基因芯片发展史

基因芯片的制备及应用摘要基因芯片技术|是90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术是各学科交叉综合的崭新科学。其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量DNA探针片段有序地固化予支持物的表面然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交再对杂交信号进行检测分析就可得出该样品的遗传信息。基因芯片技术|目前国内外都取得了较大的进展该技术可用于DNA测序基因表达及基因组图的研究基因诊断新基因的发现药物筛选给药个性化等等所以为二十一世纪生物医药铺平道路将为整个人类社会带来深刻广泛的变革促进人类早日进入生物信息时代。关键词基因芯片微阵列基因诊断药物筛选一、基因芯片的制备基本过程1DNA方阵的构建选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物并作相应处理然后采用光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针或PCR技术扩增基因序列再纯化、定量分析由阵列复制器或阵列机及电脑控制的机器人准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。2样品DNA或mRNA的准备。从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增提高阅读灵敏度。MosaicTechnologies公司发展了一种固相PCR系统好于传统PCR技术他们在靶DNA上设计一对双向引物将其排列在丙烯酰胺薄膜上这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁锁LynxTherapeutics公司提出另一个革新的方法即大规模平行固相克隆这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆且不必分离和单独处理每个克隆使样品扩增更为有效快速。在PCR扩增过程中必须同时进行样品标记标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。3分子杂交样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测杂交的严格性较低、低温、时间长、盐浓度高若用于突变检测则杂交条件相反。芯片分子杂交的特点是探针固化样品荧光标记一次可以对大量生物样品进行检测分析杂交过程只要30min。美国Nangon公司采用控制电场的方式使分子杂交速度缩到1min甚至几秒钟。德国癌症研究院的JorgHoheisel等认为以肽核酸为探针效果更好。4杂交图谱的检测和分析用激光激发芯片上的样品发射荧光严格配对的杂交分子其热力学稳定性较高荧光强不完全杂交的双键分子热力学稳定性低荧光信号弱不到前者的1/351/52不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜或落射荧光显微镜等检测到由计算机软件处理分析得到有关基因图谱。目前如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏、快速有取代荧光法的趋势。二、基因芯片的应用1测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Markchee等用含135000个核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列准确率达99。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2到83.5之间示了二者在进化上的高度相似。2基因表达水平的检测用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列其中14个为完全序列31个为EST检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交经激光共聚焦显微扫描发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。3基因诊断从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点将成为一项现代化诊断新技术。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用4药物筛选如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍基因芯片技术|是解决这一障碍的有效手段它能够大规模地筛选、通用性强能够从基因水平解释药物的作用机理即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再用mRNA构建cDNA表达文库然后用得到的肽库制作肽芯片则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。或者利用RNA、单链DNA有很大的柔性能形成复杂的空间结构更有利与靶分子相结合可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上然后与靶蛋白孵育形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物可以筛选特异的药物蛋白或核酸因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸并从中确定了具有XXG4XX羊结构的抑制物实验表明这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步美国很多制药公司已开始前期工作即正在建立表达谱数据库从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。5给药个性化临床上同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异如药物应答基因导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450酶与大约25广泛使用的药物的代谢有关如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用大约510的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异这些变异除对药物产生不同反应外还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术|对患者先进行诊断再开处方就可对病人实施个体优化治疗。另一方面在治疗中很多同种疾病的具体病因是因人而异的用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型HBV基因的多个位点如SP及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂但在用药3-12月后常出现耐药其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67Asn、Lys70fArg、Thr215tPe、Tyr和Lys219Gli四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变从而可对症下药所以对指导治疗和预后有很大的意义。此外基因芯片在新基因发现、药物基因组图、中药物种鉴定、DNA计算机研究等方面都有巨大应用价值。基因芯片技术|的出现不过短短几年时间其发展势头十分迅猛在生命科学的各个领域得到广泛地应用但其存在的缺陷也是相当明显的。首先是成本的问题由于芯片制作的工艺复杂信号检测也需专门的仪器设备一般实验室难以承担其高昂的费用其次在芯片实验技术上还有多个环节尚待提高如在探针合成方面如何进一步提高合成效率及芯片的集成程度是研究的焦点。而样品制备的简单化与标准化则芯片应用进一步普及的前提。虽然芯片技术还存在这样或那样的问题但其在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现出广阔的应用前景随着研究的不断深入和技术的更加完善基因芯片一定会在生命科学研究领域发挥越来越重要的作用。体外诊断试剂行业市场前景分析20122、行业发展趋势1体外生化诊断试剂发展趋势生化诊断试剂是指通过各种生物化学反应或免疫反应测定体内生化指标的试剂能够配合手工、半自动、全自动生化分析仪等仪器进行临床酶类、糖类、脂类、蛋白和非蛋白氮类、无机元素类、肝功能等指标的检测。国外生化诊断市场起步较早各类试剂品种齐全与试剂配套检测的生化分析仪已从半自动、低速全自动发展至目前的高速全自动器型。生化诊断在我国起北京利德曼生化股份有限公司招股意向书281步最早也是最早引进吸收国外先进技术和设备的诊断领域。由于生化分析仪的开放性在发展初期国内生化诊断领域的企业主要采取跟踪模仿国外技术生产试剂产品配套进口生化分析仪的方式切入市场并以产品性价比高和更贴近本土市场服务的优势扩大市场份额。从市场竞争格局来看经过多年发展我国在生化诊断试剂领域的自主创新能力已显著提升整体技术水平已基本达到国际同期水平并涌现出了一些具备与国际巨头竞争的企业。但由于以往国内一线城市三级医院配置进口高速生化分析仪较多且进口产品在技术和质量方面仍具备一定优势因此目前在一线城市三级医院等高端市场国外企业如罗氏、贝克曼等仍占主导优势其他市场则已普遍被国内企业占领。随着国内企业试剂产品技术质量的进一步提高以及生化分析仪自主开发能力的提升未来我国生化诊断试剂市场的国产化替代趋势将进一步增强。从市场需求发展来看由于生化诊断项目如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇和胆红素等项目都是最基本的临床检验项目临床认可度高仪器和试剂的技术成熟操作简便分析时间短检验成本也是各类检验产品中最低的因此生化诊断试剂在整个体外诊断试剂市场中仍将保持较大份额。其次技术进步带来了生化诊断领域新检测项目的持续开发从而将为生化诊断试剂市场带来新增需求。目前生化诊断领域一个明显的趋势是由于胶乳增强免疫比浊和胶体金增强免疫技术的应用使全自动生化仪的检测灵敏大幅提高使得一些原本采用酶联免疫检测的项目可以在全自动生化分析仪上检测。再次随着我国医疗卫生体制改革的进一步推进县级医院全自动生化分析仪和基层医院半自动生化分析仪将逐渐普及生化诊断试剂市场整体需求规模将继续呈现高速增长。本项目对生化诊断试剂进行扩产顺应行业未来发展趋势。2体外免疫诊断试剂发展趋势随着检验医学的不断发展检验项目已由早期的酶类、离子、代谢物等物质逐渐向在疾病预防和监测中更加具有临床意义的体内小分子蛋白、激素、脂肪酸、维生素、药物等物质深入进而提升了对高灵敏度检测的需求在此背景下免疫诊断技术不断发展兴起。免疫诊断技术主要是通过抗原抗体的免疫反应来实现检测一般利用各种载体放大反映信号来增强检测的灵敏度并先后经历了放射北京利德曼生化股份有限公司招股意向书282免疫、酶联免疫、时间分辨荧光、化学发光等主要技术变化我国免疫学检测也先后经历了类似历程放射免疫技术在我国起源于上世纪60年代。高灵敏放射免疫技术的出现解决了以前难以测定的微量生物活性物质如激素的临床检测问题是医学生物学超微量分析的里程碑但由于存在试剂半衰期短、实验废液难以处理、污染环境等缺点已逐步退出在临床常规检验中的应用目前仅有少量应用。酶联免疫技术在我国起源于上世纪70年代其不仅使免疫诊断成为一种非常简便的研究工具而且迅速应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测并逐渐取代放射免疫技术。目前我国酶联免疫技术已基本达到国际先进水平是目前临床诊断主流应用品种生产厂家众多、竞争较为激烈。时间分辨免疫技术在我国起源于上世纪80年代末其以稀土元素作为标记物灵敏度可与放射免疫技术媲美同时又可避免一般荧光技术所有的荧光寿命短、背景荧光高等缺陷但易受外源性稀土元素的干扰因此目前此方面的试剂和仪器厂家较少。化学发光免疫技术是近10多年发展起来的免疫技术其具有放射免疫的高灵敏度又具有酶联免疫操作简便快速的特点易于标准化操作试剂保质期长且测试中不使用有害物质从而成为非放射性免疫分析法中最有前景的方法之一。在欧美等发达国家化学发光技术发展已较为成熟并已取代酶联免疫成为免疫检测的主流方法。在我国大多数三甲医院由于检验样本量大成本相对较低化学发光已取代酶联免疫成为主流但试剂及仪器均由国际巨头提供而三甲以下医院尚处于推广期。随着国内企业化学发光免疫诊断试剂和配套仪器的成功开发试剂质量有了较好保障生产成本亦大幅降低化学发光免疫诊断试20世纪60年代70年代80年代90年代技术变化酶联免疫ELISA时间分辨荧光TRFIA放射免疫RIA时间轴化学发光CLIA北京利德曼生化股份有限公司招股意向书283剂在三甲以下医院正快速推广应用。本项目拟投产的体外免疫诊断试剂全部属于化学发光类符合行业未来发展趋势。3、市场容量分析1体外诊断试剂行业整体市场容量分析我国体外诊断试剂行业正从产业导入期步入成长期市场发展前景良好。根据KaloramaInformation中国临床诊断市场分析2008的预测2008-2012年中国体外诊断市场规模增速将显著高于全球平均水平年复合增长率将保持在16左右。McEvoyFarmer的市场报告中国临床诊断市场2011显示2010年我国体外诊断市场规模为136.8亿元其中体外诊断试剂市场规模约为99亿元并预计未来数年将保持1520的增速。根据KaloramaInformation与McEvoyFarmer的分析预测保守测算2012年我国体外诊断试剂市场规模将超过133亿元2015年将实现翻番达到208亿元因此市场成长空间广阔。针对市场容量问题尤其是为了解本次募投项目的市场前景及终端消费市场状况公司对全国各地的医院展开调研。为提高调研结果的准确性和有效性公司根据我国三级和二级医院的分布结构通过经销商网络发放调研问卷共300份其中三级医院100份、二级医院200份收回问卷238份其中三级医院90份、二级医院148份按调研完整性、准确性要求剔除后有效问卷为179份其中三级医院73份、二级医院106份。调研内容主要为2009年-2011年医院实际和预计体外诊断试剂采购情况、检测项目收入情况以及化学发光诊断项目开展情况等。公司调研数据显示2010年体外诊断试剂采购金额同比增长21.432011年预计增长24.40高于KaloramaInformation与McEvoyFarmer的预测增速并且二级医院增速高于三级医院。2生化诊断试剂市场容量分析2010年我国体外诊断试剂整体市场规模保守测算达到99亿元其中生化诊断试剂约占27因此2010年我国生化诊断试剂约为26.7亿元。KaloramaInformation中国临床诊断市场分析2008预测未来数年生化诊断领域增长率为15。据此测算2012年我国生化诊断试剂市场规模将超过35亿元2015年将接近54亿元。此外KaloramaInformation还对各类型终端市场包括一级、二级、三级医院和私人医院、独立实验室等的需求分布和增长率做了估计生化诊断试剂和免疫诊断试剂主要消费终端市场集中在三级医院和二级医院这两个消费终端占到整个市场容量的85以上独立实验室年均增长率最高但基数较小。公司调研数据显示2010年体外生化诊断试剂采购金额同比增长23.312011年预计增长18.72高于KaloramaInformation与McEvoyFarmer的预测增速显示体外生化诊断试剂仍然处于快速增长阶段。3免疫诊断试剂市场容量分析免疫诊断试剂总体分析2010年我国体外诊断试剂整体市场规模保守测算达到99亿元其中免疫诊断试剂约占33因此2010年我国免疫诊断试剂市场规模约为32.7亿元。KaloramaInformation中国临床诊断市场分析2008预测未来数年免疫诊断领域增长率18。据此测算2012年免疫诊断试剂市场规模将达到近46亿元2015年将接近75亿元。免疫诊断试剂的消费终端市场也主要集中在三级医院和二级医院。公司调研数据显示2010年体外免疫诊断试剂采购金额同比增长24.232011年预计增长24.52高于KaloramaInformation与McEvoyFarmer的预测增速显示体外免疫诊断试剂处于快速增长阶段且二级医院免疫诊断试剂增长快于三级医院。主要化学发光类诊断产品市场容量分析项目拟生产的化学发光诊断试剂包括肿瘤标志物、甲状腺激素和性腺激素等三大类别。肿瘤标志物检测产品主要用于肿瘤相关疾病的诊断检测。我国每年新增肿瘤患者200万人、死亡130万人现存约600万肿瘤患者肿瘤标志物检测产品国内每年的市场需求约为2000万人份市场容量约为5亿元。本项目中肿瘤诊断试剂用于检测肿瘤标志物包括癌胚性抗原、肿瘤相关抗原、能被单克隆抗体识别的人肿瘤抗原、酶、癌基因及其产物等。甲状腺激素检测产品用于鉴别甲低症、甲亢症和甲状腺功能测定等领域。甲状腺激素的主要生理作用是促进物质与能量代谢促进生长及发育等过程。近年来甲亢发病率逐年增加由10年前的1上升到2目前已成为各大医院内分泌科继糖尿病之后的第二大疾病。甲低症是典型的女性疾病男女发病比例为1:5研究发现城市30岁左右的白领人群中有20左右的人有不同程度的甲状腺功能低下问题。本项目拟生产的甲状腺激素检测产品具有稳定的市场需求。性腺激素检测产品大部分也用于生殖方面检测性腺激素主要包括垂体泌乳素、促卵泡激素、促黄体素和雌二醇等。资料显示育龄妇女妇科疾病发病率达70以上本项目拟生产的性腺激素检测产品市场容量较大。