DNA测序技术及其应用学习教案

会计学1DNA测序技术及其应用测序技术及其应用引言引言测序技术的应用与展望测序技术的应用与展望第一代测序技术第一代测序技术第二代测序技术第二代测序技术第1页/共65页第2页/共65页人类基因组计划（人类基因组计划（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP）于）于19901990年正式启动，其主要目标有：识别人类年正式启动，其主要目标有：识别人类DNADNA中所有基因（超过中所有基因（超过1010万个）；测定组成人类万个）；测定组成人类DNADNA的的3030亿碱基对的序列亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于伦理、法律和社会问题。已于20032003年完成。年完成。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了科学工程，它奠定了2121世纪生命科学发展和现代世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。大意义和商业上的巨大价值。第3页/共65页 测序技术最早可以追溯到测序技术最早可以追溯到20世纪世纪50年代。年代。 早在早在1945年年就已经出现了关于早期测序技术的报就已经出现了关于早期测序技术的报导，即导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。苷酸序列。19771977年年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和终止法和Gilbert等发明的化学降解法，等发明的化学降解法，标志着第一代标志着第一代测序技术的诞生测序技术的诞生。 此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括技术，包括Roche公司的公司的454技术技术、Illumina公司的公司的SolexaSolexa技术技术和和ABI公司的公司的SOLiD技术技术。第4页/共65页 最近，最近，Helicos公司的单分子测序技术、公司的单分子测序技术、Pacific Biosciences公司的单分子实时公司的单分子实时( (Single Molecule Real Time, SMRT) )测序技术和测序技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术。术被认为是第三代测序技术。 测序技术正在向着高通量、低成本、长读取测序技术正在向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。长度的方向发展。第5页/共65页第6页/共65页第7页/共65页第8页/共65页第9页/共65页第10页/共65页第11页/共65页第12页/共65页 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH第13页/共65页第14页/共65页第15页/共65页第16页/共65页3730全自动测序仪第17页/共65页第18页/共65页第19页/共65页 第一代测序技术在分子生物学研究中发第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用挥过重要的作用, ,如人类基因组计划如人类基因组计划(human (human genome project,HGP)genome project,HGP)主要基于第一代主要基于第一代DNADNA测测序技术。目前基于荧光标记和序技术。目前基于荧光标记和SangerSanger的双脱的双脱氧链终止法原理的氧链终止法原理的荧光自动测序仪荧光自动测序仪仍被广泛地仍被广泛地应用。应用。第20页/共65页第21页/共65页 基因组基因组DNA DNA DNA DNA片段（片段（cDNAcDNA）构建构建ssDNAssDNA文库文库测序测序（聚合酶合成测序聚合酶合成测序，连接酶合成测序连接酶合成测序） 由于所有的克隆都在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行，每个延伸由于所有的克隆都在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，从而获得测序数据。反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，从而获得测序数据。DNADNA序列延伸序列延伸和成像检测不断重复，最后经过计算机分析就可以获得完整的和成像检测不断重复，最后经过计算机分析就可以获得完整的DNADNA序列信息序列信息。 第22页/共65页 在在聚合酶聚合酶、硫酸化酶硫酸化酶、荧光素酶荧光素酶和和双磷酸酶双磷酸酶的作用下，将每一个的作用下，将每一个的聚合的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测检测序列的目的。序列的目的。第23页/共65页硫化酶硫化酶荧光素酶荧光素酶第24页/共65页第25页/共65页指示器指示器相机相机PTPPTP盒盒第26页/共65页 454 454测序法的突测序法的突出优势是出优势是较长的读长较长的读长，目前，目前GS FLXGS FLX测序系统的序列读长已超过测序系统的序列读长已超过400 bp400 bp。虽然。虽然454454平平台的测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对台的测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对于那些需要长读长的应用，如从头测序，它仍是最理于那些需要长读长的应用，如从头测序，它仍是最理想的选择。想的选择。 缺点是缺点是无法准确测量同聚物的长度无法准确测量同聚物的长度。第27页/共65页 Illumina公司的新一代测序仪公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由最早由Solexa公司研公司研发，利用合成测序发，利用合成测序( (Sequencingby Synthesis) )的原理，实现自的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。动化样本制备及大规模平行测序。原理：原理： 将基因组将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即（即Flow cell），这些），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后片段经过延伸和桥式扩增后，在，在Flow cell上形成了数以亿上形成了数以亿Cluster，每个，每个Cluster是是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序进行测序。第28页/共65页第29页/共65页第30页/共65页第31页/共65页 GenomeAnalyzer系统需要的系统需要的样品量低样品量低至至100ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到，配对末端读长可达到250bp，每次运行后可获得，每次运行后可获得超过超过20 GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。是性价比较高的新一代测序技术。第32页/共65页 SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：文库准备文库准备扩增扩增微珠与玻片连接微珠与玻片连接连接测序连接测序第33页/共65页第34页/共65页第35页/共65页第36页/共65页 超高通量超高通量是是SOLID系统最突出的特点，系统最突出的特点，目前目前SOLID 3单次运行可产生单次运行可产生50 GB的序列的序列数据，相当于数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。倍人类基因组覆盖度。第37页/共65页第38页/共65页 第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用和应用, , 但是由于其但是由于其测序速度、成本、准确度测序速度、成本、准确度等关键等关键问题的解决仍存在困难问题的解决仍存在困难, ,研究者们很快将目光转向了更研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。高更新的测序解决方案。 单分子测序也就应运而生。单分子测序也就应运而生。 20092009年年1212月月, ,中科院北京基因组研究所与浪潮成立中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所中科院北京基因组研究所浪潮基因组科学联合实验室浪潮基因组科学联合实验室”第39页/共65页三代测序技术是以三代测序技术是以单分子测序单分子测序为特点的测序技术为特点的测序技术v 单分子即时单分子即时DNA测测序技术序技术( (SMRT) )v HeliScope单分子测序单分子测序v 基于荧光共振能量转移的即时基于荧光共振能量转移的即时DNA测序测序v 纳米孔单分子测序技术纳米孔单分子测序技术第40页/共65页第三代测序技术第三代测序技术1 1、目前一期的读取速度为目前一期的读取速度为3bp/ s3bp/ s2 2、它实现了、它实现了DNADNA聚合酶内在自身的聚合酶内在自身的processivity（延（延续性，也就是续性，也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很长的片聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。段），一个反应就可以测非常长的序列。 3 3、它的精度非常高，达到、它的精度非常高，达到99.9999%99.9999%。第41页/共65页标记荧光基因标记荧光基因DNA聚合酶作用 显微镜下进行荧光探测显微镜下进行荧光探测 零级波导的纳米结构零级波导的纳米结构来实现即来实现即时观察和背景荧光干扰时观察和背景荧光干扰第42页/共65页DNA聚合酶第43页/共65页 优点：优点：采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱单个碱基基的荧光，从而克服了第二代测序必须用的荧光，从而克服了第二代测序必须用PCRPCR扩增出数千个拷贝以增加信号亮度的缺扩增出数千个拷贝以增加信号亮度的缺陷。陷。DNADNA聚聚合合酶酶荧光标记荧光标记的的dNTPdNTP产生荧光产生荧光 CCD记录记录发生了碱基延伸反应发生了碱基延伸反应平面基板模拟图平面基板模拟图第44页/共65页能量第45页/共65页 DNADNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔, ,利利用核酸外切酶的特性来识别出不同的用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNADNA碱基碱基 优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对DNADNA进行标记，也就省去进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和了昂贵的荧光试剂和CCDCCD照相机。照相机。内部：核酸外切酶和环式糊精由生物分子组成的纳米孔由生物分子组成的纳米孔第46页/共65页第47页/共65页第48页/共65页第49页/共65页第50页/共65页完成全基因组测序的部分的物种完成全基因组测序的部分的物种第51页/共65页第52页/共65页第53页/共65页 转录组测序的研究对象为特定细胞在某转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有一功能状态下所能转录出来的所有RNARNA的总的总和，包括和，包括mRNAmRNA和非编码和非编码RNARNA。转录组测序是。转录组测序是指用新一代高通量测序技术对物种或者组织指用新一代高通量测序技术对物种或者组织的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。第54页/共65页第55页/共65页第56页/共65页第57页/共65页第58页/共65页第59页/共65页第60页/共65页利用光学成像技术设计的新型利用光学成像技术设计的新型DNADNA测序简图测序简图第61页/共65页原理：当光照在一个物体上时，物体离光源越近，原理：当光照在一个物体上时，物体离光源越近，离成像面越远，则形成的影子越大，当离成像面越远，则形成的影子越大，当DNADNA被光照后，被光照后，可在光敏成像板上留下图像，通过比对可直接测定可在光敏成像板上留下图像，通过比对可直接测定DNADNA序列。序列。组件介绍：组件介绍：1.1.光源需要条形光源，光源与高通透玻璃板光源需要条形光源，光源与高通透玻璃板之间要有金属通道，减少光能辐射递减之间要有金属通道，减少光能辐射递减 2. 2.高通透玻璃板上含有固定高通透玻璃板上含有固定DNADNA的芯片的芯片 3. 3.光敏成像板为光敏变色材料光敏成像板为光敏变色材料 第62页/共65页所面临的难题：所面临的难题：DNADNA在固定时要防止断裂，折叠，扭曲，在固定时要防止断裂，折叠，扭曲，变形变形 需要找到合适的光源，合适的波需要找到合适的光源，合适的波长避免发生衍射长避免发生衍射光源与光源与DNADNA的距离以及的距离以及DNADNA与光敏与光敏成像板的距离有待探究成像板的距离有待探究选取何种光敏材料，选取何种成选取何种光敏材料，选取何种成像技术像技术数据分析系统需要建立比对系统数据分析系统需要建立比对系统第63页/共65页第64页/共65页