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第1节基因工程概述【学习目标】1、说由基因工程的概念（A）2、简述基因工程的诞生历程（A）3、说由DNA重组技术所需的三种基因工具的作用（ A）4、简述基因工程基本操作程序的四个步骤（B）【基础梳理】一、基因工程的概念是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入 受体细胞并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类所需的基因产物的技术。（1）操作环境：生物体外（2）操作对象：基因（3）操作水平：DNA 分子水平（4）基本过程：剪切-拼接-导入-表达（5）结果：人类需要的基因产物二、基因工程的工具及作用（一）限制性核酸内切酶（简称限制酶） “分子手术刀”1、：主要是从原核生物中分离纯化由来的。2、作用：能够识别双链 DNA分子的某种特定的核昔酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核昔酸之间的磷酸二酯键断开。3、特点：具有专一性，表现在两个方面：识别双链DNA分子的某种特定的核昔酸序列。切割特定序列中的特定位点。4、结果：经限制酶切割产生的 DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。例1、下列有关基因工程中限制内切酶的描述，错误的是（）A . 一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核昔酸序列B.限制性内切酶的活性受温度的影响C .限制性内切酶能别和切割 RNAD.限制性内切酶可从原核生物中提取（二）DNA连接酶 “分子针线”1、分类：根据酶的不同，可分为ECOliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2、作用：恢复被限制酶切开了的两个核甘酸之间的磷酸二酯键。【疑难解析】1、两种DNA连接酶（EcoliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶）的比较：（1）相同点：都缝合磷酸二酯键（2）区别：E. coIiDNA连接酶于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T DNA连接酶于T噬菌体能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 442、DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接的DNA来双链单链XXK模板不要模板要模板连接的对象2个DNA片段单个脱氧核甘酸加到已存在的单链DNA片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质(三)载体分子运输车”1、载体的作用：载体是基因运输工具，在基因操作过程中，使用载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制2、载体必须具备三个条件：(1)能在受体细胞中复制并稳定保存。(2)具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。(3)具有某些标记基因，以便进行筛选。3、载体的种类： 质粒、噬菌体 和 动、植物病毒 等。最早应用最常应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子三、基因工程的基本过程 (一)获得目的基因(目的基因的获取)1、获取方法主要有两种：(1)从自然界中已有的物种中分离由来，如可从基因文库中获取(2)用人工的方法合成。获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法2、利用PCR技术扩增目的基因(1) PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术(2)目的：获取大量的目的基因(3)原理：DNA双链复制(4)过程：第一步：加热至 9095 cDNA解链为单链;第二步：冷却到5560 C,引物与两条单链DNA结合;第三步：加热至(5)特点：指数形式扩增7075 C,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。质粒DNA分子、_产F种限制酩处理一个仞口两个切口两个黏性末端菽程目的基因TdhaISSBS重组DNA分子集组质粒)(二)制备重组DNA分子(基因表达载体的构建)1、重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选由来。2、方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用 DNA连接酶把两者连接。(三)转化受体细胞(将目的基因导入受体细胞)1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2、常用的转化方法：(1)将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术(农杆菌转化法)，其次还 基因枪介导转化技术(基因枪法)和花粉管通道技术(花粉管通道法)。(2)将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。(3)将目的基因导入微生物细胞：Ca2 +处理法。例2、以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题。(1)获得目的基因的方法通常包括 和。(2)切割和连接 DNA分子所使用的酶分别是 和。(3)运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或1；后者的形状成1。BamJ I在coK LHint! IllII，。4GGATCCGAATTC AAGC1TAGATCTCGTAGGCTTAAG TTCGAATCTAGAKAAA(4)由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率,所以在转化后通常需要进行年作。(5)将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与醉母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和序列上是相同的。(四)筛选由获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达(目的基因的检测与鉴定)1、分子水平的检测(1)首先要检测转基因生物的染色体 DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。(2)其次还要检测目的基因是否转录由mRNA ,方法是采用RNA分子杂交技术。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原一抗体杂交技术。DNA提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的 DNA ,然后高温解成单链，再与同位素标记的探针杂交；抗原-抗体杂交所用到的抗体是用表达生的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体, 并提取由而来的2、个体生物学水平的鉴定有时还需进行个体生物学水平的鉴定，如抗虫或抗病的鉴定等。四、基因工程的意义：能够打破生物种属的界限（即克服远源杂交不亲和的障碍，）在分子水平上定向 改变生物的遗传特性。【基础检测】1 .下列关于基因工程的叙述中错误的是（）A.基因工程的由现使人类有可能按照自己的意愿定向改造生物，培育新品种B.基因工程技术是唯一能冲破远源杂交不 亲和障碍，培育生物新类型的方法C.基因工程的基本工具是：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和基因的运载体D.基因工程的研究成果，目前大多需要通过发醉工程和酶工程来实现产业化2 .基因工程技术也称为 DNA重组技术，其实施必须具备四个必要的条件是（）A.目的基因、限制性内切酶、运载体、体细胞B.重组DNA、RNA聚合酶、内切酶、连接酶C.模板DNA、信使RNA、质粒、受体细胞D.工具酶、目的基因、运载体、受体细胞3 .两个核酸片段在适宜条件下，经 X酶的作用，发生了如下变化，则 X酶是（）A. DNA连接酶A-C-GA-A-T T -C-Gr I Ii :!TT-AAjG-C-A |x酶 小C-C-A AT- TT i g I rttii1Ii tIvvIIif -)CT-T -AAfr* C -AB. EcoR I 酶.C. DNA聚合酶D.限制酶4 .下图为四种限制酶 BamHI、EcoRI、ttindlll和B硝辨的识别序列。它们切割由来的DNA黏性末端可以互补配对的是（A. BamH I 和 Bgl nB. BamHI 和 Hind 出C. BamH I 和 EcoR ID. EcoR I 和 Hind 出5.限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对 GAATTC专一识别的限制酶,打断的化学键是（A. G与A之间的键B. G与C之间的键C. T与A之间的键D.磷酸与脱氧核糖之间的键6.将单个脱氧核昔酸连接到脱氧核昔酸链上的酶是A. DNA连接酶B. DNA 酶C. DNA解旋酶D.DNA聚合酶7.8.（多选）基因工程的运载体必须具备的条件是（用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是（A.通过害虫吃棉叶看其是否死亡B.目的基因片断与DNA探针能否形成杂交带C.目的基因转录形成的 mRNA与DNA探针能否形成杂交带D.目的基因表达产物蛋白质能否与抗体形成杂交带A .能在爻体细胞内复制并保存B.具有多个限制酶切点C.有特殊的遗传标记基因D.环状的DNA分子9.（多选）下列哪些可作为基因工程技术中常用的基因运载工具（A.大肠杆菌B.质粒C.动物病毒D.线粒体10.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用 耐盐基因培育生了耐盐水稻新品系。(1)获得耐盐基因后，构建重组 DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。(填“ a成).一 法 C(2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 1(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。该技术的核心是和。(4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。C T G C A Gb-； J ； i I bP e a e e t _c 【能力提升】1 .下列关于基因工程的说法正确的是()基因工程的设计和施工都是在分子水平上进行的目前基因工程中所有的目的基因都是从供体细胞直接分离得到的基因工程能使科学家打破物种界限，定向地改造生物性状只要检测由受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功地进行表达A.B.C.D.2 .在基因工程中，科学家所用的“剪刀”、“针线”和“载体”分别是指（）A.大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶B.噬菌体、质粒、DNA连接酶C.DNA限制酶、RNA连接酶、质粒D.DNA限制酶、DNA连接酶、质粒3 .镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是（）A.解旋酶B. DNA连接酶C.4 .已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。如果在该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生 a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述限制性内切酶D、RNA聚合酶b线性DNA分子的陶切示意线性DNA分子，若在每个 DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的 DNA片段种类数是（A. 3B. 4C. 95 .农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是（A. Ti质粒上B.受体细胞染色体 DNA上 C. T-DNAD.农杆菌的拟核6 .下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内含质粒A,也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是（）A .将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法或基因枪法B.将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨节青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的 细菌C.将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌D .目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨节青霉素的培养基上生长7 .利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（）A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因8 .大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D.醉母菌细胞中提取到人干扰素蛋白8 .基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对 的是（）A.人工合成目的基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达9 .（多选）下列关于限制性 核酸内切酶的叙述中，正确的是（）A.它能在特殊位点切割 DNA分子B.同一种酶切割不同 DNA产生的黏性末端能够很好地进行碱基配对C.它能任意切割DNA ,从而产生大量 DNA片段D.每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核昔酸序列10 .（多选）获得目的基因的方法有（）A.构建基因文库，从基因文库中获取B.利用人工合成法C.利用PCR技术大量获得D.利用农杆菌转化法获得11 .（多选）在将一段DNA片段插入到一个大肠杆菌质粒上时，需要下列的物质有（）A. DNA连接酶B.限制性核酸内切酶D.噬菌体C. DNA解旋酶12.番茄营养丰富，是人们喜爱的一类果蔬。但普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制细 胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐贮藏。为满足人们的生产生活需要, 科学家们通过基因工程技术，培育由了抗软化、保鲜时间长的番茄新品种。(操作流程如图)请回答:(1)O4出 (RMN.过程需要的艮电性内切酶和 - It * 餐 ft K M ff在构建基因表达载体时，除了重穿苟敦化过程陪T示意困一；DNA中插入音的基因外，还需要有_终止子以及(3)在番茄新品种的培育过程中，将目的基因导入受体细胞的方法叫做(4)从图中可见，mRNAI和mRNA2的结合直接导致了 无法合成，最终使番茄获得了抗软化的性状。(5)普通番茄细胞导入目的基因后，先要接种到诱导培养基上培养，脱分化后得到 然后再转 接到分化培养基上，诱导由试管苗，然后进一步培养成正常植株。参考答案例 2、答案：（1）化学合成（人工合成） 酶切获取（从染色体DNA 分离 /从生物细胞分离） （2）限制性核酸内切酶（限制酶） DNA 连接酶（连接酶） （ 3 ）质粒 小型环状（双链环状、环状）（ 4 ）低 筛选 （ 5 ）氨基酸10. 答案： （1）a a（2）基因枪法（花粉管通道法）（3）植物组织培养（1 分） 脱分化（去分化） 再分化（4） 耐盐基因（目的基因） 一定浓度的盐水浇灌（移裁到盐碱地中）12 （ 6分）（1） DNA 连接酶（ 2）启动子标记基因（ 3 ）农杆菌转化法（ 4 ）多聚半乳糖醛酸酶（ 5 ）愈伤组织
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