基因工程操作程序课件

基因工程操作程序课件基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程操作程序课件原核细胞的基因结构原核细胞基因原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的编码区下游的DNA序列，虽不序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等序列，如启动子、终止子等基因工程操作程序课件原核细胞的基因结构 RNA聚合酶的作用是催化聚合酶的作用是催化DNA转录为转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，转录开始后，RNA聚合酶沿聚合酶沿DNA分子移动，并分子移动，并与与DNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNA。基因工程操作程序课件真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子外显子，一般不，一般不能够编码蛋白质的序列叫做能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子。基因工程操作程序课件真核细胞的基因结构真核细胞基因真核细胞基因编码区编码区（间隔、不连续）（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质外显子：能编码蛋白质的的DNA序列序列内含子：不能编码蛋白内含子：不能编码蛋白质的质的DNA序列序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子动子、终止子基因工程操作程序课件原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是连续的连续的编码区是间隔编码区是间隔的、不连续的的、不连续的相同点相同点都由能够编码蛋白质的编都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非码区和具有调控作用的非编码区组成的编码区组成的基因工程操作程序课件基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。调节基因。（2）没有转译产物的基因：如）没有转译产物的基因：如rRNA基因基因和和tRNA基因。基因。（3）不能转录的）不能转录的DNA片段：如操纵基因。片段：如操纵基因。基因工程操作程序课件启动子与终止子 启动子是在非编码区内紧靠转录起点，启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。使转录从起点开始，沿编码区进行。 终止子是在非编码区内紧靠转录终点，终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。模板链上脱离下来，使转录终止。基因工程操作程序课件基因工程的基本操作流程基因工程操作程序课件基因组文库和部分基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库基因工程操作程序课件基因组文库和部分基因文库基因工程操作程序课件cDNA合成过程 n第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互互补的补的DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。杂交分子。n第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的链降解，使之变成单链的DNA。n第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。 基因工程操作程序课件利用PCR技术扩增目的基因原理原理:DNA双链复制双链复制前提前提:要有一段已知要有一段已知目的基因的脱目的基因的脱氧核苷酸序列，氧核苷酸序列，以便合成引物。以便合成引物。基因工程操作程序课件获取目的基因n从基因文库中获取从基因文库中获取n利用利用PCR技术扩增技术扩增n利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成基因工程操作程序课件构建表达载体表达载体的组成表达载体的组成n目的基因目的基因n启动子启动子n终止子终止子1.标记基因标记基因基因工程操作程序课件基因工程载体的构建需要考虑哪些因素 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。正的转基因生物。 基因工程操作程序课件转化转化: :目的基因目的基因进入受体细胞内进入受体细胞内，并且在受体细胞内维，并且在受体细胞内维持持稳定和表达稳定和表达的过程。的过程。3、将目的基因导入受体细胞受体细胞种类受体细胞种类方法方法植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法（双子叶植物、裸子植物）农杆菌转化法（双子叶植物、裸子植物）基因枪法（单子叶植物）基因枪法（单子叶植物）花粉管通道法花粉管通道法显微注射技术：显微注射技术：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵取卵（受精卵受精卵）显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物用用CaCa2+2+处理处理细胞细胞感受态细胞感受态细胞表达载体与感表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子基因工程操作程序课件将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法基因工程操作程序课件思考：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理思考：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基若将一个抗病基因导入小麦中因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择要选择合适的农杆菌菌株合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。基因工程操作程序课件 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。基因工程操作程序课件将目的基因导入受体细胞（动物细胞）n显微注射法显微注射法基因工程操作程序课件将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）nCa2+处理处理基因工程操作程序课件四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1、检测与鉴定的目的、检测与鉴定的目的目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性和表达其遗传特性检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上上2、检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质另外：个体生物学水平的鉴定另外：个体生物学水平的鉴定基因工程操作程序课件知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。基因工程操作程序课件思考思考：检测：检测mRNA 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？是否合成，可以用分子杂交的方法吗？#检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交#个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定基因工程操作程序课件归纳: 基因工程的基本操作程序n 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成n 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因n 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法n 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译基因工程操作程序课件基因工程操作程序课件基因操作的基本步骤基因工程操作程序课件基因操作的基本步骤