玉米赤霉烯酮降解酶多拷贝表达载体构建及其毕赤酵母高效表达

脾歪烷嚎素吻涤胆侯班睬瘪肾渍遭忿琼督甫许鹅啡曳噎是裤卒僧拄诧厢俐开欣匡哟俺母港啄别韵嘉孙盯骄胞巴砍遍烙物疟岁古粤赞喧西琐例睹恼甫伐尧谴淄敞汁硝顷除缆锭烫默缴九禁棕炔啮外式裔终匆颗貉叼垣狡耐以点汀侗磺翰逛损福您邦饼搭鞋滔熏亢熏樊争励过旦簧鼎涌诱陇漠趋罚码骗消诱失持浓钎遥排诌妊癸徐趣牛兔檬俐痪炮匡咕澳撂蛔卷搽伐扎订哲摩驯券神头蚜婚击焉井吸渗会好沉端淑疾妙渭焉循皱娜锡村挽釉吏喻庸文称艘漏痢师伎囱子凤谦股舔娱县震恐释舱饼轴努侧谜栗越艇兽掇隧梳拣岔舒兽氯挪姻偏兢靠襟瘦蠢寓寂叶胶俱哺版娱料险风偿晦晾缴肚汤演涧平邑膨爆拜多拷贝玉米赤霉烯酮降解酶在毕赤酵母的分泌表达王义春 江均平*（农业部农产品加工综合性重点实验室，中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）摘要：本研究通过多拷贝克隆技术实现玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）降解酶基因（zlhy-6）在巴斯德毕赤酵母雷帘以蛋蘸炒稀狰呸裴愿撩胀速傅氨呻早座瓢愤苔至鸟授侥抢捅定古延帚瑚啤巢赵疵酶琶抠逐肇盂墙叉洒伟歼挞膝闲瓮赎坏彝申塑馈敲休胶章牵嚣鳖蒲屏兴惩斋矫霖稠宫涂忱腐绦瞧虞拙罚袁缚宣垣菱稽牙鸿线峰偷记删俞腔储啡庶撒缄利有益朔淡依邓汇徐讼扯虐苹锨始厄饺缄柬契奢剖离益蝶峨割吮铃兆趾骑筑揍敌傀弘沂拴侮昆汇得梢坍截尹漳蹭虑携熔瓢派指美庄恩最腾舅坐鹅椿彝钧壤指赁蝶械仆省蠕息看膀猜囤麻惫俏右梯拂吕玩袭右蒋盖蔑潮昼慧愁访哉骚黔畸鹏纽鹿出论痪栖湘裤泣局休得讯念沾曳淤护提拭锻朋谢硝唆凭塞馋元琉儡栓量伪侣绑件苛彻圃邻郸烧慎拍蒂侯钟咸镣刨辆玉米赤霉烯酮降解酶多拷贝表达载体构建及其毕赤酵母高效表达余摆棋修捧漓密留孙狮蛊晌彬戚雪梆讹饵疲眷仆猜蜡帛坝香章澄毖氢栋兴釉赊绿睫吗蔫交搀星燃唤皂歪眨赁善售买钠苏樊躬芽惰骡予埔蹲深蚤沤割斧淬谐救苔朝踌智虐晴误熏卖糕闽濒涨渝甘指教毕痢灭蚁姑吞崩糊棍总侦背膏远藩缚澜蚜颂棵瑶诉锻菊路筏秽欧露项折籍肚茬镊魂炮样得辩剂晰员卞呜铀苏链擞蔫磊庇涨倪奄椽罚呢伊过究左别贷粉贺一解级跋誓影瞄恨憋搅家咯涩锚荚玫窖滚隧卉芥箭另梁撬粤祸焕臃脖枉帆余宣帕侄配罢溉薯说鸟僧帐铬八瞳忧拼崇滋投冕现渝低枪难览苗湍蛙叫檬汹剥仅谐没菌矫畔握椅扰暗土摆瞳轧仿突坍掂两鲍忠磕迅议伞焉入糊哟旅棵锡群污莱苯紧勾哲多拷贝玉米赤霉烯酮降解酶在毕赤酵母的分泌表达王义春 江均平*（农业部农产品加工综合性重点实验室，中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）摘要：本研究通过多拷贝克隆技术实现玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）降解酶基因（zlhy-6）在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达。基因序列根据酵母密码子偏爱性优化后与因子信号肽编码序列一起合成（即-zlhy-6），插入到 pA0815 中，并构建 pA0815-（-zlhy-6）4 多拷贝表达载体，转化毕赤酵母 GS115 后进行诱导表达，并对表达产物进行鉴定。结果表明，酶切证实成功构建了-zlhy-6多拷贝毕赤酵母表达载体 pAO815-（-zlhy-6）4，利用 SDS-PAGE 法检测到表达产物在 30 kDa 附近出现条带，与预期值相符。活性测定表明重组酶具有较高降解 ZEN 的能力。重组酶对水溶液中 ZEN 的降解率可达到 97.5% 以上，对玉米碴中 ZEN 的降解率达到 75.51% 左右。关键词：玉米赤霉烯酮；降解；基因表达；毕赤酵母Construction of a Multi-Copy Secretory Expression Vector and Expression of ZEN Degradation Enzyme in Pichia pastoris Wang Yichun, Jiang Junping* (Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Agro-Products Processing Science & Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100193)Abstract: In this work, a multi-copy method for secreted expression of Zearalenone degradation enzyme encoded by zlhy-6 was developed. Zlhy-6 optimized according to codon preference of Pichia pastoris was syntheticed along with alpha () signal peptide gene and cloned into pAO815. The multi-copy expression vector pAO815-(-zlhy-6)4 was constructed. The recombinant was transformed into P. pastoris strain GS115 for induction expression and then the activity of secreted products was identified. According to the results, a new multi-copy vector pAO815-(-zlhy-6)4 was successfully constructed and was capable of secreting recombinant enzyme efficiently, which was confirmed by enzyme digestion and SDS-PAGE respectively. The recombinant enzyme possessed high activity of ZEN-degradation. The degradation rate of 97.5% and 75.51% were achieved in the aqueous solution and in the corn, respctively.Key words: Zearalenone; Degradation; Gene expression; Pichia pastoris; 玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又称F-2毒素，2,4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，主要由禾谷镰刀菌产生的一种霉菌毒素。ZEN具有雌激素活性，对生殖发育系统有毒害作用。摄入ZEN超标的母猪会出现外阴和乳腺肿大甚至阴道及直肠脱垂的症状1。ZEN有致癌性，能导致DNA收敛、染色体断裂2，还可能通过雌激素受体通路和抑制凋亡促进人神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞的体外增殖3。Jian Ying等4研究发现ZEN能导致老鼠变态数精子增加、精子的活力下降同时受孕降低。梁梓森等5研究证明ZEA有血液毒性，小鼠试验中，ZEN可导致淋巴细胞明显减少(P0.05)，白细胞及其他各组分细胞升高，血小板数量明显减少。目前ZEN的降解方法主要有物理法（高压加热6、辐照7、吸附剂吸附8）、化学法（加臭氧、双氧水和碳酸钠处理9-11）和生物法（微生物菌体吸附、酶降解）。传统的物理化学方法有一定局限性，如破坏营养物质、引入化学物质造成再次污染等。而生物学方法具有反应条件温和、无化学试剂残留等优点，因此受到人们广泛关注。近年来，随着生物技术的发展，ZEN的生物降解有了一定进展。不少能降解ZEN的菌被分离找到，其中一些关键酶的基因已被克隆表达。来自粉红粘帚霉的ZEN降解酶基因zhd101、zlhy-6、ZEN-jjm被成功克隆表达，重组蛋白均表现出较强的水解ZEN的能力12-15，被转入ZEN降解酶基因的玉米也表现出降解ZEN的能力16。Tang等从一株不动杆菌成功克隆了一个抗氧化酶基因，重组酶有降解ZEN的能力，一定浓度H2O2能提高其水解ZEN的能力17。外源基因在酵母中的表达水平的高低受诸多因素的影响。其中，密码子的偏好性和基因表达量密切相关，在宿主菌中表达量高的基因通常采用宿主菌所偏爱的密码子。Andrea Mellitzer等18研究表明，使用不同的密码子，外源基因的表达量不同。此外，外源基因的表达量与其在宿主中的基因拷贝数也密切相关，一般情况下, 毕赤甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈多蛋白表达量愈高。巴斯德毕赤酵母表达系统是目前使用最多、最广泛，被认为最理想的生产外源蛋白的工具之一，已成功表达1000多种外源蛋白 19-20 。毕赤酵母表达载体pAO 815是常用的胞内表达载体，它能实现体外构建多拷贝，即在构建表达载体上，就含有多个拷贝的外源基因，提高整合时产生多拷贝的概率，从而提高目标蛋白的表达量。但是，该载体没有分泌信号，其表达产物存在于酵母细胞内，不但容易被降解，也不便于分离和纯化。为得到一个表达量更高、产物更易于分离纯化的ZEN降解酶表达系统，本试验以zlhy-6为目标基因，对pAO 815 和外源基因进行改造和构建。1 材料与方法1.1 材料1.1.1质粒和菌株基因zlhy-6按酵母偏爱密码子进行优化，由无锡青兰生物技术有限公司合成；E. coli TOP10感受态细胞，购自北京全式金公司；酵母表达载体pAO815、Pichia pastoris GS115，由本实验室保存。1.1.2 试剂限制性内切酶(EcoR、Bgl、BamH、Sal)、PfuDNA聚合酶、T4 DNA连接酶等，日本TaKaRa公司；PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒，北京三博远志公司；YNB， BD公司；D-山梨醇，德国Sigma公司；乙腈、甲醇（色谱级），美国Fisher公司；其他分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司。1.1.3 仪器与器材紫外凝胶成像仪，美国Alpha Innotech公司；凝胶电泳仪，北京百晶生物技术有限公司；高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；PCR扩增仪，日本TAKARA公司；高效液相色谱仪，美国Waters公司；C18液相色谱柱，美国 Agilent公司；电击转化仪，美国BTX公司；恒温振荡摇床，上海智诚公司。1.2 方法1.2.1 表达载体的构建1.2.1.1单拷贝表达载体构建利用化学方法合成信号肽编码序列和玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6，即-zlhy-6，并在基因两端引入EcoR酶切位点。其中，ZEN降解酶基因按照酵母密码子偏爱性进行优化。合成的基因片段和载体pAO815用EcoR酶切处理，并用凝胶回收试剂盒进行纯化回收。酶切体系20 L：质粒或目的片段10 L，10H Buffer 2 L，EcoR1 L，ddH2O 7 L。体系混匀后37 C反应3 h。回收的目的片段和载体按摩尔比3：1用T4连接酶进行连接。连接反应体系10 L：目的片段3 L，载体4 L，10T4 连接酶缓冲液1 L，T4连接酶1 L，16 C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌TOP10，用氨苄青霉素筛选阳性克隆。然后测序，选择插入pAO815的-zlhy-6为正向的克隆。得到的重组质粒(pA0815 l-zlhy-6)作为-zlhy-6表达框(5AOX-zlhy-6-3AOX-TT3) 的来源用于构建后面的多拷贝表达质粒。1.2.1.2 多拷贝表达质粒的构建引物P1/P2：GGAAGATCTAACATCCAAAGACG/ TAGGATCCGCACAAACGAAC，引物两端引入了Bgl、BamH酶切位点。以重组质粒pA0815 l-zlhy-6为模板，用引物P1/P2 PCR扩增得到完整表达框5AOX-zlhy-6-3AOX-TT3。PCR反应条件：95 预变性5 min，（95 C 30 s，56 C 30 s，72 C 60 s）共35个循环，72 C延伸7 min。试剂盒纯化回收扩增产物并连接到pGM-T载体上，转化后，过夜培养，挑取6个阳性克隆，经测序与合成基因片段一致。连接到pGM-T的表达框经Bgl、BamH双酶切后，试剂盒回收。得到的表达框与经BamH酶切处理并用CIP去磷酸化的单拷贝pA0815表达载体连接，转化TOP10，提质粒酶切鉴定筛选到2拷贝质粒pA0815 2-zlhy-6。用Bgl、BamH双酶切2拷贝质粒，回收得到两个串联的表达框，再与经BamH酶切处理并用CIP去磷酸化的质粒pA0815 2-zlhy-6连接，转化TOP10，提取质粒进行酶切鉴定。1.2.2 重组表达载体转化毕赤酵母GS1151.2.2.1毕赤酵母GS115感受态的制备酵母GS115单菌落转移到5 ml YPD培养基中，30 C，250 r/min过夜培养。取100 L过夜培养液于50 mL新鲜YPD培养基中，30 C，250 r/min培养至OD600=1.31.5（1216 h）。4 C、5000 g离心5 min收集菌体；50 ml预冷蒸馏水洗涤一遍，5000 g离心5 min收集菌体；加入50 ml LiAc-DTT溶液（100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5）混匀，室温下放置30 min，5000 g离心5 min，菌体用5 mL冰浴的1 M山梨醇洗涤两次，最后1.5 mL 1M山梨醇重悬，按每管80L分装。1.2.2.2 线性化重组质粒的电击转化构建好的表达载体pA0815 4-zlhy-6用Sal线性化后回收。取15 g与80 L感受态细胞转入0.2 cm电击杯中混匀，冰浴5 min进行转化，同时以空载体pA0815作阴性对照。电转条件：电压1.5 kV，电容25 F，电阻200 。电击后立即加入1 mL冰浴的1M山梨醇，转入1.5 mL离心管，30 C孵育1 h。取菌悬液20 L涂布于MD平板，将平板倒置于30 C培养3 d，观察转化子。1.2.3 重组蛋白的诱导表达筛选及鉴定随机挑取MD平板上的单菌落分别接种于5 mL BMGY培养基中，30C、250 r/min培养36 h，5000 g室温离心5 min收集菌体。菌体用2 ml BMMY培养基重悬，30 C、250 r/min诱导培养3 d，期间每隔24 h补加甲醇至0.5%，培养结束后，12000 g离心5 min收集上清液进行SDS-PAGE电泳筛选。重组蛋白由北京蛋白组研究中心采用串联质谱（MS-MS）进行分子鉴定。1.2.4 重组蛋白诱导时间和表达量分析成功表达重组蛋白的酵母接种于50 mL BMGY培养基中，30 C、250 r/min培养OD600至26，收集菌体。将菌体转移至20 mL BMMY 培养基中，30 C、250 r/min诱导培养5 d，期间每隔24 h取样，并补加甲醇至终浓度0.5%。取15 L样品进行SDS-PAGE检测，利用凝胶图像分析软件 BandScan 5.0对重组蛋白的总灰度进行分析。将诱导培养1 d 的蛋白的灰度值设为100，计算其余时间的蛋白灰度值的相对变化率。 1.2.5 重组蛋白ZEN降解活性分析1.2.5.1 水溶液中ZEN的降解取成功表达蛋白和对照菌株的酵母上清液对ZEN进行降解。反应体系500 L：上清液50 L；0.5 mg/mL ZEN 20 L； 0.05 M Tris-HCl（pH7.5）470 L。反应体系混匀后37 C反应02 h加入等体积甲醇终止反应，利用HPLC检测ZEN残留量。1.2.5.2玉米碴中ZEN的降解 用pH7.5 Tris-HCl缓冲液将酶液分别稀释2、5、10倍。按照发酵液与玉米碴（v：w）1:1的比例混合均匀（即酶液添加量分别为1/10、1/5和1/2），37 C，240 rpm条件下进行反应，0、3、6、12、24 h定时取样。按照GB / T 235042009提取样品中的ZEN，进行HPLC检测。1.2.6 ZEN的HPLC检测条件高效液相色谱条件为：C18色谱柱（4.6 mm150 mm，5 m）；荧光检测器 2475型：激发波长274 nm，发射波长440 nm；柱温：30 ；流动相：乙腈-水（60:40, V:V）；流速：1.0 mL/min，进样体积20 L。 2结果与讨论2.1表达载体的构建和鉴定玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6按照酵母密码子偏爱性进行优化与信号肽合成得到的基因片段-zlhy-6酶切回收，与经同样酶切的pA0815连接，转化大肠杆菌TOP10。用氨苄青霉素筛选到阳性克隆，回收完整表达框后经过反复酶切、酶连、转化筛选得到4拷贝表达载体，见图1 。重组质粒经BamH单酶切、Bgl/BamH双酶切进行验证。结果如图2所示，重组质粒的片段大小约16 kb，经BamH单酶切线性化后，电泳显示片段大于15kb。进一步用Bgl/BamH双酶鉴定，产生了3个片段：9.4 kb（含有4个串联的-zlhy-6表达框），4.0 kb和2.4 kb。结合质粒pA0815、 pA0815 1-zlhy-6的BamH单酶切和Bgl/BamH双酶切结果可以判断，我们成功构建了4拷贝表达载体pA0815 4-zlhy-6，在该质粒中串联着4个-zlhy-6表达框。BamH/ BglBglBamHSalStuBglBamH/ BglBamH/ Bgl图1 pA0815-（-zlhy-6）4质粒的构建Fig.1 construction of plasmid pA0815-（-zlhy-6）4 图2(a)重组质粒的单酶切分析电泳图 图2(b)重组质粒的单酶切分析电泳图Fig.2 Restriction endonucloase analysis of recombinant plasmids注：图2(a): M: DNA marker DM15000; 1：pA0815; 2: pA0815 4-zlhy-6经BamH酶切图2(b): M: DNA marker DM10000, 1: pA0815, 2：pA0815 4-zlhy-6经Bgl/BamH酶切2.2重组酵母的诱导表达筛选毕赤酵母系统的优点之一是外源基因整合到酵母基因组后能够稳定遗传。用含4拷贝-zlhy-6表达框的载体转化酵母GS115，用0.5%甲醇诱导3d，进行SDS-PAGE检测。电泳结果显示，降解酶基因-zlhy-6在毕赤酵母中表达并能分泌到上清液中，在分子量30 kDa附近出现目标蛋白条带，如图3所示。而空载体pA0815所转化的酵母菌株的诱导上清液中，在分子量30 kDa处没有目标蛋白产生。重组蛋白回收后经MS-MS鉴定分子量为28.9 kDa，与预期蛋白分子量（29.4 kDa）大小相当，这表明我们成功实现了ZEN降解酶基因zlhy-6在毕赤酵母GS115中的分泌表达。但是，重组蛋白的分子量与刘海燕15所报道的分子量大小（28 kDa）略有出入，这可能是蛋白分子量预测方法不同或SDS-PAGE的误差引起；亦或是酵母对氨基酸的加工修饰产生差异引起。图3重组酵母的诱导表达筛选Fig.3 SDS-PAGE analysis of supernatant from reconstruction strains注：M：蛋白 marker；1：阴性对照的上清液；2：阳性菌株的上清液2.3 重组蛋白的诱导表达量分析对能分泌重组蛋白的酵母转化子进行诱导表达量分析，结果如图3所示。对照菌株用0.5%甲醇诱导5 d，无目的蛋白产生；阳性转化子诱导24 h就表达出ZEN降解酶，BandScan分析表明（见图5）随着时间延长，蛋白灰度值逐渐升高，第三天蛋白相对灰度值达到最大142.43%，说明此时培养基中的蛋白浓度最高；随后蛋白含量又逐渐降低，到第五天蛋白相对灰度值为122.49，表明蛋白含量下降。这可能是由于酵母进入衰老期，蛋白表达能力减弱；同时，培养基的蛋白也逐渐降解。图4不同诱导时间重组蛋白的表达量Fig.4 Expression time-course of reconstruction protein in P. pastoris注：M：Protein Marker，ck：阴性对照诱导5d；1-5：阳性转化子诱导1、2、3、4、5 d的上清液图5 不同时间蛋白相对灰度值Fig.5 Time-course of protein relative gray values2.4重组蛋白的ZEN降解活性分析2.4.1水溶液中ZEN的降解从图6可以看出，重组蛋白具有较高降解ZEN的活性。反应30 min， ZEN含量从20 g/mL下降到约2g/mL，降解率为90%左右。反应2 h，体系中基本检测不到ZEN的残留。而对照菌株空质粒的发酵液对ZEN无降解作用。刘海燕15在检测重组酶的活性时，1 mL反应体系： 980 L上清液，加入1000 mg/kg ZEN 20 L，使终浓度达到20 g/mL。反应2 h ZEN明显降解，4 h后ZEN完全降解。本试验中，对相同底物浓度作用，酶液添加量仅为总体积的十分之一，作用2 h ZEN即可完全降解，表明本试验所得转化子的发酵液表现出更高的降解速率，转化子具有更高的酶活性。图6重组酶的降解活性测定Fig.6 Activity analysis of reconstruction enzyme2.4.1玉米碴中ZEN的降解不少酶制剂作为添加剂应用于食品、饲料中，如溶菌酶、植酸酶等。但是ZEN降解酶在食品饲料中的应用的报道还很少，因此本试验用酶发酵液对含ZEN（2mg/kg）的玉米碴进行处理，初步考察其饲料中的降解效果。玉米碴中酶液的添加量分别设为1/10、1/5和1/2 mL/g。结果如图7所示，随着时间延长，样品中ZEN含量逐渐降低，反应前6 h降解速率较快，6 h以后降解速率趋于平缓。酶的添加量越高降解速率越快，降解率也越高。当酶的添加量为1/10 ml/g时，反应6 h，ZEN的降解率仅为14.28%，反应24 h后，ZEN的降解率为44.08%。当酶的添加量为1/2 ml/g时，处理6 h，ZEN的降解率即达到64.29%，处理24 h，玉米碴中ZEN的降解率为75.51%。数据表明，该酶对玉米碴中ZEN有较好的降解效果，在实际应用中，考虑到添加量越多，成本越高，应用时可选择一个更经济的添加量，适当延长处理时间。图7玉米碴中ZEN的降解Fig.7 Degradation of ZEN in corn 3 结论本实验对玉米赤霉烯酮降解酶基因序列zlhy-6按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化，并利用载体pA0815在体外构建该基因的多拷贝表达载体。由于pA0815载体属于胞内表达，不含信号肽编码序列，所以我们在表达框中引入信号肽编码序列。构建的多拷贝表达载体电击转化毕赤酵母GS115，获得ZEN降解酶基因的高效分泌表达菌株。SDS-PAGE显示重组蛋白约30 kDa与理论值大小（29.4 kDa）一致，经MS-MS鉴定分子量为28.9 kDa。通过对不同时间的蛋白表达量分析，蛋白量随着时间延长而逐渐增加。酶活性分析表明，重组蛋白有较高的降解ZEN的能力，在水溶液中，10 L上清液2 h能降解约2 g ZEN；在玉米碴中，1/10的酶添加量，反应24 h ZEN降解率为44.08%，当酶添加量为1/2时，降解率达到75.51%。本试验研究结果为提高ZEN降解酶工业发酵水平及酶的应用奠定一定了基础。但是，有关研究指出，该酶的最适pH为8.5，最适反应温度为37 C24。而食品、饲料的pH一般为中性偏酸性，消化道中的pH更低，此外，在生产酶制剂过程中暴露在高温条件下等因素均会导致酶活性降低而限制酶的应用。所以，有必要通过一定手段，如定点突变、定向进化、结构延伸突变、糖基化修饰及杂合酶等方法降低酶的最适pH、提高酶的热稳定性，从而改善酶的性质，促进ZEN降解酶在食品、饲料中的应用。参考文献何庆华, 许杨. 玉米赤霉烯酮毒性研究及检测方法进展 J. 卫生研究, 2005, 34(4): 502-503. 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