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高效液相色谱法测定浓缩苹果清汁样品中富马酸含量的测量不确定度评定报告一实验目的：用高效液相色谱法测定浓缩果汁中富马酸的含量二.测定方法：1.主要仪器和试剂高效液相色谱仪配紫外检测器，富马酸标准储备液：1000mg/L，实验用水为超纯水2.1方法依据：SN/T2007-2007进出口果汁中乳酸、柠檬酸、富马酸含量检测方法 高效液相色谱法2.2试样溶液制备：称取浓缩果汁试样约5g(精确到0.0001g)于50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀并用带有0.45m水系滤膜的针头式过滤器滤入样品瓶，富马酸的含量用配有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，进样量20l,外标法定量。2.3色谱条件：流动相0.1mol/l磷酸二氢铵溶液，用磷酸调节PH=2.4，过0.45m滤膜；流速0.6ml/分钟；柱温40，进样量20l；色谱柱ODS柱，5m,检测波长210nm三数学模型：X=式中：X试样中被测物的含量，单位mg/kg； C1标准工作液中被测物的浓度，单位mg/L； V样液最终定容体积，单位ml； m最终样液所代表的试样量，单位为g；B规定的可溶性固形物的含量，单位为Brix；BO试样的可溶性固形物的含量，单位为Brix；随机影响的重复性系数。四.不确定度的来源分析高效液相色谱法测定浓缩苹果清汁中富马酸含量的过程中,不确定度来源主要有:a.富马酸标准溶液的配制和稀释引入的不确定度rel(C)；b.富马标准溶液的浓度与信号之间以最小二乘法拟合的工作曲线求得富马酸含量时产生的不确定度rel(f)；c.试样质量的相对不确定度rel(m)；d.试样最终定容体积的相对不确定度rel(V)；e.试样的可溶性固形物含量的相对不确定度rel(B)；f.液相色谱仪器稳定性引入的不确定度rel(仪器)。五.标准不确定度的评定（1）A类不确定度的估算:即重复测定样品产生的相对不确定度rel(A).在重复性条件下,对浓缩苹果清汁样品进行了6次测定,测最结果分别为2.02,2.01,2.03,2.01,2.03,2.02mg/L,则富马酸含量的算术平均值,X=2.02mg/kg.单次测量不确定度：(xi)=S(xi)=0.0089 算术平均值的不确定度：()=S()=0.0037 相对不确定度：rel(A)=0.18 10-2（2）B类不确定度的估算：1.标准溶液配制引起的相对不确定度rel(c)富马酸标准溶液的配制（以3.0mg/l富马酸标准溶液为例）：用分析天平称取0.1g富马酸标准品（由美国Chem Service公司生产，不确定度为0.5%）用水溶解并定容至100ml,得到浓度为1000mg/l的储备液，第一次稀释为20倍，吸取5ml储备液定容至100ml,用水稀释定容后其浓度为50mg/l，第二次稀释为10倍，用5ml刻度吸管吸取3.0ml浓度为50.0 mg/l的标准溶液入50ml的容量瓶中用水定容到度，得到浓度为3.0 mg/l的富马酸标准工作液。公式表示为： =式中： C1富马酸标准工作液的浓度，单位为mg/l； m所称取的富马酸标准品的质量,单位为g； p富马酸标准品的纯度， V1100ml容量瓶的体积，单位为ml；V25ml单标线移液管的体积，单位为ml；V3100ml容量瓶的体积，单位为ml；V45ml刻度吸管吸取3.0ml标准溶液的体积，单位为mlV550ml容量瓶的体积，单位为ml；故rel(c)由以下7个分量组成1.1富马酸质量的相对标准不确定度：采用增量法称量标准的质量，由于质量较小（小于0.2g）,在两次称量中天平示值的偏量可被抵消，随机影响已包含在测量重复性相对标准偏差中，这里无需再考虑。1.2富马酸标准品纯度的相对标准不确定度rel(p)富马酸标准品纯度的相对标准不确定度rel(p)按下式计算rel(p) =式中：P富马酸纯度的扩展不确定度K包含因子根据试剂生产商提供的资料，aP=0.5%，P=98.0%,按均匀分布考虑，K=，将各数据代入得rel(p) =0.00291.3 100ml容量瓶的相对不确定度：rel(v1),其中包含两部分，第一，容量瓶体积的不确定度，容量瓶（100ml）的容量允差为0.10 ml，按三角分布换算成标准偏差为 ml；第二，容量瓶和溶液的温度与较正的温度不同引起的体积不确定度，液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，因些只需考虑前者（实际温差为5，水的体积膨胀系数为2.1*10-4）: rel=0.061,以上二项合成得出：100ml容量瓶的相对不确定度rel(v1) =7.2910-41.4 5ml单标线吸管的相对不确定度rel(v2)：其不确定度主要包括两个部分：第一，吸管体积的不确定度，按制造商给定容器容量允差为0.015ml；按照三角分布换算成标准偏差为=0.0086；第二，吸管和溶液的温度与校正时的温度不同引起的体积不确定度，液体的体积膨胀明显大于吸管的体积膨胀，因些只需考虑前者，假设差为5，对水体积膨胀系数为2.110-4/，按均匀分布换算成标准偏差则为=3.0310-3：以上二项合成得出5ml单标线吸管的相对不确定度rel(v2)= =0.00181.5 100ml容量瓶的相对不确定度见1.3rel(v3)= 7.2910-41.6刻度吸管5ml吸取3.0ml标准工作液时的相对不确定度：rel(v4)其中包含两部分：第一，刻度吸管体积的不确定度，刻度吸管5ml的容量允差为0.025ml，按三角分布换算成标准偏差为 ml；第二，液体的体积膨胀明显大于吸管的体积膨胀，因些只需考虑前者溶液的温度与较正的温度不同引起的体积不确定度（实际温差为5，水的体积膨胀系数为2.1*10-4）: rel=0.0018,以上二项合成得出：rel(v4) =3.4510-31.7 50ml容量瓶的相对不确定度：rel(v5)其中包含两部分，第一，容量瓶体积的不确定度，容量瓶（50ml）的容量允差为0.05 ml，按三角分布换算成标准偏差为 ml；第二，容量瓶和溶液的温度与较正的温度不同引起的体积不确定度，液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，因些只需考虑前者（实际温差为5，水的体积膨胀系数为2.1*10-4）: rel=0.03,以上二项合成得出：50ml容量瓶的相对不确定度rel(v5) =7.2110-4标准溶液配制的B类不确定来源一览表：项目描述测量值标准不确定度相对标准不确定度m标准品的质量0.1008g忽略忽略P标准品的纯度0.980.5%0.0029V1100ml容量瓶体积100ml0.0756 ml0.000729V25ml无刻度度吸管体积5ml0.0095ml0.0018V3100ml容量瓶体积100ml0.0756 ml0.000729V45ml有分度吸管体积3ml0.0107ml0.00345V550ml容量瓶体积50ml0.04123ml0.000721综上所述：标准溶液配制引起的相对不确定度rel(c) =5.0110-32.工作曲线拟合引起的相对不确定度rel(f)2.1富马酸标标准工作曲线的绘制：采用标准储备液配制标准系列浓度为：1.001、2.002、3.003、4.004、5.005mg/l的富马酸工作液，五种浓度的工作液分别上机测定3次，浓度与峰面积的平均值对应的关系如下：浓度（mg/l）平均峰面积工作曲线算出的峰面积实际与理论浓度的差方001.482.19041.001251.110247.736 11.38382.002487.860493.992 37.60173.003752.570740.248 151.83104.004974.160986.504 152.37535.0051237.0001232.760 17.9772标准工作曲线： 相关系数R=0.99982工作曲线的数据如下：标准曲线浓度的平均值=2.5025mg/l，=373.36样品测试次数：p=6 样品中富马酸含量的平均值：x0 =2.02mg/kg.总校准点：n=6=17.535将上述各值代入，SR=9.66校准曲线拟合的不确定度：rel(f)=1.1410-23.试样质量的相对不确定度本实验称取样品质量用的是赛多利斯CPA224S天平，根据制造商提供的说明书给出的天平的线性分量为0.0002g，该数值代表了托盘上被称量的实际重量与读取的数值的最大误差为0.0002 g，按均匀分布，试样的质量取5.0081g, 线性分量应重复计算两次，一次是皮重，另一次为毛重，因此产生的相对不确定度为rel(m) = =3.2410-54.试样最终定容体积的相对不确定度：该体积有三个主要的影响因素：校准、重复性和温度。i)校准：检定证书提供的50 ml容量瓶在20的体积为500.05ml，给出的不确定度的数值没有置信水平或分布情况，因此假设是必要的，因为在一个有效的生产过程中标定值比极限值可能性更大，假设为三角分布比矩形分布表示合理，所以在这里计算标准不确定度时是假设三角分布，=0.02 mlii)温度：实验室的温度在205之间变动，该影响引起的不确定度可通过估算该温度和体积膨胀系数来计算，液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，因些只需考虑前者。水的体积膨胀系数为2.110-4/，因此，产生的体积变化为（5052.110-4）=0.0525 ml，计算标准不确定度时，假设温度变化是矩形分布，即=0.03 ml二种分量合成得到的试样最终定容体积的相对不确定度为：rel(v) =7.2110-45. 试样的可溶性固形物含量的相对不确定度rel(b)可溶性固形物的测定中有三个主要的影响因素：温度、人员和读数，由于配备有专门的冷却循环装置，温度引起的不确定度可以忽略。人员读数引起的不确定度：阿贝折光仪的分度值为0.1，按三角分布计算，人员读数引入的不确定度为 =0.04，人员读数引起的相对不确定度：=5.710-4试样的可溶性固形物含量的相对不确定度rel(B)=5.710-46.分析仪器的相对不确定度rel(仪器)该高效液相色谱仪的RSD为1%,自由度为k=2,按三角分布，则分析仪器的相对不确定度为：rel(仪器) =4.0810-3B类不确定度来源一览表序号来源符号数值1标准溶液配制和稀释rel(c)5.0110-32工作曲线拟合rel(f)1.1410-23试样质量rel(m)3.2410-54试样最终定容体积rel(v)7.2110-45试样的可溶性固形物含量rel(B)5.710-46分析仪器rel(仪器)4.0810-3根据以上分量，B类相对不确定度为：rel(B) =1.3110-2六合成标准不确定度rel=2.02=2.6710-2七扩展不确定度：取包含因子为k=2,置信水平为95%，扩展不确定度U（95）=Krel=22.6710-2=5.3410-2八结果报告：浓缩苹果清汁中富马酸的含量为：2.020.05mg/kg；包含因子K=2，置信水平约为95%
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