实时荧光定量PCR技术地研究进展及应用

word实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用摘要:实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用。本文对实时荧光定量PCR技术的原理，检测方法的原理、优缺点进展了评述,重点与创新点是对实时荧光定量PCR技术在医学领域，食品行业，植物方面的应用进展了比拟全面的综述,并对实时荧光定量PCR技术的普与应用与领域的前景做了进一步的展望。关键词：实时荧光定量PCR；应用；展望Research progress and application of real-time PCR technologyAbstract: Real-time PCR technology to detect PCR product by fluorescence quantitative signal strength to achieve the purpose , the technology not only to achieve the PCR from qualitative to quantitative leap , and pared with conventional PCR, it is more specific , effective solution to PCR contamination problem , degree of automation , has been widely used in genetic engineering of plants and animals , microbes and medicine fields . In this paper, the principle of real-time PCR technology, principles , testing methods, advantages and disadvantages are reviewed , the focus and innovation is a real-time PCR technology in the field of medicine , food industry, plant aspects of the application of a more prehensive overview , prospects and real-time PCR technology in the field of universal application and made a further outlook .Keywords: Real-time quantitative PCR; application ; Outlook聚合酶链反响(PCR)技术自1985年问世以来，以其灵敏性高、特异性强和速度快在分子生物学等科研领域得到了广泛应用。但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，在操作过程中易受污染而使假阳性率偏高；因此，使其应用受到限制。实时荧光定量PCR技术拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反响等优点，已成为了分子生物学研究的重要工具。文章对实时荧光定量PCR技术的原理、检测方法、定量方法与其应用进展了综述。1.实时荧光定量PCR技术概述实时荧光定量PCR技术的原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反响体系中参加荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进展定量分析的方法1。实时荧光定量PCR是在反响体系中参加荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线如图1。在PCR反响早期,不能将产生荧光的水平与背景明显区别,之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量,并由此推断起始模板含量。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数，荧光定量PCR采用参数“Ct值，Ct值也称阈值循环(threshold cycle),指PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反响管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究结果明确,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多，Ct值越小2。利用起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线,因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数3。图1 实时荧光定量PCR的标准扩算曲线1.2 实时荧光定量PCR技术的检测方法实时荧光技术PCR是在扩增产物聚集的过程中连续检测,即“实时检测,根据在指数扩增期的产物量来推算初始模板的拷贝数。实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。染料类如SYBR Green I如此是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤特异性更高；但后者如此简便易行、本钱较低。荧光标记探针按其基团标记和能量转移的方式,目前已经开发出几种相关的技术,大体可以分为水解探针和杂交探针两类。如Taq ManTM探针(水解探针)、Taqman MGB (水解探针) (Dual-oligo FRET pairs(双杂交探针)、Molecular beacons (杂交探针)、Universal probe library LNA ( locked nucleic acids (水解探针)、Simple proble探针等4。1TaqMan探针 该探针是长度为2024b的寡核苷酸，在其5末端标记1个荧光报告基团，3末端标记1个荧光淬灭基团，其序列与2个引物包含序列内的1段DNA模板完全互补。该方法是当探针保持完整时利用Taq酶(53外切酶)的活性淬灭基团吸收发射的荧光。当有特异的PCR发生时，Taq酶发挥其53外切酶活性，将与模板杂交的探针切碎，报告基团与淬灭基团别离，淬灭作用被解除，荧光信号释放，通过检测系统就可以观察到信号的变化，荧光信号的累积与PCR产物形成呈正相关。每扩增1条DNA链，就有1个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。利用标准模板系列绘制出标准曲线，结合各样品的Ct值，可以确定样品的起初模板量5。由于探针与目标片段之间的特异杂交产生荧光信号，因而此方法可通过探针增强检测的特异性，且能够提供多重检测功能。2TaqmanMGBTaqman MGB探针是Taqman探针的根底上改良的,在探针的3端增加了MGB (minor groove binder)分子,这种物质能够结合在双链DNA小沟部位；MGB提高了探针的TM值,从而使它能够分辨1个碱基的差异:完全配对,有荧光信号；一个碱基不匹配,如此没有信号；而且连在MGB分子后的是非荧光物质的淬灭基团,因此这种探针具备更好的淬灭效果且无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比、提高退火温度、探针短、提高SNP识别率等优点。从而具备了更加广泛的应用前景。3分子信标分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环部大小为1535bp，能与靶DNA序列互补，茎部由GC含量较高的与靶DNA无序列同源性的互补序列构成，探针的5端与3端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当分子信标处于自由状态时，发夹结构的2个末端靠近，使荧光报告基团与淬灭荧光基团靠近，产生荧光共振能量转移(FRET)效应，荧光信号被淬灭；因此，检测不到荧光信号6。当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结合，使分子信标的发夹结构打开呈线型，荧光报告基团与淬灭基团彼此在空间上产生足够的距离，此时荧光报告基团不能被淬灭，荧光检测仪器可检测到荧光。随着每次扩增产物的积累，荧光强度增加，可反映出每次扩增末扩增产物积累的量。分子信标法的特点是探针可循环利用，适用于检测点突变，特异性更明显。但探针标记较复杂，并且要求其游离在溶液中时探针能无选择性折叠，当茎结构的热力学温度过高时还会影响探针与靶序列杂交。4双杂交探针双杂交探针技术是Roche公司开发的一种PCR定量技术，使用2个杂交探针，能提高特异性。该技术是将2条探针中的1条在5端标记荧光，1条在3端标记荧光，其中一个为受体荧光基团，另一个为供体荧光基团，2个探针可与模板同1条链相邻的序列杂交。在自由状态时，供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱；因此，只能检测到供体荧光基团发出的荧光。在PCR退火阶段中2条探针与目的基因特异性结合，首尾连接，使供体和受体荧光距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移，使受体荧光基团发出荧光。由于荧光共振能量转移探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，而非累积信号。该方法的特点是淬灭效率高，但由于2个探针结合于模板上；因此，会影响扩增效率，而且需要合成2个较长的探针，合成本钱相对较高。5Universal probe library-LNA (locked nucleicAcids)新近Roche公司研发并建立了人类和鼠的通用探针库,其探针是由锁定核酸组成。他们通过分析人的转录组中所有不同的可能的8至9碱基序列,按照他们在转录组中出现的频率分类,找出最普便的8至9碱基序列模式制备成通用探针;每一个探针可以与7000个转录子杂交。这种探针的特异性由探针和引物共同实现。LNA是一种双RNA聚合的类似物,其2p-位的氧原子与核糖4p-碳原子形成亚甲基的桥键,并分别在5p和3p标记上荧光报告基团和淬灭基团；LNA单体掺入寡核苷序列可以增加形成体的Tm值,其稳定性比PNA高(PNAS2000, 97: 5633-5638)1因LNA与DNA杂交较DNA与DNA、DNA与RNA甚至PNA与DNA杂交有更高的亲和性,故这种探针稳定性最好；而且探针实现了设计迅速简单、低本钱的水解探针特点。一般上其公司后,输入基因序列号,就能订制,无需检测引物二聚体和非特异性片段。因此LNA技术实现了高熔点和高特异性结合特点；可以用于所有的荧光定量PCR仪。6Simple探针最近Roche公司生产一种简单探针,这种探针只在5端标有报告荧光,在报告荧光和5端之间连接一种称作“linker的结构,只有在变性阶段,探针与目标序列互补结合时,引起“linker结构发生改变,从而报告荧光基团的荧光得以显现。这种探针的好处是不用淬灭基团,从而无背景荧光。1 双链DNAdsDNA)结合染料目前用于实时PCR的dsDNA结合染料,主要有SYBRGreenI和LC Green TMI7。1SYBRGreen I是一种非饱和菁类荧光素,可以嵌合于DNA双链结构的小沟中。其处于游离状态时,检测不到荧光信号,当结合dsDNA后荧光强度明显增强,即被荧光探测系统检测到,荧光强度的增加与初始模板量相关,可以进展定量DNA分析,已有应用于临床诊断和科学研究中的报道。SYBR Green染料法与探针法相比,其优势在于检测方法简便,同时降低了检测本钱。但是,由于该染料能够结合任何dsDNA分子,因此不能保证PCR的特异性。可以通过优化PCR的反响条件,减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生,另外,也可以借助融解曲线分析法来区分非特异性产物和引物二聚体而进展定性诊断。2LC Green TMI是最新出现的一种dsDNA结合染料,与SYBR Green I相比,该染料是一种饱和结合染料,能够完全结合dsDNA分子,可直接参加PCR反响体系中,高浓度的LC Green TMI不会抑制PCR反响。已有文献报道在PCR反响体系中参加LC Green TMI,使用一对引物,一个不作标记的探针,结合常规融解曲线或仅使用一对引物,PCR完毕后通过分析融解曲线的形状和融解温度(Tm值)的大小,对纯合子和杂合子以与寡核苷酸序列多态性(SNP)进展鉴别。LC Green TMI染料法简便、快速、准确性高,预期将会有很好的应用前景。1.3 实时荧光定量PCR技术的开展PCR技术发明以来,研究人员一直致力于用其进展核酸准确定量。1991年Holland等8首次运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板结合,然后利用DNA聚合酶的53核酸外切酶活性将探针切断,使探针的能量传递结构被破坏发出荧光来定量PCR产物。1992年Higuchi等9,10在PCR反响管中参加EB,反响进展过程中,PCR产物增加,EB与DNA双链结合发出荧光强度也逐渐增加.他们通过连续照相动态观察荧光强度的变化,并以此定量PCR产物的多少,成为最早的实时定量PCR。1996年Heid11等首先报道了Taqman PCR的原理与方法。同年,美国Applied Biosystems公司推出商用实时定量PCR(Taqman PCR)系列。之后,人们又设计出不同的荧光探针,如分子信标技术(molecular beacon)12、Light cycler PCR13,14等。随着研究的不断进展,研究人员不仅定量DNA分子,还定量RNA分子,从而进一步定量基因的表达15。1.4 实时荧光定量PCR的定量方法实时荧光定量PCR的定量方法有2种，即绝对定量法和相对定量法16。绝对定量法是用的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量法是在一定样品中靶序列相对于另一参照序列量的变化，由于每个模板Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用起始DNA浓度的标准品即可绘制出标准曲线。绝对定量法绝对定量法指的是用的标准曲线来推算未知样本的量，此方法要预先知道标准品的浓度。将标准品稀释成不同浓度并作为模板进展PCR反响，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标绘制出标准曲线。对未知样品进展定量时根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线中推出样品的起始拷贝数。相对定量法1比拟标准曲线的相对定量法相对定量法指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本量的变化。由于该方法中量的表达是相对于某个参照物而言的；因此，相对定量法的标准曲线比拟容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中，待测样本靶序列的量来自标准曲线，最后必须除以参照物的量，其他的样本为参照物量的n倍。在试验中为了准确参加反响体系的RNA或DNA，通常在反响中扩增1个内源管家基因作为参照基因，由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用来作为标准，比拟来源不同的样本目的基因表达量的差异。管理基因是用于比拟目的基因拷贝数，根据内参照补偿待测样本核酸抽提过程中造成的目的基因损失，反响体系内是否存在扩增抑制因素与参照物标准化等17。2比拟Ct值的相对定量法该方法是同时扩增待测靶基因片段和内参照基因片段。这2个扩增反响可以在2个反响管中分别进展，也可以在同1个反响管中进展，测得两者的Ct值之差即Ct。该方法不需要标准曲线，与标准曲线法不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加1倍的产物，以PCR反响的指数期得到Ct值来估算起始模板的量，一个循环(Ct=1)相当于起始模板数的2倍。此方法节省试剂，操作简便，但由于是以靶基因和内源控制物的扩增效率根本一致为前提的，效率的偏移会影响对实际拷贝数的估计；因此，如何优化反响体系，使得目的基因和内参基因的扩增效率相等是该方法的难点。2实时荧光定量PCR技术的应用.2.1 医学研究领域的运用应用实时荧光定量PCR检测病原DNA不仅可以定性,还可以检测出病原量的多少,为临床诊断提供了强有力的依据。现在实时荧光定量PCR已经应用于许多病原体的检测,比如乙型肝炎病毒DNA18、锋利湿疣皮损中HPVD-NA19、与鼻咽癌关系密切的EB病毒(Epstein-Banvirus)20、猪内生逆转录酶病毒21。Andersen等22用定量PCR的方法测定了结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量,可作为诊断癌症微转移的重要依据。Cassinat等23应用RQ-PCR对t(15;17)NB4白血病细胞进展了研究,其敏感性达10-6。Pongers-Willemse等24首先应用RQ-PCR对4例前B细胞ALL中IgH/TCR重排进展了研究,他们针对每个病例设计一个与连接区互补的等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针和各自特异性的一对引物,比拟了RQ-PCR与斑点杂交和液相杂交检测的敏感性。结果发现其敏感性与斑点杂交相似(10-310-5),但低于液相杂交。X敬忠等报道使用dsDNA结合染料SYBR Green I，结合融解曲线分析对A-地中海贫血纯合子、杂合子作出诊断25。使用双色荧光标记探针,结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。赵卫东等26通过荧光定量的方法对各细胞株的转录因子T-box ex-pression in T cells (T-bet)、GATA3的表达水平进展检测,建立了肿瘤细胞株转录因子基因表达的荧光定量PCR检测方法,较常规PCR方法更为简便、快速、准确,有很好的应用前景。 食品研究运用实时荧光定量PCR技术可以对食品中致病菌进展检测。李光伟27等采用沙门菌fimY基因序列，设计特异引物和探针，建立了检测食品中沙门菌的FQ-PCR方法。胡建华等根据Grenbank公布的志贺菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物，筛选适宜的DNA模板制备方法吗，以SABH Green染料监控荧光变化的FQ-PCR与常规PCR结合,检测培养液和牛奶阳性样品中的志贺菌28。FQ-PCR技术除了在微生物检测中应用广泛，也是食品微生物研究中不可缺少的工具，是作为微生物生理代谢、菌群分布、菌株鉴定等的研究工具。同时PCR技术是检测转基因食品最方便快捷的方法，基于转基因特异DNA片段的FQ-PCR筛选方法已被一些国家作为相关食品法规的标准检测方法。日本和美国等13个实验室联合采用FQ-PCR方法对5种转基因玉米和1种转基因大豆进展了定量研究。结果明确这种方法可以应用于转基因作物标识制度的实际检测29。2.3 植物研究上的运用传统的病原菌检测方法依赖于症状观察、孢子或菌落计数等手段。与传统方法相比，实时定量PCR技术具有快速、灵敏、特异等优点，不受植物症状的限制，能区分细微差异。目前该技术在植物病原菌检测中得到越来越广泛的应用。如伍永明等30根据西瓜细菌性果斑病菌Acidovor axavenae subsp. citrulli与相关细菌16S rDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac-probe，利用该探针对23种供试菌株进展了实时荧光PCR检测试验。植物抗病性与其机制研究一直是当今植物病理学和植物抗病育种研究工作中的热点和焦点问题。而抗病基因的研究是植物抗病性与其机制研究的根底，运用荧光定量PCR技术可检测转入抗病基因的植株中病毒的积累31，从而比拟抗病植株与感病植株之间的病毒复制和积累的差异，为抗病基因抑制病毒的复制和运动提供强有力的分子证据。3实时荧光定量PCR的展望实时荧光定量PCR技术自1996面世以来,短短的几年就被广泛应用到生物学各个领域,涉与到的X围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量,核酸多态性分析,基因突变分析等多个领域。但随着该技术应用的领域X围不断扩大延伸，研究的层次不断深入，它也开始显现出不足:(1)降低探针制备的本钱或开掘新的荧光染料；(2)进一步提高分析的灵敏度与实验重复性；(3)样品制备简单化,程序化和机械化以节约时间降低本钱。相信,实时荧光定量PCR将以其独特的优势在分子生物学、生物学和医学的根底研究和应用研究方面发挥更多更大的作用。另外,基因分析的定量化和均相化是未来基因诊断的开展趋势,目前在该领域的研究刚刚开始,仍有许多问题需要解决,如分析灵敏度与重复性问题、自动化仪器和试剂本钱、样品处理与多基因同时分析等问题。生物芯片技术与荧光探针定量技术的结合将有助于上述问题的解决32,届时将大大推动该技术在生命科学领域的应用普与,特别是临床诊断领域的推广。随着科学技术与科学知识的增长，实时荧光定量PCR技术将继续被改良，新的问题被攻克，从而建立更新、更便捷、更完善的PCR体系，并应用到更广、更深的科学领域。参考文献1 欧阳松应,杨冬,欧阳红生等.实时荧光定量PCR技术与其应用J.生命的化学, 2004, 24(1): 742761.2Verderio P, Pizza Miglio S, Gallo F, et al. 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