顶空气相色谱及其应用技术

顶空气相色谱及其应用技术第一节概述 一、引言 二、顶空分析基本原理 三、顶空气相色谱的分类与比较第二节静态顶空色谱技术与应用 一、静态顶空色谱的理论依据 二、静态顶空色谱的仪器装置 三、影响静态顶空色谱分析的因素 四、静态顶空色谱的方法开发和常用技术 五、静态顶空色谱的应用第三节动态顶空色谱技术与应用 一、吹扫捕集进样技术的基本原理 二、吹扫捕集进样装置 三、吹扫捕集操作条件选择 四、影响分析精度的因素 五、吹扫捕集进样技术的应用第四节热解吸进样技术与应用 一、热解吸进样技术 二、热解吸进样技术的应用第一节概述引言在讨论大体积进样（LVI）时，我们强调了提高分析灵敏度的问题。同时指出，LVI可简化样品处理过程，提高工作效率。事实上，在色谱分析中，提高工作效率（即单位时间可分析的样品数）也是人们一直追求的目标。从填充柱到毛细管柱、从手动进样到自动进样、从常规色谱到快速色谱（见第六章）都是提高了工作效率。从目前的仪器看，GC本身的分析时间已经相当短了。相比之下，样品处理往往是最费时的。有统计数据表明，色谱实验室通常用&(的时间对样品进行处理，真正GC分析所用时间只有10%-15%，其余时间应用在数据处理和报告编辑等工作上。所以，如何加快或简化样品处理，就成为提高工作效率的关键问题。这方面人们已开发出很多好的方法，如固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME）、超临界流体萃取（SFC）等。然而，如果我们只对复杂样品中的挥发性组分感兴趣，比如废水中的有机挥发物、酒后架车司机血液中的酒精含量等等，用上述萃取方法显然较费时，在此情况下，顶空色谱分析往往是一种简单而有效的方法。所谓顶空分析是取样品基质（液体和固体）上方的气相部分进行色谱分析。也有人称之为液上色谱，其实并不准确。顶空的英文“headspace”原本指罐头食品盒中顶部的气体，由于历史的原因，人们一直延用该词泛指样品基质上方的气体，中文译作“顶空”是很合适的。其实顶空分析早在1939年就出现了，比GC还早10多年。由于GC是专门分析气体或样品蒸气的，故二者的结合便顺理成章了。1958年有人用顶空GC分析水中氢气的含量，1962年出现商品顶空进样器。今天，顶空色谱已经成为一种普遍使用的GC技术。世界各国都制定了有关顶空$%的标准方法，用于分析聚合物材料中的残留溶剂或单体、工业废水中的挥发性有机物，食品的气味等等。可以说，顶空色谱已成为一种广泛使用的分析方法，是GC家族中不可缺少的一员。本章我们就来讨论顶空GC的基本原理与应用，着重强调顶空GC分析方法开发和操作注意问题，并通过实例来说明其在各个领域的应用。顶空分析基本原理顶空分析是通过样品基质上方的气体成分来测定这些组分在原样品中的含量。显然，这是一种间接分析方法，其基本理论依据是在一定条件下气相和凝聚相（液相或固相）之间存在着分配平衡。所以，气相的组成能反映凝聚相的组成。我们可以把顶空分析看成是一种气粗萃取方法，即用气体作“溶剂”来萃取样品中的挥发性成分，因而，顶空分析就是一种理想的样品净化方法。传统的液液萃取以及SPE都是将样品溶在液体中，不可避免地会有一些共萃取物干扰分析。况且溶剂本身的纯度也是一个问题，这在痕量分析中尤为重要。而气体作溶剂就可避免不必要的干扰，因为高纯度气体很容易得到，且成本较低。这也是顶空GC被广泛采用的一个重要原因。 作为一种分析方法，顶空分析首先简单，它只取气相部分进行分析，大大减少了样品基质对分析的干扰。顶空气相色谱的分类与比较 顶空GC通常包括三个过程，一是取样，二是进样，三是GC分析。根据取样和进样方式的不同，顶空分析有动态和静态之分。所谓静态顶空就是将样品密封在一个容器中，在一定温度下放置一段时间使气液两相达到平衡。然后取气相部分进入GC分析。所以静态顶空GC又称为平衡顶空GC，或叫做一次气相萃取。根据这一次取样的分析结果，就可测定原来样品中挥发性组分的含量。如果再取第二次样，结果就会不同于第一次取样的分析结果，这是因为第一次取样后样品组成已经发生了变化。与此不同的是连续气相萃取，即多次取样，直到将样品中挥发性组分完全萃取出来。这就是所谓动态顶空GC。常用的方法是在样品中连续通入惰性气体，如氦气，挥发性成分即随该萃取气体从样品中逸出，然后通过一个吸附装置（捕集器）将样品浓缩，最后再将样品解吸进入GC进行分析。这种方法通常被称为吹扫-捕集（Purge&Trap）分析方法。 静态顶空和动态顶空（吹扫-捕集）GC各有特点，表5-5-1简单比较了二者的优缺点。实际上，静态顶空也可叫做连续气体萃取，得到类似吹扫&捕集的分析结果，只是其准确度稍差一些。很多样品用两种方法都可进行分析。表5-5-1 静态顶空GC和动态顶空（吹扫-捕集）GC的比较 还有一种进样方式叫热解吸进样，其实只是动态顶空分析的一种特定模式。比如分析大气污染物时，用一个装有吸附剂的捕集管，让一定量的空气通过该管，空气中有机物就被吸附在管中。然后将该管置于热解吸装置中（与吹扫!捕集进样的热解吸装置相同），与GC连接进样分析。第二节静态顶空色谱技术与应用静态顶空色谱的理论依据 让我们先来看一个容积为V、装有体积为V0液体样品的密封容积（图5-5-1），其气相体积为Vg，液相体积为Vs，则相比 当在一定温度下达到气液平衡时，可以认为液体的体积Vs不变，即Vs=V0。这时，气相中的样品浓度为cg，液相中为cs，样品的原始浓度为c0。则 这就是说，在平衡状态下，气相的组成与样品原来的组成为正比关系。当用GC分析得到cg后，就可以算出原来样品的组成，这就是静态顶空GC的理论依据。静态顶空色谱的仪器装置（一）手动进样装置 采用手动进样时，静态顶空所需设备较为简单，只要有一个控温精确的恒温槽（水浴或油浴），将装有样品的密封容器置于恒温槽中，在一定的温度下达到平衡后，就可应用气密注射器（普通液体注射器不适合于顶空进样）从容器中抽取顶空气体样品，注射入GC进行分析。这种手动进样方式有两个缺点，一是压力控制难以实现，因而进样量的准确度较差。样品从顶空容器到进入注射器过程中任何压力变化的不重现都会导致实际进样量的变化。有人采用带压力锁定的气密注射器较好地克服了这个问题。第二是温度的控制。注射器的温度低时，某些沸点较高的样品组分很容易冷凝，造成样品损失。有些标准方法（如美国ASTM方法）要求注射器温度在取样前置于90的恒温炉中加热，以避免样品的部分冷凝。然而，在取样和进样过程中还是很难保证注射器温度的一致性，故分析重现性往往不及自动进样。 有一种方法可以在一定程度上克服温度不恒定的问题。这就是采用六通阀和注射器结合，样品的温度由阀体温度控制，注射器只起泵的作用，将样品抽入进样阀的定量管。如图5-5-2所示，进样阀的原理及与GC的连接与相关内容的讨论完全相同。这样就消除了注射器温度的影响。 尽管如此，手动进样的静态顶空GC分析在样品温度、平衡时间和取样速度方面的控制精度还是不能与自动进样相比，在只作定性分析时，手动进样不失为一种经济的方法，但要作精确的定量分析，则最好用自动顶空进样装置。（二）自动进样装置 目前，商品化的顶空自动进样器有多种设计，但其原理基本可分为三种，下面分别介绍之。1.采用注射器进样 基于此原理设计的仪器往往是对普通自动进样器改进的结果，主要是采用气密注射器和样品控温装置。比如，日本岛津公司的HSS-3A/2B顶空分析系统就是在自动进样器样品盘的上方增加了一个金属加热块，通过样品盘下面的气动装置将样品瓶依次转移到加热块中，待气液平衡后，由注射器插入样品瓶取样并注入GC分析。可见，除了采用气密注射器，增加了样品的加热及平衡时间控制功能外，其余功能与普通自动进样器类似。当然，注射器一般也要有控温装置。此类顶空进样装置的主要问题是不能控制样品的压力，故使用较少。2.压力平衡顶空进样系统 这类进样系统的原理如图5-5-3所示，样品加热平衡时，取样针头位于加热套中图5-5-3（a）。载气大部分进入GC，只有一小部分通过加热套，以避免其被污染。取样针头用“O”形环密封。样品气液平衡后，取样针头穿过密封垫插入样品瓶，此时载气分为三路图5-5-3（b）：一路为低流速，由出口针型阀控制，继续吹扫加热套，另外两路分别进入GC和样品瓶，对样品瓶进行加压，直到样品瓶的压力与%& 柱前压相等为止（这就是压力平衡的意思）。然后，关闭载气阀图5-5-3（c），切断载气流。由于样品瓶中的压力与柱前压相等，故此时样品瓶中的气体将自动膨胀，载气与样品气体的混合气就通过加热的输送管进入了GC柱。控制此过程的时间就可控制进样量。压力平衡进样装置与GC共用一路载气，操作简便。如PE公司的HS-100型顶空进样器就是采用这种设计。采用这种装置时，必须控制平衡时样品瓶中的压力低于GC柱前压，否则，针尖一旦插入样品瓶，顶空气体就会在载气切断之前进入GC，造成分析结果的不准确。 实际工作中并不总能满足上述压力要求，比如样品平衡温度高时，顶空气体压力就高，若采用大口径的短毛细管柱进行分析，柱前压往往低于样品瓶中的顶空气体压力。这时，可以采用另一路载气对样品瓶加压，以防止GC载气切断前样品进入色谱柱。这一方法叫做加压取样。如PE公司的HS-40型仪器就具有这种功能。另外，也可在色谱柱后接一段细的空柱管以提高柱压降，这当然使仪器的连接变得复杂了。3.压力控制定量管进样系统 图5-5-4所示就是这种顶空GC分析装置的原理示意图，安捷伦（原惠普化学分析部）公司的HP7694和HP7694E就采用此设计。其分析过程可分为四个步骤： 第一步图5-5-4（a），平衡。即将样品定量加入顶空样品瓶，加盖密封，然后置于顶空进样器的恒温槽中，在设定的温度和时间条件下进行平衡。此时，载气旁路直接进入GC进样口，同时用低流速载气吹扫定量管，而后放空，以避免定量管被污染。先进的自动顶空进样器具有样品搅拌功能，以加速其平衡。 第二步图5-5-4（b），加压。待样品平衡后，将取样探头插入样品瓶的顶空部分，V4切换，使通过定量管的载气进入样品瓶进行加压，为下一步取样作准备。加压时间和压力大小由进样器自动控制。此时，大部分载气仍然直接进入GC柱。 第三步图5-5-4（c），取样。V1和V2同时切换，样品瓶中经加压的气体通过探头进入定量管。取样时间应足够长，以保证样品气体充满定量管，但也不应太长，以免损失样品。具体时间应根据样品瓶中压力的高低和定量管的大小而定，由进样器自动控制。一般不超过10s。 第四步图5-5-4（d），进样。V1、V2、V3和V4同时切换，使所有载气都通过定量管，将样品带入GC进行分析。 这样就完成了一次顶空GC分析。然后将取样探头移动到下一个样品瓶，根据GC分析时间的长短，在某一时刻开始对下一个样品重复上述操作。（三）顶空进样器的技术指标 由于平衡温度、平衡时间、加压时间和压力高低、取样时间、载气流速均影响进入GC的样品量，所以，自动顶空进样器必须对这些条件实现严格控制。表5-5-2列出了一种压力控制定量管装置的技术指标。顶空进样装置与GC的连接一般是比较简单的，即在输送管的末端连接一个注射针头，然后将针头直接插入GC进样口。这与普通GC进样类似，只是在整个分析过程针头一直插在进样口不抽出来。当然，输送管一定要有加热系统，以避免样品组分的冷凝。表5-5-2 一种压力控制定量管顶空进样装置的技术指标影响静态顶空色谱分析的因素 影响顶空GC分析结果的因素有两部分，一部分是与GC有关的参数，另一部分是顶空进样的参数。前者我们已在第一和二章作了详细阐述，这里不再重复。下面我们仅就顶空进样的一些问题进行讨论。（一）样品的性质 顶空GC最大的优点就是不需对样品作复杂的处理，而直接取其顶空气体进行分析，我们不用担心样品中不挥发组分对GC分析的影响。但是样品的性质仍然对分析结果有直接影响。这里所说的样品是指置于样品瓶中的“原样品”，而非进入GC的“挥发物”，因此要考虑整个样品瓶中的样品性质。 对于气体样品或者在一定条件下能全部转换为蒸气的样品，样品瓶中只有气相，而没有凝聚相。那么，这种样品与普通GC分析就没有太大区别了。要注意的是气体样品的采样温度和样品保存温度可能不同，常常是后者低于前者。在相对低温下保存样品时，有些组分就可能会冷凝，所以在分析时，要在平衡温度下放置一定的时间，使样品达到均匀的气相，以消除部分样品组分冷凝带来的误差。如果是将液体样品转换为气体，那么这个转换过程是需要一定时间的，不像普通GC中进样口的样品汽化那么快，不完全的汽化会使顶空样品与原样品的组成不同，从而影响分析结果的准确度，故也应在一定的温度下平衡足够的时间。 液体和固体样品较为复杂一些。这时样品瓶中起码有气-液或气-固两相，甚至气-液-固三相共存。顶空气体中各组分的含量既与其本身的挥发性有关，又与样品基质有关。特别是那些在样品基质中溶解度大（分配系数大）的组分，“基质效应”更为明显。这是顶空进样的一大特点，即顶空气体的组成与原样品中的组成不同，这对定量分析的影响尤为严重。因此，标准样品不能仅用待测物的标准品配制，还必须有与原样品相同或相似的基质，否则，定量误差将会很大。 实际应用中有一些消除或减少基质效应的方法，主要是：（1）利用盐析作用即在水溶液中加入无机盐（如硫酸钠）来改变挥发性组分的分配系数。实验证明，盐浓度小于5%时几乎没有作用，故常用高浓度的盐，甚至用饱和浓度。需要指出的是，盐析作用对极性组分的影响远大于对非极性组分的影响。此外，在水溶液中加入盐之后，溶液体积会变化，定量线性范围可能变窄，这些都是在定量分析中应该考虑的。（2）在有机溶液中加入水当然，水要与所用有机溶剂相溶。这可以减小有机物在有机溶剂中的溶解度，增大其在顶空气体中的含量。比如，测定聚合物中的2-乙基己基丙烯酸酯残留量时，样品溶于二甲基乙酰胺中，然后加入水，分析灵敏度可提高数百倍。（3）调节溶液的pH 对于碱和酸，通过控制pH可使其解离度改变，或使其中待测物的挥发性变得更大，从而有利于分析。（4）固体样品的粉碎物质在固体中的扩散系数要比在液体中小1到2个数量级，固体样品中挥发物的扩散速度很慢，往往需要很长时间才能达到平衡。尽量采样小颗粒的固体样品有利于缩短平衡时间。但是要注意，一般的粉碎方法会造成样品损失。比如研磨发热，挥发性组分就会丢失。故顶空GC中多用冷冻粉碎技术来制备固体样品。同时，用水或有机溶剂浸润样品（三相体系），也可以减小固体表面对待测物的吸附作用。 此外，稀释样品也是减小基质效应的常用方法，但其代价是减低了灵敏度。其他消除基质效应的技术，如全挥发技术等，将在下面讨论。 最后，样品中的水分也是一个影响因素。虽然静态顶空样品中水分含量常没有动态顶空那么大，但水溶液样品在浓度较高时，水蒸气会影响GC分离结果，特别是采用冷冻聚焦技术时。故应在色谱柱前连接除水装置，如装有氯化钙、氯化锂等吸附剂的短预柱。当然要保证被测组分不被吸附。（二）样品量 样品量是指顶空样品瓶中的样品体积，有时也指进入GC的样品量。其实后者应称为进样量。在顶空GC分析中，进样量是通过进样时间（压力平衡系统）或定量管（压力控制定量管系统）来控制的，它还受温度和压力等因素的影响。事实上，顶空GC分析中绝对进样量没有多大意义，重要的是进样量的重现性，只要能保证进样条件的完全重现，也就保证了重现的进样量。即使在定量分析中，一般也不需要知道绝对进样量的数值。顶空样品瓶中的样品体积对分析结果影响很大，因为它直接决定相比。在第二节我们曾导出一个方程： 对于一个给定的气液平衡系统，K和Co为常数，与顶空气体中的浓度成正比。也可是说，样品体积Vs增大时，减小，Cg增大，因而灵敏度增加。但对具体的样品体系，还要看K的大小。换言之，K时，样品体积的改变对分析灵敏度影响很小。而当K时，温度的影响非常明显。当K时，温度升高使K降低，但K+的变化很小，因此顶空气体的浓度变化也很小。比如，我们分析一个水溶液中的甲醇、甲乙酮、甲苯、正己烷和四氯乙烯，表5-5-3给出了这一体系在不同温度下的分配系数K值。用6ml的样品瓶，样品体积为1ml，这时相比为5。表中同时列出了1/（K+）值。表5-5-3 几种化合物在水-空气体系中的分配系数K 假设各组分在原样品中的浓度相同，那么。80的平衡温度与40相比，甲醇在顶空气体中的浓度将增加5.15倍，甲乙酮增加2.61倍，甲苯只增加25%，而正己烷和四氯乙烯则分别增加2.6%和10.4%。可见，温度的影响因组分的不同而异。对于甲醇和甲乙酮，提高平衡温度可大大提高分析灵敏度；对于甲苯和四氯乙烯则影响甚微，对于正己烷，其影响完全可以忽略。因此，平衡温度应根据分析对象来选择。 实际工作中往往是在满足灵敏度的条件下（还可通过其他方法提高分析灵敏度）选择较低的平衡温度。这是因为，过高的温度可能导致某些组分的分解和氧化（样品瓶中有空气），还可以使顶空气体的压力太高，特别是使用有机溶剂时（故应选择较高沸点的有机溶剂）。 这里顺便指出，有人可能会问：进样前加压是否会造成样品的稀释而降低分析灵敏度？其实不存在这个问题。因为我们测定的是浓度，而非摩尔分数。加压前后样品的体积不变，故不会影响灵敏度。最后强调一点，顶空GC分析中必须保证温度的重现性。除了平衡温度外，取样管、定量管，以及与GC的连接管都要严格控制温度。这些温度往往要高于平衡温度，以避免样品的吸附和冷凝。（四）平衡时间 平衡时间本质上取决于被测组分分子从样品基质到气相的扩散速度。扩散速度越快，即分子扩散系数越大，所需平衡时间越短。另外，扩散系数又与分子尺寸、介质黏度及温度有关。温度越高，黏度越低，扩散系数越大。所以，提高温度可以缩短平衡时间。 由于样品的性质千差万别，所以平衡时间很难预测。一般要通过实验来测定。方法是用一系列样品瓶（5-10）装上同一样品，每个样品瓶采用不同的平衡时间，然后进行GC分析。用待测物的峰面积A对平衡时间t作图，就可确定所需平衡时间。如图5-5-5所示，当平衡时间超过te时，峰面积基本不再增加，证明样品达到了平衡。 平衡时间往往要比分析时间长，换言之，顶空GC的分析周期往往是由平衡时间决定的。故缩短平衡时间是提高顶空GC分析速度的关键。从仪器来讲，可以采用重叠平衡功能来提高工作效率。比如一个样品的平衡时间为40min，而GC分析时间为15min。我们可以在第一个样品平衡15min, 后开始第二个样品的平衡。这样，当第一个样品分析完成后，第二个样品正好达到平衡，可立即开始进样分析。依此类推，当有多个样品需要分析时，就能有效地提高工作效率。自动顶空进样器均有此项功能，用户可预设置时间程序进行自动分析。 气体样品或可全部转化为气体的液体样品所需平衡时间要短一些（气体分子扩散系数是液体分子扩散系数的104-105倍），一般10min左右即可。液体样品的情况比较复杂一些，除了与样品性质、温度有关外，平衡时间还取决于样品体积。体积越大，所需平衡时间越长。而样品体积又与分析灵敏度要求有关。如前所述，对于分配系数小的组分，加大样品体积可大大提高分析灵敏度，所需平衡时间相应增加。对于分配系数大的组分，加大样品体积对提高灵敏度作用甚微，故可用小的样品体积来达到缩短平衡时间的目的。 缩短液体样品平衡时间的另一个有效办法是采用搅拌技术。现代仪器一般具备此功能，或者是机械振动搅拌，或者是电磁搅拌，而且还有几挡搅拌速度，可根据样品的黏度来选择。实验证明，对于分配系数小，在凝聚相中溶解度小的样品，采样搅拌方法可使平衡时间缩短一半以上。但对于分配系数大的样品，影响相对小得多。 固体样品所需平衡时间更长。除了提高温度可以缩短平衡时间外，减小固体颗粒尺寸，增大比表面可以有效地缩短平衡时间。此外，将固体样品溶解在适当的溶剂中，或用溶剂浸润固体样品，都是实际工作中常用的方法。（五）与样品瓶有关的因素1.样品瓶 顶空GC样品瓶的要求是体积准确、能承受一定的压力、密封性能良好、对样品无吸附作用。虽然过去人们也曾用过普通玻璃瓶，但现在大都用硼硅玻璃制成的顶空样品瓶，其惰性能满足绝大部分样品的分析。 在定量分析时，要涉及到相比的准确值，这就要求我们知道样品瓶的准确体积（容积），而不应简单地采样生产厂家的标称体积。一个简单的方法是先用天平称量空瓶重量，然后充满水再称量。根据水在称量温度下的密度（如25时为0.9971g/ml）即可计算出样品瓶的准确体积。实验证明，市售的顶空样品瓶其标称体积与真实体积之间有1%左右的误差。对同一批样品瓶，可以准确测定其中5个的真实体积，使用其平均体积作为该批样品瓶的真实体积即可。 市售样品瓶的体积有5-22ml多种，具体选用哪种，一要据仪器要求而定，二要看样品情况而定。液体样品多用10ml, 左右的瓶子就能满足要求，因为分析灵敏度是取决于待测组分在顶空气体中的浓度，或者说取决于相比，而不是样品量。所以，采用大体积样品瓶，如果不变，分析灵敏度也不会改善。固体样品因为样品本身的体积大（取样体积大一些能保证样品的代表性），故要用大一些的样品瓶。 第三个要考虑的因素是色谱柱。填充柱、大口径柱、或毛细管柱分流进样时，进样体积一般为0.5-2ml，这时需要大体积样品瓶。而用毛细管柱不分流进样时，进样体积往往不会超过0.25ml，故小体积的样品瓶就足以满足要求了。 顶空样品瓶最好只用一次，若要反复使用，就一定要保证清洁干净！建议的清洗方法是：先用洗涤剂清洗（太脏的瓶子可用洗液浸泡），然后用蒸馏水洗，再用色谱纯甲醇冲洗，最后置于烘箱中烘干。对于新购的样品瓶，一般可不经清洗直接使用，但要注意供货商的信誉。如果是第一次使用一个新的供货商的产品，最好先作一次空白分析，以证实样品瓶是否干净。2.密封盖 密封盖由塑料或金属盖加密封垫组成。有可多次使用的螺旋盖和一次使用的压盖两种。现在自动化仪器多采用一次性使用的铝质压盖，使用压盖器压紧后可以保证密封性能。 密封垫的材料主要有三种，即硅橡胶、丁基橡胶和氟橡胶。丁基橡胶垫价格低，硅橡胶垫耐高温性能好，氟橡胶垫惰性好。为了防止密封垫对样品组分的吸附，现在多用内衬聚四氟乙烯或铝的密封垫，选用时要看分析条件（温度）和样品具体情况而定。常规分析可用价格低的丁基橡胶垫，痕量分析则最好用有内衬的硅橡胶垫。必要时，通过空白分析来确证密封垫中的挥发物不干扰分析。 密封垫在刺穿一次（取样）之后，就可能会漏气，而且内衬垫扎穿之后就失去了保护作用，橡胶基体有可能吸附样品组分。所以，需要从一个样品瓶多次进样时，最好连续进行，不要把扎穿过密封垫的样品瓶放置一段时间后再用。相应地，在制备样品时，要将样品全部加入后再密封。比如加内标物时，若密封好再往瓶中加，就要扎穿密封垫，这对分析是不利的。静态顶空色谱的方法开发和常用技术（一）方法开发的一般步骤 与常规GC类似，方法开发的第一步是确定如何处理样品。如待测组分是否有足够的挥发性？如果挥发性太低，采用什么衍生化方法增加挥发性？固体样品如何粉碎？如果作为液体样品分析，使用什么溶剂？这些问题确定之后，就要选择适当体积的样品瓶。 第二步是根据待测组分确定GC分析条件，包括色谱柱、检测器及操作条件。这与普通GC分析相同，可以通过标准样品直接进样分析来优化分离条件。 第三步是确定平衡时间和平衡温度，参看上面所述的方法。 第四步是样品的初步分析，主要看灵敏度是否满足要求。如果待测组分在顶空气体中的浓度很高，还可通过改变GC条件（如改变分流比）、顶空取样条件（改变进样时间或定量管），以及稀释样品来控制色谱信号的大小。如果浓度太低，则要进一步优化顶空条件。如改变平衡温度、改变相比、消除基质效应等以提高分析灵敏度。最后还可采用冷冻富集技术（见下面的讨论）。如果样品中有不需要测定的高沸点组分，还可通过反吹技术（见下面的讨论）来缩短分析周期。 最后一步就是确定定量方法。稍后我们将讨论顶空GC与普通GC在定量分析方面的不同之处。 多次顶空萃取技术常常是方法开发的有用手段，下面我们将其详细讨论，然后介绍几种顶空GC常用的技术。（二）多次顶空萃取技术 静态顶空GC分析一般只对一个样品取样一次。如果在第一次取样后，让样品在相同条件下再达到平衡，也可取第二次样品进行分析。但是，由于已取了一次样，尽管分配系数保持不变，整个样品的组成已发生了变化，第二次顶空气体的组成就与第一次不同了。故第二次分析所得相同组分的色谱峰面积应该比第一次小。所以我们前面讲过，要作重复进样，最好是同时用几个样品瓶，每个样品瓶进样一次。不过，我们若从另一个角度看问题，从同一样品瓶重复取样进行分析，那么，原样品中待测组分的浓度就会逐次减小，直到最后被完全“萃取”。这样，每次分析所得峰面积之和就对应于原样品中该组分的总浓度。因为待测组分最后被完全萃取，所以不再有样品“基质效应”影响分析。这就是多次顶空萃取技术的基本思路。很显然，要将一个样品中的待测组分用顶空进样技术全部萃取完，分析时间将是相当长的。但是，已有人用数学方法研究了多次顶空萃取的理论问题，并得到了实验证实：只要作有限次（2-10次）的重复进样，就可根据数学公式外推计算出原样品中待测组分的总浓度。该理论的基本公式是假设浓度随时间的变化符合一级反应动力学，则： 这样就可通过两次顶空萃取进样的分析结果计算出无数次萃取的峰面积之和，亦即原样品中待测组分的总浓度，其前提条件是：lnAi与（i1）成线性关系。多次萃取技术在定量分析中的应用将在以后结合实际应用加以介绍。（三）反吹技术 所谓反吹技术就是改变气相色谱柱中的载气流动方向，将柱头滞留的高沸点、极性组分吹出色谱柱。这一技术在GC中经常应用，一是为缩短分析时间，二是为保护色谱柱。在顶空GC中反吹技术也是很重要的。因为顶空GC的分析对象多为易挥发组分，当我们对高沸点组分不感兴趣时，就可采取反吹技术将其放空。比如，石油化工的环境分析中，用顶空GC测定工业废水中的苯、甲苯、乙苯和二甲苯（合称为BTEX）时，常有一些高沸点烃类与BTEX共存一起进入色谱柱。若使这些不需测定的高沸点组分按正常操作流出色谱柱，就会延长分析时间。事实上，有些极性组分必须在升高柱温后才能流出色谱柱，这样也会不必要地增加柱温循环时间。如果我们在待测组分最后一个峰流出后，采用反吹技术就可将仍在柱头的高沸点组分放空，从而缩短分析时间。再比如在固体样品的分析中，所用的溶剂或分散剂常常比待测组分的沸点高，采用反吹技术也可消除这些溶剂峰，提高分析速度。如何实现反吹要看GC用什么色谱柱。对于填充柱来说，采用一个六通阀，另加一路载气就可进行反吹。如图5-5-6（a）所示，正常分析用第一路载气，反吹时用第二路载气，此时第一路载气直接进入检测器。用毛细管柱时原则上也可采用六通阀实现反吹，但更常见的是采用两根色谱柱、两路载气图5-5-6（b）。正常分析时，关闭第二路载气，当待测组分进入第二根色谱柱（分析柱）时，关闭第一路载气，同时打开第二路载气。这样，尚留在第一根色谱柱（预柱）中的组分就会被反吹掉，而第二根色谱柱则继续分析待测物。只要两路载气的压力调节适当，毛细管柱与第二路载气的连接无死体积，就可获得令人满意的结果。市场上有专用的三通接头可供选用，而现代仪器往往可以自动控制各个阀的切换，从而保证高效而重现的顶空GC分析。（四）冷冻富集技术 当顶空气体中待测组分的浓度太低（可能由于原样品的浓度太低，也可能由于组分的蒸气压太低），或者当检测器灵敏度不能满足分析要求，而需要加大进样体积时，冷冻富集技术是顶空GC常用的提高灵敏度的方法。冷冻富集与我们在冷柱上进样中讨论过的冷冻聚焦技术很类似，所不同的是。顶空样品已经是气体，“冷阱”的作用主要是使这些气体冷凝而富集。冷冻富集主要用于毛细管技顶空GC分析，其方法是用液氮或液态二氧化碳使整个柱箱、或者整个色谱柱、或者色谱柱入口端的一段处于低温，这样大体积的顶空气体进入色谱柱时先冷凝下来，然后再升高柱温使之汽化，从而使初始样品谱带宽度变窄，消除了大体积气体很容易使色谱柱超载的问题。通常毛细管顶空GC的进样体积为0.25ml左右，采用冷冻富集技术后，进样体积可高达1-2ml。也就是说，分析灵敏度可提高! 倍或更多。冷冻富集的基本操作与冷柱上进样的冷冻聚焦类似，故此处不再赘述。（五）衍生化反应技术 在有机合成中常用GC监测反应过程，顶空GC也可用于监测产生挥发性产物的反应。从另一个角度看，我们可以通过某些化学反应将极性的、不挥发或难挥发的物质变成挥发性物质，然后用顶空GC分析。在顶空GC中，顶空样品瓶就是一个现成的反应器，只要将反应试剂和必要的催化剂加入到样品瓶中，控制温度和反应时间，就可实现所谓在线反应顶空GC分析。表5-5-4列出了几种常用的衍生化反应，具体反应条件的控制可参看有关有机合成的书籍。表5-5-4 顶空GC中常用的衍生化反应（六）定量分析技术 顶空GC的定性分析与常规GC完全相同，而定量分析则由于基质效应的存在而稍微复杂一些，故在此作一些说明。 原则上讲，GC所用的定量方法，包括归一化法、内标法和外标法均可用于顶空GC，但由于顶空GC主要用来测定固体或液体样品中的挥发性成分，故归一化法极少使用，除非样品为气体，或可全部汽化并用GC分析。而外标法和内标法共同的问题是基质效应。在外标法中，用于测定校正因子的标准样品必须与实际样品具有同样的基质。这可通过采用“空白”制备标样来实现。比如测定机油中的挥发性芳烃时可用新鲜的机油（不含所测芳烃）来配制标样。这样，标样和实际样品的基质基本相同，新鲜的机油和用过的机油在组成上的微小差异是可以忽略的。另一个例子是测定血液中的乙醇浓度。现在世界各国的标准方法均用内标法定量，其基质效应是通过样品稀释而消除的。一般取0.1-0.5ml血液，然后用内标（叔丁醇或正丙醇）水溶液稀释5-10倍，这样，基质效应就可忽略了。另外，内标法定量时所选的内标物的理化性质应该尽可能接近于待测物，从而使其基质效应保持一致。 为了保持标样和实际样品基质的一致性，顶空GC更常用标准加入法定量，即在待测样品中加入已知量的待测物，通过比较标准加入前后峰面积的变化来计算实际样品中待测物的浓度，这样基质就完全一致了。但是要注意，在样品中加入待测物的标准溶液后，样品的体积会发生变化，进而影响相比。因此，要在不加标准溶液的样品中也应加入相同体积的溶剂，以确保样品体积的一致。 多次顶空萃取技术（MHE）也可用于定量分析，但一般较费时，故多用于理论研究。在常规分析中，如果所需定量精度不太高，或者lnAi与（iq）有很好的线性关系（前已述及），也可用两次萃取的结果来计算总峰面积，以简化分析。总之，在顶空GC中。首先应采用标准加入法定量，其次再选择外标法，最后才考虑使用内标法和多次顶空萃取技术。静态顶空色谱的应用（一）血液中乙醇含量的测定 顶空GC定量分析的最早应用就是1964报道的测定血液中的乙醇浓度，经过多次改进后，这一方法已为世界各国所普遍采用，主要用来测试酒后驾车司机血液中的乙醇浓度。实践证明，该法分析速度快，准确度和精密度都符合法庭举证的要求。1.样品制备（1）乙醇标准储备液10g/L水溶液，加一粒碘化汞晶体，冷藏保存。（2）内标溶液=1.0%正丙醇的水溶液作为储备液，用水稀释到0.25%作为内标溶液。（3）标准溶液将乙醇储备液稀释10倍，然后取该溶液（浓度1g/L）1ml置于10ml顶空样品瓶中，同时加1ml内标溶液，迅速密封。此样品用于测定校正因子。（4）血样取1ml充分混匀的血样转移至10ml顶空样品瓶中，同时加1ml内标溶液，迅速密封。为保证测定的可靠性，应同时配制两份血样。2.分析条件 色谱柱：2m*2mm玻璃填充柱，填料为5%PEG-20M/CarbopackB（60-80目）。也可用大口径毛细管柱，如30m*0.53PEG-20M柱；柱温：75（用毛细管柱时柱温适当低一些）；填充柱进样口，150；FID检测器，200；载气：氦气或氮气，30ml/min（用大口径柱时约为15ml/min）。3.顶空条件 平衡温度：50；平衡时间：10min（快速搅拌，若不搅拌则需平衡20min）；阀、输送管及定量管温度：80；加压：13.8kPa（2psi）；加压时间：0.15min；充样时间：0.15min；压力平衡时间：0.15minF；定量管：1.0ml。4.分析结果 如图5-5-7所示。图（a）为混合标样的顶空GC图，说明有关化合物均获得了很好的分离。图（b）为一个酒后驾车司机的血样，用内标法计算其乙醇浓度为0.367%，超过了一般规定的0.1%的最低标准。 应该指出，此类分析要作为执法依据，故必须准确可靠。除了做两份样品平行分析外，还应该用0.1%的乙醇水溶液作为质量保证样品。在分析血样前后均应分析该样品，以保证仪器系统的可靠性。此外，还要保证乙醇与水，以及血液中可能有的其他挥发性物质如甲醇、乙醛、丙酮等完全分离。在方法开发时，还应验证检测器的线性响应范围。总之，要避免分析结果不准确而使酒后驾车者漏网，同时又不冤枉无辜者。（二）聚合物中单体残留量的测定 聚合物材料中的残留单体往往影响材料的理化性能和机械性能，故有关质量标准都严格限制单体的残留量。下面我们以聚苯乙烯（PS）中单体苯乙烯的测定为例说明此类应用。PS为粒料，经液氮冷冻粉碎，用所得粉末进行分析。就定量方法而言，文献报道过几种不同的方法，下面分别加以讨论。 读者可从中理解与顶空GC方法开发有关的问题。1.用多次顶空萃取-内标法分析（1）标准储备溶液的配制 分别取1ml（0.9074）苯乙烯和1ml（0.9660）2-甲氧基乙醇（又叫甲基溶纤剂，MOE，此处用作内标），用二甲基甲酰胺（DMF）溶解并定容至10ml，作为储备液。再配制一个内标标准溶液，即取1ml（0.9660）MOE溶于DMF，并定容为10ml。（2）标准溶液的配制与分析采用22ml的顶空样品瓶，加入2.0l的上述标准溶液（含苯乙烯181.5g，MOE193.2g）。置于顶空进样器上于120下平衡30min，使样品全部汽化。然后进行4次顶空萃取分析，根据所得结果计算出苯乙烯和MOE的总峰面积，进而计算二者的相对校正因子。 表5-5-5列出了4次分析的峰面积数据，以及相关计算结果。所依据的公式是我们在上一节介绍的：表5-5-5 用多次顶空萃取技术测定苯乙烯和MOE的峰面积计算结果注意，这里的A*1是对统计结果所得截距lnA*1取反对数得到的，而不是第一次分析的峰面积A1。这样做是为了消除A1可能的偶然误差。根据内标定量相对校正因子的计算公式可得：（3）样品分析 称取200mg PS粉末置于顶空样品瓶中，加入内标溶液2.5l（241.5gMOE），将样品瓶置于顶空进样器上于120下平衡120min，然后进行9次取空萃取分析，数据列于表5-5-6，图5-5-8为分析色谱图。现在我们可以根据上述数据计算PS中的苯乙烯含量Wi表5-5-5 用多次顶空萃取技术测定苯乙烯和MOE的峰面积计算结果2.用一次顶空分析内标法定量 根据上述多次顶空萃取的分析结果可知，lnAi与（i1）有极好的线性关系，所以，可以用两次顶空萃取，而不是9次，来测定苯乙烯的含量，这样会简化分析。而在常规分析中，上述分析过程只是作为方法开发的第一步。在此基础上，我们就可以用更简单的一次顶空分析方法来测定PS中的苯乙烯含量。 这时我们可以把上面所分析的样品作为工作标样，首先计算出用于一次顶空分析的校正因子fi 以此为标准就可对任何其他PS样品进行分析。注意，此时所用校正因子（0.6073）不同于多次顶空萃取分析（0.3069）。因为用多次顶空萃取技术时不存在基质效应，其校正因子只是对检测器响应值的校正，而一次顶空分析所用校正因子则不仅对检测器的响应值进行校正，还要对基质效应进行校正。 如果对一个新的PS样品，我们用上述同样的样品处理（取200mg）和分析方法，一次顶空分析得到苯乙烯和MOE的峰面积分别为276000和756000，那么，其中苯乙烯的含量就可计算为3.用多次顶空分析外标法定量 如果用外标法定量，我们也可以先采用多次顶空萃取技术来开发方法。这时，可按前面所讲的方法配制标样（含苯乙烯181.5g）和样品，只是不需要再加内标物MOE。如果也用四次顶空萃取分析，那么，苯乙烯的总峰面积就为3897588，故外标校正因子fi为： 实际样品9次顶空萃取所得苯乙烯的总峰面积为1949378，苯乙烯的含量为 可见，外标法与内标法所得结果464g/g相差仅为2%。 应当指出，上述用多次顶空萃取技术和外标法分析中并未考虑样品体积的问题。事实上，因为标样2l是全部汽化的，故其顶空体积与样品瓶容积相等，而实际样品中，因为有200mgPS占据一定的体积，其顶空体积小于样品瓶容积。严格地讲，应对这一体积差进行校正，即总峰面积应乘以一个样品体积校正系数fv 经此校正后，苯乙烯的含量为458g/g，与内标法结果仅差1.3%。 在实际工作中，当样品体积与样品瓶容积相比很小（如前者小于后者的1%）时，可不进行体积校正。 同样的道理，我们可将此样品作为工作标样，用外标法测定任何PS样品中的苯乙烯含量，这时校正因子应为fi=90.8/478194=1.910-4。如果在相同的条件下，用一次顶空分析得到苯乙烯的峰面积为276000，那么，其含量就为：这与用一次顶空分析，内标法道理所得结果相比，也只差2%。4.用PS溶液进行测定 PS可溶解在DMF中，然后以此溶液为样品，采用内标法、外标法或标准加入法均可测定苯乙烯的残留量。具体方法是将200mg苯乙烯溶于2ml DMF中。然后根据所用定量方法处理样品，就可用顶空GC分析。这样做的好处是样品的平衡时间大为缩短。 然而，用溶液方法的最大缺点是降低了分析灵敏度。因为溶剂用量往往是固体体积的10倍以上，且待测组分在溶液中的溶解度一般都大于在固体中的溶解度，从而使蒸气压降低。所以，一般溶液方法的灵敏度要比固体方法低1个数量级。（三）医疗设备中残留环氧乙烷的测定 环氧乙烷（EO）被用于医疗设备的消毒，但它是一种已知的致癌物。所以，有关法规要求用顶空GC方法测定经消毒的医疗设备中EO含量。作为方法开发，我们可以用未接触EO的医疗设备材料作标样的基质，用多次顶空萃取技术内标或外标定量法来测定。现在我们用标准加入法来测定聚氯乙烯（PVC）和高密度聚乙烯（HDPE）制成的医疗设备经消毒后的残留EO。1.单点标准加入法（1）标准储备溶液配制 以高纯度（HPLC级）甲醇为溶剂，对市售EO的甲醇溶液进行稀释，以得到1mg/ml的EO标准溶液。配制过程要快，避免甲醇或EO的挥发。然后将此标准溶液分装于玻璃样品瓶中密封，冷藏保存。注意每个样品瓶要尽可能充满，以最大限度地减小瓶内顶空体积，但不要让溶液接触到瓶盖的密封垫。（2）分析用标样和样品的制备将待测材料PVC和HDPE冷冻粉碎，取粉末样品各两份，每份1g。同一材料的两份样品量应严格一致（为什么？）。将上述样品置于20ml的顶空样品瓶中，其中两份（PVC和HDPE各一份）中各加入1l标准溶液（加入前应使溶液达到室温），另两份中各加入1l纯甲醇（为什么？）。这样，前两份为标样，后两份则为样品。（3）顶空分析条件HP7694自动顶空进样器，平衡温度100，平衡时间60min；阀体（包括样品定量管）温度105。输送管和连接管温度105；样品瓶加压10psi，加压时间0.5min；定量管体积1ml，充样时间0.15min，进样时间2.3min。HP 6890GC，30m0.32mm0.5m PEG-20M毛细管柱，柱温30；分流进样口105，分流比50:1，FID检测200。（4）分析结果图为5-5-9为,EO的顶空GC图，表5-5-7列出了4个样品的峰面积数据。表5-5-6 用多次顶空萃取测定结果2.多点标准加入法 上述单点标准加入法的测定准确度取决于所测浓度范围内检测器的响应线性。换句话说，只有检测器的线性范围涵盖了所测浓度范围时，单点标准加入法的准确度才是有保证的。所以，作为方法开发，必须验证这一线性关系，然后就可以在常规分析中采用该单点标准加入法。多点标准加入法就用于验证这种线性关系。 多点标准加入法需要一系列浓度的样品，我们可按照上述样品制备方法，在PVC中加入不同量的EO，从而获得表5-5-8所列的4个样品，图5-5-10为测得的峰面积对EO加入量的曲线。表5-5-7 4个样品的EO测定结果 根据线性回归结果就可算出原样品中的EO含量。从图上看，当As等于0时，直线与横坐标的交点（绝对值）就等于原样品中EO的含量，此例中为0.75g/g。（四）其他应用举例 上面我们已通过实例介绍了顶空GC的某些应用，下面再举几个简单的应用实例。1.啤酒中有机挥发物的静态顶空GC分析 啤酒的质量指标之一是其气味，而气味主要由挥发性醇类和酯类的含量决定，故啤酒生产企业可用顶空GC来检验其产品质量。通常要分析的是正丙醇、异丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、乙酸乙酯和乙酸异戊酯等，方法如下。（1）样品制备在-4-+4的温度下先配制上述6种化合物的标准溶液，用99.95%纯度的乙醇作溶剂。标样浓度为正丙醇12mg/l、异丁醇10mg/l、2-甲基丁醇20mg/l、3-甲基丁醇45mg/l、乙酸乙酯12mg/l和乙酸异戊酯2mg/l（啤酒风味不同，6种化合物的含量会有变化）。 用正丁醇作内标，用99.95%纯度的乙醇配制浓度为=1.6%的标准溶液。 取10ml的6组分标准溶液转移到20ml顶空样品瓶中，加入25l内标溶液，迅速加盖密封。此样品用于测定定量校正因子。 取10ml啤酒样品置于20ml顶空样品瓶中，加入25l内标溶液，迅速加盖密封。此样品用于测定啤酒中的挥发性醇和酯。为保证分析结果的可靠，往往要制备数份药品，最后计算平均结果。（2）顶空条件 平衡温度50，平衡时间30min；输送管和连接管温度65，阀体（包括定量管）温度76；加压130kPa，加压时间0.13min；定量管充样时间0.15min，定量管平衡时间0.05min。（3）色谱条件30m0.32mm1.2mSE-54毛细管柱，柱温用液态二氧化碳冷却，初始温度12，恒温2min，以7/min升温至150，再以15/min升温至200，保持2min；载气为氮气，37cm/s；不分流进样200（0.5min打开分流阀），FID检测250。（4）结果图5-5-11为典型的啤酒气味分析结果，定量计算结果（略）。2.变压器故障早期诊断 高压输电变压器可能出现电弧、过热或局部放电等问题，而这些问题总是导致绝缘材料及矿物油的分解。结果产生一些可全部或部分溶解在变压器油中的挥发性气体，如氢气、一氧化碳、二氧化碳、甲烷、乙烷、乙烯、乙炔、丙烷等。变压器油与空气接触也会使油中含有氧气、氮气和二氧化碳。这些挥发性气体的存在与变压器的故障有直接关系，故电力部门要定期测定变压器油中这些气体的含量，以便早期诊断故障，采用相应措施，避免更严重事故的发生。美国ASTM的D 3612方法A或B就规定用真空气体萃取方法来测定变压器油中的挥发性气体。我们下面介绍顶空GC分析变压器油的方法，该方法可达到与ASTM方法相同的测定精度，且有更高的灵敏度，更短的分析时间，还简化了样品处理。（1）样品制备首先应制备空白样品，方法是将变压器油置于烧瓶中，然后放在超声波水浴中，将烧瓶与真空系统相连，在超声波作用下，连续抽真空48h。这样就可脱去油中的待测气体组分。可用GC分析来证明空白样品中的气体含量极低（见表5-5-10）。表5-5-10 顶空GC的特殊应用举例将标准气体按一定浓度溶于空白样品中，形成外标储备液。使用时再用空白样品稀释该储备液，使气体浓度处于1-50l/l之间。可以配制一系列浓度的外标溶液，以便绘制工作曲线。 采用20ml的顶空样品瓶，使用前用氩气将瓶中空气吹走。然后取15ml外标样品和15ml待测油样分别置于顶空瓶中，迅速加盖密封，并使用内村聚四氟乙烯的密封垫。最后置于顶空进样器上平衡后进样分析。（2）仪器与条件图5-5-12为分析变压器油的顶空gc装置图，采用两根色谱柱，Carboxen PLOT柱用于分离轻质烃；5A分子筛PLOT柱用于分离永久气体氧气、氢气和氮气。两根柱之间接一个六通阀。通过切换来控制两根柱流出物进入检测器的顺序。同时，采用两个检测器串联，TCD检测永久气体，FID检测烃类。在FID前面连接一个镍催化管，以将二氧化碳转化为甲烷。因为要分析永久气体，故采用氩气为载气。顶空和色谱条件如下：色