可和 RNase 合用 以除去样品中 RNA 除去 DNA RNA 杂交体中杂交体的 RNA 区 7 核糖核酸酶 H RNase H 核酸内切酶 水解 RNA DNA 杂交体中的 RNA 链 产生 5 磷酸寡核 苷酸和 5 磷酸核糖核苷 使 RNA 被切割后成为 DNA 聚合酶合成第二条 cDNA 的引物 形成 cDNA 8 脱氧核糖核酸酶 I DNase I deoxyribonuclease I 核酸内切酶 Mg2 条件下 随机切割单 双链 DNA 产生 5 磷酸末端的单脱氧核苷酸和 寡脱氧核苷酸 Mn 2 存在下能将双链 DNA 同时切断 是 DNA 片段化 其活性依赖于 Ca2 辅因子 活化剂 Mg2 抑制剂 螯合剂 EDTA 等 DNase 污染 用具要高温处理 样品中加 EDTA 抑制酶活性 或冰水中 灭活 用途 除去 RNA 样品中污染的基因组 DNA 转录反应后 DNA 模板的降 解 9 核酸酶 S1 nuclease S1 内切酶 高度单链特异 酶解单链 DNA 单链 RNA 产生 5 磷酸的单 核苷酸或寡核苷酸 对双链 DNA 双链 RNA 和 DNA RNA 杂交体相对不敏感 需要低水平的 Zn2 激活 PH4 0 4 3 抑制剂 螯合剂 EDTA 柠檬酸等 磷酸缓冲液 和 0 6 左右的 SDS 溶液 S1 核酸酶的水解功能可以作用于双链核酸分子的单链区 并从单恋部分切 断核酸分子 且这种单链区可以小刀只有一个碱基对的程度 去除 DNA 片段中突出的单链末端 切开合成 ds DNA 时形成的 发夹 结构 10 核酸酶 Bal 31 水解超螺旋 DNA 成开环状 进而成为线状 DNA 有外切酶活性 在 Mg2 Ca 2 参与下 能从 DNA 双链两端连续向中间切 割水解 可用于 DNA 链的限制性内切酶切割位点分析 绘制 DNA 限制图谱 缩 短 DNA 片段 11 核酸外切酶 exonuclease 是具有从 DNA 分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的 酶 两种 水解磷酸二酯键的 5 端生成 3 单核苷酸的酶 水解磷酸二 酯键的 3 端生成 5 单核苷酸的酶 大肠杆菌核酸外切酶 I II 和 III 核酸外切酶 III 从双链 DNA3 OH 逐一降解切除 5 单核苷酸 不降解单链 DNA 或 3 突出的双链 DNA 具有多种酶活性 对无嘌呤 DNA 特异的 核酸内切酶活性 3 磷酸酶活性 3 外切酶活性 RNase H 活性 核酸外切酶 III 与核酸酶 S1 合用可使克隆的 DNA 分子产生缺失 delection DNA 链上一个或一段核苷酸的消失 核酸外切酶 III 与底 物的每次结合 只切除最末的几个核苷酸 从而使双链 DNA 产生渐进缺失 最 适底物 平末端或 3 凹陷末端 DNA 3 突出末端抵抗该酶的切割 抗拒程 度岁 3 突出末端的长度而改变 4 碱基完全不能被切割 对于一端是 抗性位点 3 突出端 一端是敏感位点 5 突出端或平末端 的线性 DNA 分子 可以产生单向缺失 Eg 将双链 DNA 用产生不同末端的限制性内切酶双酶切后 利用 Exo III 的 3 5 的外切酶活性 从一端降解 得到互补的单链 DNA 和 5 单核苷酸 与 Bal 31Nuclease 相比 碱基特异性小 如在富含 GC 的位置上 由于反应停止 的机率较低 可用于 DNA 的 Delection 制作 12 多核苷酸激酶 polynucleotide kinase 催化磷酸基从 ATP 转移到 DNA RNA 寡核苷酸等分子的 5 羟基末端 用途 对缺乏 5 磷酸的 DNA 或合成接头磷酸化 对 5 OH 末端进行同位素标记 标记底物为 r 32P ATP 一般天然存在的核酸不存有 5 羟基而有 5 磷酰基 标记时 应先用碱性磷酸酯酶将 5 磷酰基除去 脱磷 13 碱性磷酸酯酶 alkaline phosphatase 除去 DNA RNA 的 5 磷酰基 防止片段间彼此连接 自身环化 标记 5 前除去 DNA 或 RNA 的 5 磷酰基 14 末端转移酶 TdT terminal deoxynucleotide transferase 一种不需要引物就能将脱氧核苷三磷酸 dNTP 加到某 DNA 片段上 3 OH 上的酶 可进行 DNA3 末端加尾和标记