血浆,血清及体液蛋白质组学

1血浆/血清蛋白质组学和体液蛋白质组学研究进展 何於娟硕士生学位课程：蛋白质组学2n人类蛋白质组组织人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization, HUPO) n人血浆蛋白质组计划人血浆蛋白质组计划(Human Plasma ProteomeProject, HUPO PPP)n人肝脏蛋白质组计划人肝脏蛋白质组计划(Human Liver Proteome Project,HLPP ) 3n、血浆/血清蛋白质组学n、尿蛋白质组学n、唾液蛋白质组学n、脑脊液蛋白质组学4、血浆/血清蛋白质组学5n人血液中的蛋白质来源几人血液中的蛋白质来源几乎与所有细胞、组织、器乎与所有细胞、组织、器官有关，可以直接反映机官有关，可以直接反映机体的病理、生理状态，所体的病理、生理状态，所以是发现各种疾病相关生以是发现各种疾病相关生物标志物的最有价值的标物标志物的最有价值的标本，受到人们的广泛关注本，受到人们的广泛关注这是这是2006-12-22由由Wiley-VCH出版的人血浆蛋白质学的专著出版的人血浆蛋白质学的专著6Clinical proteomics: Written in blood LANCE A. LIOTTA, MAURO FERRARI & EMANUEL PETRICOIN. Nature 425, 905 (30 October 2003)n血液中含有许多还不曾研究过的生物标血液中含有许多还不曾研究过的生物标志物，这些标志物能够反映出所有组织志物，这些标志物能够反映出所有组织的生理状态。机体中的每一个细胞都可的生理状态。机体中的每一个细胞都可能将反映这种生理状态的记录以排泄物能将反映这种生理状态的记录以排泄物或信号分子的形式释放到血液中。或信号分子的形式释放到血液中。7n目前，常规的血液检查仅仅能反映血液目前，常规的血液检查仅仅能反映血液所携带信息中的很少的部分。在疾病的所携带信息中的很少的部分。在疾病的早期诊断方面，人们迫切需要发现更为早期诊断方面，人们迫切需要发现更为有效的疾病标志物，遗憾的是，迄今为有效的疾病标志物，遗憾的是，迄今为止，为人们所公认的新的疾病标志物的止，为人们所公认的新的疾病标志物的数量极少。数量极少。8n血浆蛋白质组是最复杂的人类蛋白质组，其中血浆蛋白质组是最复杂的人类蛋白质组，其中包含着不同组织的亚蛋白质组。包含着不同组织的亚蛋白质组。Plasma PreteomePlasma is the largest,and deepest, version of the human proteomeLargest = Most proteinsDeepest = Widest dynamic range9血浆中的蛋白质 n血浆大约含有血浆大约含有7%的蛋白质的蛋白质，1%的其它物质，的其它物质，92%的水分。这些蛋白质包括维持机体正常生理的水分。这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质，各种病理、生理状态下机体细胞状态的蛋白质，各种病理、生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质。和组织分泌、脱落的蛋白质。n血浆蛋白质几乎包含了身体内所有的蛋白，总数血浆蛋白质几乎包含了身体内所有的蛋白，总数估计在估计在10,000种甚至更多。种甚至更多。n所含蛋白总量达到所含蛋白总量达到60-80mg/ml。从质量上看，。从质量上看，血浆中总蛋白量的血浆中总蛋白量的99%由为数不多的由为数不多的22种高丰度种高丰度蛋白蛋白所占有。所占有。n血浆中蛋白质浓度是在一个血浆中蛋白质浓度是在一个高动态范围高动态范围内（内（912个数量级个数量级）变动）变动从从3550 mg/ml的血清的血清白蛋白，到白蛋白，到110 pg/ml或更低的趋化因子。或更低的趋化因子。10n1、组成性蛋白组成性蛋白：主要指肝脏和小肠的分泌蛋白，它：主要指肝脏和小肠的分泌蛋白，它们在血浆中发挥作用，如白蛋白等；们在血浆中发挥作用，如白蛋白等；n2、免疫球蛋白免疫球蛋白(IgsA,M,G,D,E)：血浆中大约含有数血浆中大约含有数百万种抗体；百万种抗体；n3、组织渗漏蛋白组织渗漏蛋白：是因组织新陈代谢或发生病理改：是因组织新陈代谢或发生病理改变导致细胞损伤、死亡而进入血液的蛋白质，这些蛋变导致细胞损伤、死亡而进入血液的蛋白质，这些蛋白质可用于疾病的诊断及愈后评价，如心肌钙蛋白白质可用于疾病的诊断及愈后评价，如心肌钙蛋白(cardiac troponins)，或心肌红蛋白，或心肌红蛋白(myoglobin)用用于诊断心肌梗塞；于诊断心肌梗塞；n4、“远距离远距离”受体和配体受体和配体：包括肽类及蛋白质类激：包括肽类及蛋白质类激素，如胰岛素等；临时信使，如非激素类的蛋白，经素，如胰岛素等；临时信使，如非激素类的蛋白，经血流转移至靶部位而起作用血流转移至靶部位而起作用血浆蛋白质的组成从功能的角度可分为以下几类：受体是细胞表面或亚细胞组分中的一种分子，可以识别并特异地与有生物活性的受体是细胞表面或亚细胞组分中的一种分子，可以识别并特异地与有生物活性的化学信号物质（配体）结合，从而激活或启动一系列生物化学反应，最后导致该化学信号物质（配体）结合，从而激活或启动一系列生物化学反应，最后导致该信号物质特定的生物效应。信号物质特定的生物效应。11n5、“局部局部”作用的受体和配体作用的受体和配体，包括细胞因子及，包括细胞因子及细胞反应调节因子，细胞反应调节因子，e.g., IL-8 ；n6、异常分泌蛋白异常分泌蛋白，如前列腺特异性抗原（，如前列腺特异性抗原（PSA）等肿瘤相关蛋白；等肿瘤相关蛋白；n7、一过性通过蛋白一过性通过蛋白，如脂蛋白、溶酶体蛋白酶；，如脂蛋白、溶酶体蛋白酶；n8、外源蛋白外源蛋白，如异常微生物、寄生虫、病毒的病，如异常微生物、寄生虫、病毒的病原蛋白或它们存留血液而释放的蛋白；原蛋白或它们存留血液而释放的蛋白；n9、小分子量的蛋白及多肽组份，主要是细胞因子、小分子量的蛋白及多肽组份，主要是细胞因子、多肽类激素及较大蛋白的蛋白酶降解片断。多肽类激素及较大蛋白的蛋白酶降解片断。12血浆中丰度最高的22种蛋白质A. 人血浆中十种丰度最高的蛋白质，人血浆中十种丰度最高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约它们占有总蛋白质量的大约90%。B. 人血浆中十二种丰度较高的蛋白质，人血浆中十二种丰度较高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约它们占有总蛋白质量的大约9%。 占质量数占质量数1%的蛋白的蛋白质，其数质，其数量很多、量很多、含量很低，含量很低，却又是我却又是我们十分关们十分关注的。注的。13血浆中丰度最高的22种蛋白质nA包括：包括：清蛋白清蛋白(Albumin)、IgGs、运铁蛋白、运铁蛋白(Transferrin)、纤维蛋白原纤维蛋白原(Fibrinogen)、IgAs、-2-巨球蛋白巨球蛋白(Alpha-2-Macroglobulin)、IgMs、-1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶(Alpha-1-Antitrypsin)、补体、补体C3(Complement C3)、结合珠蛋白、结合珠蛋白(Haptoglobin)等十种。等十种。nB包括：包括：载脂蛋白载脂蛋白A1(Apolipoprotein A1)、载脂蛋白载脂蛋白A2(Apolipoprotein A2)、载脂蛋白载脂蛋白B(Apolipoprotein B)、酸性酸性-1-糖蛋白糖蛋白(Acid-1-Glycoprotein)、血浆铜兰蛋白血浆铜兰蛋白(Ceruloplasmin)、补体、补体C4(Complement C4)、补体、补体C1q(Complement C1q)、IgDs、前清蛋白前清蛋白(Prealbumin)、血纤维蛋白溶酶原血纤维蛋白溶酶原(Plasminogen)、H因子因子(Factor H)、脂蛋脂蛋白白a(Lipoproteina)等十二种。等十二种。14TPA, tissue plasminogen activator; GCSF, granulocyte colony-stimulating factor; TNF, tumor necrosis factor.Reference intervals for 70 protein analytes in plasma.Dynamic range of 2-D gels or LC/MSClassical Plasma ProteinsTissue LeakageInterleukins,etcHemoglobin is included for comparison15Reference intervals for 70 protein analytes in plasma.nAbundance is plotted on a log scale spanning 12 orders of magnitude. Where only an upper limit is quoted, the lower end of the interval line shows an arrowhead. nThe classical plasma proteins are clustered to the left (high abundance).nThe tissue leakage markers (e.g. enzymes and troponins) are clustered in the center.nCytokines are clustered to the right (low abundance).nHemoglobin is included (far left) for comparison. 16相对分子质量（相对分子质量（kDa）蛋白质数量蛋白质数量Histogram of the calculated masses of the processed forms of 289 proteins observed in plasma 从相对分子质量的分布看，曾有研究工作对血浆中289种蛋白质的分子量分布进行了统计，表明10100 kDa的蛋白质占有相当大的比例，其中： 18% 20 k Da 69% 60 k Da Kidney Passed Retained17 识别蛋白质的数量（对数尺度）识别蛋白质的数量（对数尺度） 年年 图中，有点的1-D曲线表明在上个世纪三十至七十年代，使用传统的一维技术识别蛋白质数量的能力是有限的；有点的2-D曲线表明在上个世纪七十年代至二十一世纪初，使用二维技术明显提高了识别蛋白质的能力；有点的3+-D曲线表明在未来使用三维技术还会大大提高识别蛋白质的能力。有点的曲线表明基于测序法鉴定蛋白质的能力；而250*和490+则表示分别使用LC/LC/2-DE和LC/LC/MS/MS所达到的鉴定蛋白质的能力。 18血浆/血清蛋白质组研究的难度很大n血浆血浆/ /血清蛋白血清蛋白来源广泛、种类和数量多、丰度差异大、来源广泛、种类和数量多、丰度差异大、动态范围宽动态范围宽, , 这些特点给血浆这些特点给血浆/ /血清蛋白全谱蛋白的分血清蛋白全谱蛋白的分离、检测和运用差异蛋白组学筛选肿瘤的生物标志物离、检测和运用差异蛋白组学筛选肿瘤的生物标志物都带来了很大的挑战。都带来了很大的挑战。n目前，在比较蛋白质组学研究中，已有多种技术路线目前，在比较蛋白质组学研究中，已有多种技术路线可以用于鉴定上千种甚至更多的哺乳动物细胞或组织可以用于鉴定上千种甚至更多的哺乳动物细胞或组织来源的蛋白质，为在较宽的动态范围内得到重要的差来源的蛋白质，为在较宽的动态范围内得到重要的差异蛋白质提供了保证。异蛋白质提供了保证。n但是，但是，同样的技术路线用于血浆蛋白质组的研究，可同样的技术路线用于血浆蛋白质组的研究，可鉴定的蛋白质数目要少得多，鉴定的蛋白质数目要少得多，说明血浆蛋白质组研究说明血浆蛋白质组研究的难度很大。的难度很大。19血浆/血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题1、样品的选择、样品的选择2、样品的收集与贮存、样品的收集与贮存3、去除高丰度蛋白和分级技术、去除高丰度蛋白和分级技术4、多维策略的运用、多维策略的运用20样品的选择n血浆和血清血浆和血清都可以用于常规的生化实验都可以用于常规的生化实验室检查，虽然大多数情况下用血清的比室检查，虽然大多数情况下用血清的比较多，但是多数情况下用血浆替换血清，较多，但是多数情况下用血浆替换血清，结果差异不大。结果差异不大。n在在蛋白质组学研究中，选用血清或血浆蛋白质组学研究中，选用血清或血浆的结果差异却很大，的结果差异却很大，目前没有足够的资目前没有足够的资料表明选用血浆还是血清更为有利。料表明选用血浆还是血清更为有利。21样品的收集与贮存n收集管收集管：商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质：商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质谱测定或数据；还可能含有一些促凝或抗凝物质；可能还谱测定或数据；还可能含有一些促凝或抗凝物质；可能还会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆/血清中低丰度蛋白的血清中低丰度蛋白的鉴定。鉴定。 n抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度。 n贮存贮存：研究表明存放在室温下：研究表明存放在室温下4小时或小时或6小时，其变化小时，其变化很小，但很小，但8小时后、特别是小时后、特别是24小时后小时后质谱分析结果有明显质谱分析结果有明显变化。对于在变化。对于在4下下的结果与室温下结果差不多的结果与室温下结果差不多,但随着时但随着时间推移到间推移到48小时或小时或96小时，就有非常显著的变化；长期小时，就有非常显著的变化；长期存放在存放在-20，-80，或液氮中，或液氮中没有太大的变化，但没有太大的变化，但反复反复冻融冻融次数增加却有很大影响。次数增加却有很大影响。 3 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 03 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 0025507530004000500060007000025507530004000500060007000025507530004000500060007000FreshPlasma4 hours8 HoursMarshall et al., 2006 Qualitative and quantitative changes to protein profile23HUPO recommendationsnPlatelet-depleted plasma is preferable to serum for certain peptidomic studies.(如果进行肽组学研究，则优如果进行肽组学研究，则优先选择去除血小板的血浆）先选择去除血小板的血浆）nSamples should be aliquoted and stored in liquid nitrogen.（样品应分装并贮存在液氮中样品应分装并贮存在液氮中）nThe addition of protease inhibitors is recommended, but should be incorporated early and used judiciously, as some form non specific protein adducts and others interfere with peptide studies.(推荐使用蛋白酶抑制剂，推荐使用蛋白酶抑制剂，但是应在早期合理地使用；应注意抑制剂可能某些非特但是应在早期合理地使用；应注意抑制剂可能某些非特异蛋白会形成加合物，还可能干扰肽的研究）异蛋白会形成加合物，还可能干扰肽的研究）nThe diligent tracking of pre-analytical variables. （应追（应追踪样品在分析前的变化）踪样品在分析前的变化）24HUPO PPP在先期研究中采用了统一的参考样本标准 n1)血浆或血清参考样本收集处血浆或血清参考样本收集处理理必须在必须在2h小时内完成小时内完成；n2)血浆采用用加入血浆采用用加入1.0ml枸橼酸枸橼酸钠钠(0.105mol/L)抗凝剂抗凝剂(与血的与血的比例为比例为1:9)或者采用喷雾干燥或者采用喷雾干燥的的EDTA为抗凝剂；血清在室温为抗凝剂；血清在室温下下30min内用内用微粉硅胶微粉硅胶促凝后促凝后分离。分别收集分离。分别收集10ml。n3) 分离在分离在2-6下操作下操作(枸橼酸枸橼酸血浆，血小板计数要小于血浆，血小板计数要小于130/ul) 。离心后混合即分装到。离心后混合即分装到250ul硅烷化硅烷化EP管中，管中，-70保保存。存。n4) 无无HIV、HBV、HCV、HTLV-1(人类人类T细胞亲淋巴病细胞亲淋巴病毒毒1型型)、梅毒，无任何肝损、梅毒，无任何肝损伤。伤。n5)整个过程整个过程不加不加cocktail等蛋等蛋白酶抑制剂。白酶抑制剂。n6)所有所有供血者应清晨空腹取供血者应清晨空腹取血；血；24h内无服药和酒。内无服药和酒。n此后的血浆蛋白质组学研究此后的血浆蛋白质组学研究大多采用了这一套程序。大多采用了这一套程序。Tirumalai R.S., Chan K.C., Prieto D.A.,et al. Characterization of the Low Molecular Weight Human Serum Proteome. Mol Cell Proteomics.2003,2: 1096-110325用于蛋白质质谱分析的血液标本的处理、运送、操作及储存的标准条件建议n4下处理血液标本，下处理血液标本，2h内尽快分离血清及细胞。内尽快分离血清及细胞。n用用U9缓冲液缓冲液 (9mol Urea, 2%CHAPS, 1%DTT) 稀释稀释血清后，可以血清后，可以24h内在室温下运送或对血清及内在室温下运送或对血清及WCX（弱阳离子交换）磁珠结合过程进行操作。（弱阳离子交换）磁珠结合过程进行操作。n血清应分装并长期储存在血清应分装并长期储存在-80，但限冻融，但限冻融1次。次。n溶血标本应弃用，建议重新取血。溶血标本应弃用，建议重新取血。 刘建栋 等。血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床, 2007, 27(2)193-197CHAPS: 3-(3-胆酰胺丙基)-二乙胺-丙磺酸, 两性离子表面活性剂DTT: 二硫苏糖醇(dithiothreitol), 还原剂26去除高丰度蛋白n血浆中的高丰度蛋白在很大程度上干扰了血浆中的高丰度蛋白在很大程度上干扰了低丰度蛋白的检测。低丰度蛋白的检测。n因此，从血清因此，从血清/血浆中获得标志性蛋白质的血浆中获得标志性蛋白质的首要的一步就是如何去除其中的高丰度蛋首要的一步就是如何去除其中的高丰度蛋白。白。27High Abundance Proteins in Plasma or Serum Limit Detection of Minor ComponentsA: AlbuminB: TransferrinC: Apo A-I lipoproteinD: Haptoglobin -chainE: 1-AntitrypsinPPI Website Oct 2002，Plasma Proteome Institute28肝癌患者血浆的2-DE分离结果IPG4-7A:原血B:低丰度蛋白IPG4-7未去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果29n迄今为止，还缺乏一种能够解决所有蛋白纯化问题的迄今为止，还缺乏一种能够解决所有蛋白纯化问题的技术和方案，但是，近年来已有越来越多的技术用于技术和方案，但是，近年来已有越来越多的技术用于血清血清/血浆中高丰度蛋白的去除，方案也逐渐趋于成熟血浆中高丰度蛋白的去除，方案也逐渐趋于成熟n目前，对血清目前，对血清/血浆样品的处理一般的看法是，研究人血浆样品的处理一般的看法是，研究人员可以员可以选择几种不同的分离和纯化技术，进行优化组选择几种不同的分离和纯化技术，进行优化组合。合。目前市场上也针对种多元化（目前市场上也针对种多元化（multi-pronged）策略推出了各种商品化的技术和方法，使得研究人员策略推出了各种商品化的技术和方法，使得研究人员更方便地针对一些蛋白样品或者上游和下游技术设计更方便地针对一些蛋白样品或者上游和下游技术设计实验。实验。30n目前，目前，利用亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性利用亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离分离是主要的方法，常用的有是主要的方法，常用的有基于抗体的亲和法和基基于抗体的亲和法和基于染料的亲和法于染料的亲和法。n抗体亲和法利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中抗体亲和法利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白。血浆中的高丰度蛋白。n染料亲和法通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的染料亲和法通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除血浆中的高丰度蛋白，静电、疏水及氢键相互作用去除血浆中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。其特异性相对较低。n已有数种方法实现了已有数种方法实现了商品化商品化，分别可以去除，分别可以去除2种、种、6种、种、12种或种或20种高丰度蛋白。种高丰度蛋白。 31亲和柱去除高丰度蛋白nProteomeLab IgY蛋白质组分组分离系统蛋白质组分组分离系统(Beckman Coulter 公司公司 ) nProteoExtract Albumin/IgG高丰度蛋白去除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒 (MERCK公司公司 )nAurumSerum高丰度蛋白高丰度蛋白去除试剂盒去除试剂盒(Bio-Rad公公司司 ) n安捷伦安捷伦高丰度蛋白高丰度蛋白去除柱（去除柱（Agilent Multiple Affinity Removal Column，MARC） nProteoPrep20 Plasma Immunodepletion Kit (PROT-20)去除血浆中去除血浆中20种高丰度蛋白的实验方案种高丰度蛋白的实验方案(Sigma-Aldrich公司公司 ) 32HHLLLLLLLLLL人体血清人体血清 样本样本低丰度蛋白低丰度蛋白HHHHHHHLLLLL高丰度蛋白高丰度蛋白(白蛋白白蛋白,免疫球蛋白免疫球蛋白G, 免疫球蛋白免疫球蛋白A, 转铁蛋白转铁蛋白, 结合珠蛋白结合珠蛋白, 抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶)低丰度蛋白低丰度蛋白( (疫病生物标记和药物靶点疫病生物标记和药物靶点) )H蛋白清除专用柱 6种高丰度蛋白种高丰度蛋白同时清除同时清除33血清/血浆中高丰度蛋白的清除柱抗抗- -白蛋白白蛋白- -树脂树脂抗抗- -转铁蛋白转铁蛋白- -树脂树脂抗抗- -结合珠蛋白结合珠蛋白- -树脂树脂抗抗- -1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶-树脂树脂抗抗- 免疫球蛋白免疫球蛋白A-树脂树脂抗抗- 免疫球蛋白免疫球蛋白G-树脂树脂每种抗体以特定比率混合后，装填成色谱柱的形式每种抗体以特定比率混合后，装填成色谱柱的形式34血清/血浆中高丰度蛋白的去除其他 15%白蛋白54.31%免疫球蛋白 G16.61%-1-抗胰蛋白酶 3.83%免疫球蛋白 A 3.45%转铁蛋白 3.32%结合珠蛋白 2.94%1DGE or 2DGE蛋白表达蛋白表达药物靶点药物靶点疾病标注疾病标注定性分析定性分析35分级技术n在使用蛋白质组学技术之前对在使用蛋白质组学技术之前对血浆蛋白进行预分离，血浆蛋白进行预分离，可以降低血浆样品的复杂度，改善可以降低血浆样品的复杂度，改善2-DE分离血浆蛋白分离血浆蛋白的效果，有利于分离鉴定血浆中的低丰度蛋白。的效果，有利于分离鉴定血浆中的低丰度蛋白。n常用的血浆蛋白预分离的方法包括常用的血浆蛋白预分离的方法包括二维液相色谱二维液相色谱(2D LC)，尺寸排阻色谱，尺寸排阻色谱/反相高效液向色谱反相高效液向色谱(SECRP-HPLC)，阳离子交换色谱，阳离子交换色谱/反相高效液向色谱，二维毛反相高效液向色谱，二维毛细管电泳细管电泳(2D CE)，Zoom IEF组分分离、组分分离、Gradflow及及自由流电泳（自由流电泳（FFE）等。）等。 2D1D3D4DPlasm/SerumPlasm/SerumPlasm/SerumPlasm/Serum1 LC-MS/MSrun20-40 LC-MS/MS runs100-150 LC-MS/MS runs100-150 LC-MS/MS runs1D SDSPAGEMicroSol-IEF1D SDSPAGE1D SDSPAGEMicroSol-IEFMajor ProteinDepletion100 800-10002000+2800+UniqueProteins多维策略在血浆蛋白质组鉴定中的优势 MicroSol-IEF：microscale solution IEF 微量等电聚焦电泳37当前临床蛋白质组学的研究重点之一就是从血液样品中发现生物标志物。n1、血浆、血浆/血清是临床检血清是临床检查最主要的样本来源，查最主要的样本来源，对疾病诊断和疗效监测对疾病诊断和疗效监测具有重要的意义；具有重要的意义；n2、血浆蛋白取材方便，、血浆蛋白取材方便，能够获得足够的研究样能够获得足够的研究样本，容易标准化；本，容易标准化；n3、血浆蛋白的性质具有、血浆蛋白的性质具有很大的动态范围；很大的动态范围；n4、多数血浆蛋白的表达多数血浆蛋白的表达水平与其相应的水平与其相应的mRNA表达水平间的相关性很表达水平间的相关性很差；且蛋白质普遍存在差；且蛋白质普遍存在糖基化、磷酸化等翻译糖基化、磷酸化等翻译后修饰现象。因此，只后修饰现象。因此，只能从蛋白质水平上开展能从蛋白质水平上开展研究。研究。38生物标志物（Biomarkers）n生物标志物或称生物标记，生物标志物或称生物标记，原指表示机体失衡时的体原指表示机体失衡时的体温、血压或心率等生理指标，用来作为反映疾病症状温、血压或心率等生理指标，用来作为反映疾病症状的直接性证据。后来，该词语还表示可检测的外来物的直接性证据。后来，该词语还表示可检测的外来物质，如放射性同位素，将这种物质引入人体系统来指质，如放射性同位素，将这种物质引入人体系统来指示特定器官或机体功能出现的问题。示特定器官或机体功能出现的问题。n如今，将生物标志物更精确地定义为可提供机体状态如今，将生物标志物更精确地定义为可提供机体状态信息的指标，如血液检测、基因序列或突变、信息的指标，如血液检测、基因序列或突变、mRNA 表达谱或组织蛋白等。表达谱或组织蛋白等。39生物标志物与有效生物标志物的定义n美国国立卫生研究院美国国立卫生研究院 1998 年年 12 月举行的研讨会将生物月举行的研讨会将生物标志物标志物(biomarker)定义为定义为“经过客观测量和评估的一种经过客观测量和评估的一种特性，可作为正常生物学过程、致病过程或干预疗法的药特性，可作为正常生物学过程、致病过程或干预疗法的药理反应的一种指标理反应的一种指标”。该定义发表于。该定义发表于 Biomarkers And Surrogate Endpoints: Preferred Definitions and Conceptual Framework (Clinical Pharmacology & Therapeutics, Volume 69, No 3, 2001)。n2005年，年，FDA公布了公布了“药物基因组学数据呈报指南药物基因组学数据呈报指南”（Guidance for Industry on Pharmacogenomic Data Submissions），对），对“有效生物标志物有效生物标志物”（Valid biomarker）进行了定义，认为）进行了定义，认为“有效生物标志物有效生物标志物”是一是一种得到广泛认可的，具有生理学、毒理学、药理学或者临种得到广泛认可的，具有生理学、毒理学、药理学或者临床意义的指标床意义的指标”。 40理想的生物标志物应当具备以下三个基本特征：n1、与疾病发生、发展机制紧密相关与疾病发生、发展机制紧密相关，从而具有较好的诊断、危，从而具有较好的诊断、危险性分类和预后评估的价值。险性分类和预后评估的价值。n2、真实性真实性 具有良好的灵敏度和特异性。灵敏度是试验判断为阳性人数占具有良好的灵敏度和特异性。灵敏度是试验判断为阳性人数占真正患病人数的比例，特异性是实验结果判断为阴性人数占真正真正患病人数的比例，特异性是实验结果判断为阴性人数占真正无病人数的比例。若检测灵敏度低，则有可能会出现假阴性；而无病人数的比例。若检测灵敏度低，则有可能会出现假阴性；而低特异性则有可能出现假阳性检测结果。低特异性则有可能出现假阳性检测结果。 具有可预测性。常用预测值（具有可预测性。常用预测值（predictive value，PV）表示，）表示，包括阳性预测值（包括阳性预测值（PPV）和阴性预测值（）和阴性预测值（NPV），前者指试验阳），前者指试验阳性者患病的可能性，后者指试验阴性者无病的可能性。性者患病的可能性，后者指试验阴性者无病的可能性。 能有效地用于临床疾病的分型。能有效地用于临床疾病的分型。n3、检测方法可实现标准化检测方法可实现标准化，易于掌握和推广应用，具有非创伤，易于掌握和推广应用，具有非创伤性，适合于高通量分析，费用适当。性，适合于高通量分析，费用适当。 41有效生物标志物根据其临床应用，可分为以下类别： n1、用于、用于早期检测与诊断早期检测与诊断的的生物标志物（生物标志物（Diagnostic markers）。）。n2、用于、用于预后预后的生物标志物的生物标志物（Prognostic markers）。）。n3、用于、用于预测预测的生物标志物的生物标志物（Predictive markers）。）。n4、药效学药效学生物标志物生物标志物（Pharmacodynamic markers） n5、应答与功效性应答与功效性生物标生物标志物（志物（Response and efficacy markers），），在个体化治疗方案中，在个体化治疗方案中，评价患者个体对于治疗评价患者个体对于治疗措施的反应性。措施的反应性。n6、预测药物毒性预测药物毒性的生物的生物标志物（标志物（Toxicity prediction markers）。 MarkerDiscoveryFinal BiomarkerTarget Development Diagnostic TestDevelopmentSample PreparationConvergent Validity testingMulti-D LC/MS/MSIntracellular ProgramTissueSELDI/MALDIMS/MScDNAarraysHomogenates / LCM CellsExtracellular ProgramCell CulturePlasma or other fluidsSecreted ProteinSurface ProteinFluid ProteinPosttranslational modification / mutation characterizationPolyclonal / Monoclonal AB Production ProgramTissue microarraysELISA testsProtein ChipsWesternBlotRT-PCRLC-MRMImmunochemistryFT-ICR MS傅立叶变换傅立叶变换-离子回旋共振质谱离子回旋共振质谱法法liquid chromatography/multiple reaction monitoring mass spectrometry (LC/MRM-MS) 激光捕获显微切割(lasercapture microdissection,LCM) 43一个案例: Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatographic Prefractionation of Immunodepleted Human Serum Proteins to Enhance Mass Spectrometry Identification of Lower-Abundant Proteins.James Martosella, et al. Journal of Proteome Research. 2005, 4, 1522-1537Experimental Workflow 以免疫亲和色谱法去除人血清样品中的六种高丰度蛋白； 以使用大孔硅胶C18柱的RP-HPLC方法对去除高丰度蛋白后的血清样品进行分级(柱温80)； 分别收集RP-HPLC所得到的各个馏份； 再以SDS-PAGE或LC对各个馏份进行分离； 对分离后的成份分别进行酶解； 对酶解后的肽混合物用MALDI TOF/MS或LC MS/MS进行分析； 最后进行生物信息学数据库搜索。45Lane 2: crude serumLane 3: flow-through Lane 4 : bound fractions Lanes 1 and 5 : molecular weight standardsOn the basis of the protein assay of the flow-through fraction, 85% of total protein was removed from the crude serum.高丰度蛋白的去除效果46Comparison of the RP-HPLC elution profiles (absorbance at 280 nm) for crude human serum, shown in Panel (A), and human serum depleted of high-abundant proteins, shown in Panel (B).A: crude human serumB: Immunodepleted Human serum去除高丰度蛋白后的分离效果47SDS-PAGE analysis of RP-HPLC fractionated immunodepleted human serum from an mRP-C18 column (9.4 mm ID 50 mm).48Panel (A). Overlay of the EICs (m/z 1121.1-1123.3) corresponding to a selected peptide identifying the protein inter-alphatrypsin inhibitor heavy chain H2 precursor (ITI H2). The elution profile presented is for the nanospray LC-MS for this peptide. Panel (B). An exemplary MS/MS spectra for the fraction and the unfractionated sample for the selected peptide, which contributed to the positive identification of the protein.对酶解后的一个肽段的LC MS/MS分析结果49、尿蛋白质组学 Urinary ProteomicsUrine has become one of the most attractive biofluids in clinical proteomics as it can be obtained non-invasively(无创地无创地) in large quantities and is stable compared with other biofluids. 50尿液的生成n肾脏是生成尿液的器官。尿直接来源于血液。肾脏是生成尿液的器官。尿直接来源于血液。n尿的生成主要经过尿的生成主要经过3个过程：个过程： (1)肾小球的滤过作用肾小球的滤过作用。血液流经肾小球时，血浆中的水。血液流经肾小球时，血浆中的水分和其它物质分和其它物质(电解质和小分子有机物电解质和小分子有机物)从肾小球滤过，从肾小球滤过，而形成肾小球滤过液，即原尿。而形成肾小球滤过液，即原尿。 (2)肾小管的重吸收作用肾小管的重吸收作用。原尿经过肾小管，。原尿经过肾小管，99%的水分，的水分，葡萄糖和蛋白质等营养物质也全部被重吸收到血液中。葡萄糖和蛋白质等营养物质也全部被重吸收到血液中。钠离子、氯离子、水和尿素主要是在近曲小管重吸收。钠离子、氯离子、水和尿素主要是在近曲小管重吸收。 (3)肾小管和集合管的分泌作用肾小管和集合管的分泌作用。尿中有相当一部分物质。尿中有相当一部分物质是由肾小管和集合管上皮细胞将它们周围毛细血管血液是由肾小管和集合管上皮细胞将它们周围毛细血管血液中的一些成分，以及这些细胞本身产生的一些物质分泌中的一些成分，以及这些细胞本身产生的一些物质分泌或排泄到管腔中的。或排泄到管腔中的。51尿液中的蛋白质来源 n尿蛋白质组学已有的研究结果表明，正常人的尿蛋白质组学已有的研究结果表明，正常人的尿液中存在尿液中存在1500种以上的蛋白质，还有数量更种以上的蛋白质，还有数量更多的源自大蛋白质分子裂解的多肽片段多的源自大蛋白质分子裂解的多肽片段。n它分为它分为可溶性蛋白与固相成分可溶性蛋白与固相成分两个部分两个部分。 52尿蛋白质的来源:可溶性蛋白来源 注释 肾小球滤过肾小球滤过(Glomerular filtration of plasma proteins) 正常尿液中含量正常尿液中含量 150 mg/日；肾小球滤过功能降低会增日；肾小球滤过功能降低会增加尿液中高分子量蛋白（如清蛋白）的含量；加尿液中高分子量蛋白（如清蛋白）的含量；近端肾小近端肾小管（管（proximal tubule）吸收功能降低或血浆中异常的低）吸收功能降低或血浆中异常的低分子量蛋白会增加尿液中低分子量蛋白（如分子量蛋白会增加尿液中低分子量蛋白（如2-微球蛋白、微球蛋白、免疫球蛋白轻链、生素免疫球蛋白轻链、生素A键合蛋白）以及氨基酸的含量。键合蛋白）以及氨基酸的含量。 上皮细胞分泌上皮细胞分泌(Epithelial cell secretion of soluble proteins) 来自胞外分泌的蛋白，如表皮生长因子（来自胞外分泌的蛋白，如表皮生长因子（epidermal growth factor）或由糖基化磷脂酰化肌醇锚定蛋白）或由糖基化磷脂酰化肌醇锚定蛋白（glycosyl phosphatidyl inositol-anchored protein）分解得到的蛋白，如分解得到的蛋白，如Tamm-Horsfall蛋白蛋白 （Tamm-Horsfall protein）。）。 53尿蛋白质的来源:固相成分来源 注释 上皮细胞上皮细胞(注注1)1. 全细胞脱落全细胞脱落2. 质膜与细胞质膜与细胞内成分脱落内成分脱落3. 免疫细胞胞免疫细胞胞外体外体(exosomes)分分泌泌(注注2) 1.在某些疾病状态，尿中会出现上皮细胞数量增加，包括：在某些疾病状态，尿中会出现上皮细胞数量增加，包括：在在急性肾小管坏死时的急性肾小管坏死时的肾小管细胞脱落，肾小管细胞脱落，肾小球疾病时的肾小球疾病时的足突状细胞脱落足突状细胞脱落(podocyte shedding)2.可能与非特异性的肾脏损伤或凋亡过程有关可能与非特异性的肾脏损伤或凋亡过程有关3. Exosomes又称外泌体又称外泌体，是由细胞分泌到胞外的囊泡状，是由细胞分泌到胞外的囊泡状小体小体,体内多种细胞体内多种细胞 如如T-cells, mast cells, DCs, platelets, neurons, epithelial Cells可以分泌外泌体。可以分泌外泌体。其它细胞其它细胞在某些疾病状态，尿中会出现红细胞，白细胞，或肿瘤细在某些疾病状态，尿中会出现红细胞，白细胞，或肿瘤细胞（如膀胱癌细胞，淋巴瘤细胞）胞（如膀胱癌细胞，淋巴瘤细胞）注1：上皮细胞包括尿足细胞（urinary podocytes）、尿道上皮细胞在内的各种泌尿器管道的上皮细胞; 注2： Exosomes are small (30-100 nm) vesicles that originate as internal vesicles in multivesicular bodies and are excreted from the cell when the outer membrane of the multivesicular body fuses with the plasma membrane.54Urinary exosomes100 nmPatricia Gonzales, Trairak Pisitkun and Mark A. Knepper. Urinary exosomes: is there a future? Nephrology Dialysis Transplantation 2008 23(6):1799-180155尿蛋白质组学的研究意义In the clinical area, e.g. nin the early diagnosis of disease nin classification of disease with regard to likely therapeutic responses nin assessment of prognosis nin monitoring response to therapy. nThese approaches have potential value, not only in diseases of the kidney and urinary tract, but also in systemic diseases that are associated with circulating small-protein and peptide markers that can pass the glomerular filter.56Matthias Mann, et al. Genome Biology, 2006, 7:R80nWe employed 1D SDS and RP HPLC for protein separation and fractionation.(以1D SDS 和 RP HPLC对尿蛋白质组进行分离和分级) nFractionated proteins were digested in-gel or in-solution, and digests were analyzed with the LTQ-FT and LTQ-Orbitrap. (对分离和分级后的蛋白质组成份进行胶上或溶液内酶解, 以LTQ-FT 和 LTQ-Orbitrap两种质谱仪进行MS、MS2、MS3分析)nWe identified 1543 proteins in urine obtained from ten healthy donors, while essentially eliminating false-positive identifications.(从十名健康受试者的尿中鉴定出了1543种蛋白, 这一结果是在排除了假阳性结果后得到的)571D, one-dimensional; HPLC, high-performance liquid chromatography; HSA, human serum albumin; MW, molecular weight; LC, liquid chromatography; MS, mass spectrometry; SDS, sodium dodecyl sulfate.An overview of the procedure used for analysis of the urinary proteome.58nSurprisingly, nearly half of the annotated proteins were membrane proteins according to Gene Ontology (GO) analysis. (令人惊讶的是, 对这些结果的Gene Ontology (GO)分析表明, 几乎有一半是膜蛋白几乎有一半是膜蛋白)nFurthermore, extracellular, lysosomal(溶酶体), and plasma membrane proteins were enriched in the urine compared with all GO entries.(与GO的搜索结果相比, 细胞外蛋白、溶酶体和细胞质膜蛋白均在尿中得到富集细胞外蛋白、溶酶体和细胞质膜蛋白均在尿中得到富集)nPlasma membrane proteins are probably present in urine by secretion in exosomes.(尿中的细胞质膜蛋白尿中的细胞质膜蛋白可能来自可能来自exosomes的分泌的分泌)Gene Ontology（GO）包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG（有向无环图）的结构。Gene Ontology是一个使用有控制的词汇表和严格定义的概念关系，以有向无环图的形式统一表示各物种的基因功能分类体系，从而较全面地概括了基因的功能信息，纠正了传统功能分类体系中常见的维度混淆问题。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，旨在发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。59Comparison of identified proteins in urine of a single person and pooled urine from nine persons. The ratio of membrane, plasma membrane, lysosome, and extracellular region proteins in each dataset were calculated using BiNGO. GO, Gene Ontology.(a) Overlapping proteins(b) molecular weight distribution(c) cellular localization were compared60Proteome map of human urineThe urine samples were fractionated by two different methods. The proteins were separated by 2D-PAGE. BAacetone precipitation（丙酮沉淀）（丙酮沉淀）Ultracentrifugation（超速离心）（超速离心）Visith Thongboonkerd, et al. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ult