ROCK1在地塞米松抑制中性粒细胞释放和单核细胞粘附中的.docx

R0CK1在地塞米松抑制中性粒细胞释放和单核细胞粘附中的作用机制刘冬，陈星云，熊仁平，李平，宁亚蕾，彭艳，赵艳，杨楠，周元国 (400042重庆，第三军医大 学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室)摘要目的探讨ROCK1在地塞米松(Dexamethasone Dex)抑制炎症细胞释放和粘附功能过程中的作用机制。方法1.使用从大 鼠外周血中分离的中性粒细胞来检测不同浓度的地塞米松和100UM法舒地尔(Fas)对PMA (200ng/ml)诱导产生的超氧化物阴 离子(0)和髓过氧化物前(MPO)的抑制程度。2.以PMA刺激后U937单核细胞为炎症细胞模型，分别给予地塞米松、地塞米 松+米非司酮、地塞米松+放线菌酮和法舒地尔予以治疗。观察各治疗组间粘附能力变化情况。并检测各组R0CK1和RhoA的蛋白 含量及其活性的变化情况。结果1.106mol/L、107mol/L的地塞米松可以显著抑制中性粒细胞的释放02和MPO的水平(P0.05)2.地塞米松和法舒地尔均可显著抑制受PMA刺激的U937 单核细胞的粘附能力(P0.05),并抑制ROCK 1活性(P0.05)。RhoA的蛋白表达和活 性在各治疗组间无显著性差异(P0.05).米非司酮和放线菌酮并不能影响地塞米松的以上作用0.05)o结论R0CK1在地塞米 松抑制中性粒细胞释放过程中并不起主要作用，但却是地塞米松抑制U937电核细胞粘附的关键因素。【关键词】地塞米松；非基因组效应：R0CK1中图法分类号文献标志码ARole of R0CK1 in Dexamethasone inhibited neutrophil release and monocyte adhesionLiu Dong, Chen Xingyun, Xiong Renping, Li Ping, Ning Yalei Peng Yan, Zhao Yan. Yang Nan, Zhou Yuanguo(Molecular Biology Center, State Key Laboratory of Trauma, Burn, and Combined Injury, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, ThirdMilitary Medical University, Chongqing 400042, China.)Abstract Objective To explore mechanism of the inhibition effect of dexamethasone (Dex) on inflammatory cells release and adhesion fiinction. Methods I.Uscing neutrophil isolated from rat peripheral blood to detect the extent of inhibition of the different concentrations of Dex and lOOuM Fasudil (Fas) on superoxide anion (0/) and myeloperoxidase (MPO) ,which induced by PMA(200ng/ml). 2.We used PMA-stiniulated U937 monocyte as a inflammatory cells modle induced by Dex、Dex+mifepristone Dex+cycloheximide and fasudil respectively. Detect adhesion ability among these groups, and detect protein expression and kinase activity of ROCK1 and RhoA. Results: The results showed that 1 .Dex of 106mol/L、107mol/L could inhibited the level of O2 and MPO release from neutrophil (P0.05 ) .2.Dex and Fas both can inhibited adhesion ability of U937 monocyte stimulated by PMA (P0.05) and reduceed activity of ROCK! (P but not a fleet on level of ROCK 1 protein expression.The level of protein expression and activity of RhoA had no significant change among these groups.Furthermore, mifepristone and cycloheximide could not reverse the efleet of Dex.Conclusion ROCK1 is not play a role in Dex inhibits neutrophil release, but is the key in Dex inhibited U937 monocyte adhesion ability.Key words dexamethasone; non-genomic effects； ROCK1Supported by the National Natural Science Foundation of China (30470988) and the Project of Innovation Team of Ministry of Education(IRT0712). Corresponding author: Zhou Yuanguo, Tel： 86-23-68757471, E-mail： ygzhou基金项目国家自然科学基金(30470988)；教育部创新团队基金(IRT0712)通信作者周元国,电话：(023) 68757471, E-mail： ygzhou中性粒细胞作为机体中重要的炎性细胞，在机体抵抗外界病原入侵的阶段起到了积极的防御作用。其可通 过氧化爆发和脱颗粒来释放氧自由基(O)和多种细胞内容物如髓过氧化物酶(MP0)等来杀灭病菌。但是 当中性粒细胞被过度激活后，会大量聚集在血管内皮上，释放内容物、炎症介质和细胞因子，级联放大炎症 反应，对机体造成损害，从而引起如急性肺损伤(acute lung injury)s全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、缺血再灌注损伤和哮喘等一系列疾病。临床上常采用大剂量糖皮质 激素冲击疗法来治疗上述急性炎症反应囹，人们把糖皮质激素这种快速效应称为非基因组效应”。但是糖皮质 激素具体是通过何种机制发挥其强大的抑制炎症反应的功能，尚有待研究。本实验拟采用由大鼠外周血分离出的中性粒细胞以及U937单核细胞株来探讨糖皮质激素和法舒地尔 (ROCK的特异性抑制剂)快速抑制炎症细胞释放和粘附功能的作用机制。1材料与方法1.1材料和仪器SD大鼠12只，4-6周，雌雄不限，您只重约200g,购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物 中心。人单核巨噬细胞细胞株U937、人脐静脉内皮细胞HUVEC均为第三军医大学大坪医院野战外科研究所 分子生物学中心液氮保存。PMA、地塞米松、米非司酮(RU-486, M)、放线菌酮(CHX, C)均购于Sigma 公司。法舒地尔(Fasudil, Fas)购于旭化成制药株式会社。Cell Coining Kit-8 (CCK-8)和超氧化物检测试剂 盒购于碧云天生物技术研究所。髓过氧化物能(MP0)测试盒购于南京建成生物工程研究所。24孔板、96孔 板购于Nunclon公司。兔抗人抗RhoA抗体购于北京博奥森公司。兔抗人ROCK1抗体购于武汉博士德公司。 RhoA活性测定试剂盒购于Neweast公司。ROCK1活性检测ELISA试剂盒购于Cyclex公司。Protein A/G磁珠 购于Pierce公司。山羊抗小鼠/兔的二抗购于Sigma公司。1.2 方法1.2.1细胞分离及培养 大鼠外周血中性粒细胞分离实验采用大鼠中性粒细胞分离液(TBD公司)。按其说 明书操作进行，主要原理参照Ficoll-泛影钠(Ficoll-Hypaque)密度梯度及红细胞裂解法。复苏液氮保存的U937 细胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(Gibco公司)培养，HUVEC细胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培养基(Gibe。公司)培养。细胞常规放置F37C、5%CO2的细胞孵育箱中孵育。1.2.2中性粒细胞释放02-测定 调整细胞密度为5X个/ml,将细胞置于24孔板中，每组23个孔。分 组如下:(1)空白对照组;(2)PMA (200ng/ml)； (3) PMA+Dex (106mol/L)； (4) PMA+Dex (107mol/L)；(5) PMA+Dex (108mol/L)； (6) PMA+ Fas (lOOmnol/L)组。分别测定 5、15、30min 释放量。操作步骤 按照试剂盒内说明书进行。1.2.3中性粒细胞释放MPO测定细胞密度及分组情况同上。实验步骤按试剂盒说明书进行。1.2.4 U937与HUVEC细胞粘附水平测定 将HUVEC调整密度为3X 10,个/ml后。每孔100 u 1加入96孔 板中，置于37C. 5%CO2的细胞孵育箱中孵育12h。而后加入密度为5X0个/ml的U937细胞，每孔为100分组情况如下：(1)空白对照组；(2)PMA(200ng/ml)组；(3) PMA+Dex (106mol/L)组；(4) PMA+Dex(1()6mol/L) +RU-486 ( 104mol/L)组；(5) PMA+Dex (106 mol/L) +CHX ( 1()4 mol/L)组；(6) PMA+ Fasudil (I00P mol/L)组也将96孔板置于细胞孵育箱中30min后。弃去培养基，PBS吹洗2次,洗去未粘附 的U937细胞。每孔加入10%的CCK-8溶液后，孵育12h后在450nm波长下使用酶标仪检测OD值，并做 比较。1.2.5 ROCK1活性测定 分组刺激同上，采用Pull down法收集ROCK1蛋白。按本室常规方法提取总蛋白 后用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，每管加入5U1抗-ROCK1抗体，室温摇晃12h。管中加入往25 ul磁珠, 室温混匀，lh。用磁力架收集磁珠后使用Wash bufter轻洗23次。而后使用洗脱液洗去磁珠上的ROCK1蛋 白留作活性测定6。检测ROCK1活性的Elisa法参照Cyclex说明书进行。使用450/540nm测定其吸光度。1.2.6 RhoA活性测定 按照RhoA活性测试试剂盒内说明书步骤进行。实验分组为：(1)空白对照组；(2) PMA (200ng/mI)组；(3) PMA+Dex ( 106 mol/L)组：(4) PMA+Dex (106 mol/L) +RU-486 ( 104 mol/L) 组；(5) PMA+Dex (106 mol/L) +CHX (104 mol/L)组。反应30min后收集细胞,按本室常规方法提取 总蛋白。每管等量加入蛋白提取物后，用IX裂解Buffer将蛋白提取物中液体调至1ml体积。加入川1的 抗- 活化RhoA抗体和2(仙的磁珠悬液，摇晃比，4C。使用IX裂解Buffer洗3遍，离心，弃上清，收集磁珠。 加入20小的2X还原性SDS-PAGE sample butler重悬磁珠。样品煮沸5min后5 000Xg,离心10s。随后按本 室常规方法测定活化RhoA变化情况。1.2.7 ROCK1 mRNA表达水平删定使用Trizol法提取总RNA,经紫外定量分析后使用逆转录试剂盒(TaKaRa公司)进行逆转录。再使用实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)进行定量。引物序列：ROCK1 上游：5-ATGAGTTTATTCCTACACTCTACCACTTTC-3,；下游：5,-TAACATGGCATCTTCGACACTCTAG-3,GAPDH 上游：5，-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3； 下游：5，-TAGCCAAATTCGTTGTCATACC-3。PCR 反应条件为：95r 4min, 95C 30s, 59C 15s, 72C 15s, 40 次循环。1.2.8 ROCK1及RhoA蛋白表达测定 提取细胞总蛋白后定量。取30 P g总蛋白与2X Loading buffer煮沸 后以7.5% SDS PAGE凝胶电泳分离。湿转蛋白至PVDF膜，室温封闭5h后，加入抗ROCK 1 一抗(1 ： 500)和 抗RhoA一抗(1 : 300),室温孵育2h。然后分别加入山羊抗小鼠/兔的二抗(1 : 5000)。ECL化学发光法显 示结果并压片曝光。Labworks 4.6图像分析软件分析条带灰度值，使用B -actin作为内参。实验结果重复3次地 1.3统计学处理上述实验结果以均数土标准差(x S)表示，分别使用sigmaplot 11.0和SPSS 17.0分别进行画图及统计学 分析。多组比较采用单因素方差分析。2结果2. 1 PMA、地塞米松和法舒地尔对中性粒细胞释放O-的影响当使用PMA (200ng/ml)作为中性粒细胞的刺激剂时，中性粒细胞中释放出的超氧化物阴离子的水平在5、 15、30min时较对照组有明显升高(P0.05)o提示低浓度的Dex和Fas并不能有效 抑制中性粒细胞释放O2 o而且由于Fas是ROCK的特异性抑制齐U，从而进一步说明ROCK在中性粒细胞释放 02-的过程中并不起主要作用。3个时间段的结果相比较显示并无明显差异。说明Dex的短期内抑制中性粒细胞 02的释放呈剂量依赖性，而非时间依赖性。表1 PMA、地塞米松和法舒地尔对中性粒细胞释放0的影响(n=4, X 土 S)组别Smin15min30min对照组0.1050.020.0970.010.0950.01PMA组0.1750.02a0.1730.01a0.l760.02aPM A+Dex -6moLL 组0.1140.006c0.120.0l8lO.II5O.OI5CPMA+Dex-7mol/L 组0.ll6i0.01lh0.120.0l6bO.II9O.OI9hPMA+Dex-8mol/L 组0.15410.017O.I49O.OI34O.153O.OI6PMA+Fas 组0.1690.010.170.010.1740.01a： P.O5,与空白对照比较：b： P 0.05. c：P.O5,与PMA剧激组比较2. 2 PMA、地塞米松和法舒地尔对中性粒细胞释放MPO的影响MPO释放情况与02-相似。中性粒细胞中释放出的MPO在5、15、30min时与对照组相比有明显升高(P0.05)o提示刺激较明显o 10-6 mol/L、107 mol/L的Dex对PMA刺激的MPO释放明显的卜-降(P().()5)。同样提示ROCK在中性粒细胞释放MPO中并不起主要作用。且Dex抑制中性 粒细胞MPO的释放同样呈剂量依赖性，而非时间依赖性。表2 PMA、地塞米松和法舒地尔对中性粒细胞释放MPO的影响(n=4, ；s)组别5min15min30min对照组13.30.812.90.3I3.5O.7PMA组20.42.8a22.311.9*23l.72PMA+Dex-6moLL 组142.2b13.90.9b14.90.4bPMA+Dcx-7mokL 组15.41.04c14.91.9cI5.6I.5CPMA+Dcx-8mokL 组17.52.0319.80.619.51.8PMA+Fas 组20.7l.32I.6W.622.40.7a： P 0.05,与空白对照比校：b： P 0.05, c：P 0.05)提示地塞米松的作 用并不是通过传统的基因组效应。2. 4地塞米松和法舒地尔对ROCK1活性的影响OD值将对照组设为1,其余组均与对照组相对比。研究结果显示，当加入PMA刺激后，ROCK 1的活性 (1.7880.()45)较对照组(I0.083)有明显增加(P0.01)。提示ROCK1受PMA刺激后的活性有明显提升。当加入 Dex 和 Fasudil (Fas)等抑制剂后，PMA+Dex 组(1.1640.061 )、PMA+Dex+M 组(1.2020.103)、 PMA+Dex+C 组(1.220.0137)和 PMA+Fas 组(1.1030.04)的比值较 PMA 刺激组均有所降低 3 0.05)。提示地塞米松的作用并不是通过传统的基因组效应。2. 5 地塞米松对RhoA活性的影响结果显示，将对照组活化的RhoA光密度平均值设为1,其余各组均与之相比。活化的RhoA光密度平均 值分别为：对照组(1O.O75)、PMA 组(1.7550.164)、PMA+Dex 组(1.6640.156)、PMA+Dex+M 组(1.7270.278) 和PMA+Dcx+C组(1.7390.224)。且阳性对照组(3.7880.536)和阴性对照组(0.7870.14)相比有明显差异 (Pv().()5),证明实验操作的质量控制良好。PMA组与对照组相比RhoA的活性有明显升高(P0.05)。提示加入 Dex、Dex+M和Dex+C后，对PMA刺激后的RhoA的并无显著性影响。1234567活化的RhoA一17KDa1.阴性对照2.阳性对照3.对照组4.PMA 5.PMA+Dex6. PMA+Dex+M 7.PMA+Dex+C图1各组细胞中RhoA活化程度的变化2.6 地塞米松对R0CK1 mRNA表达无明显影响经实时定量PCR后，采用GAPDH作为内参进行比对。将对照组的结果设为1。其余各组均与之比较。 结果如下：对照组(l0.059)、PMA 组(1.160.127)、PMA+Dex 组(1.060.093)、PMA+Dex+M 组(1.H0.151) 和PMA+Dex+C组(1.230.108)。将各组间ROCK 1的mRNA进行两两比较，发现无显著性差异(P0.()5) 由此推测在该时间段，ROCK1的mRNA表达变化并不明显。说明PMA和Dex并不通过影响ROCK1 niRNA表达 而影响其功能。2.7 R0CK1及RhoA蛋白在各组间无明显变化在分别加入不同刺激剂后，以B-actin为内参，计算出各自相对光密度以表达其蛋白量。各组中R0CK1 蛋白的相对表达量为：对照组(0.7680.03)、PMA 组(0.7960.064)、PMA+Dex 组(0.756土0.02 )、 PMA+Dex+M 组(0.7740.36)和 PMA+Dex+C 组(0.7870.01 )。RhoA 蛋白的相对表达量为：对照组 (1.180.117)、PMA 组(1.260.562)、PMA+Dex 组(1.350.179)、PMA+Dcx+M 组(1.2630.134)和 PMA+Dex+C 组(1.2740.1)。结果比较后可知，各组间ROCKI和RhoA的蛋白表达没有明显变化。PMA组与对照组相比无明显的 刺激作用(户0.05)。而且加入Dex、PMA+Dex+M和PMA+Dex+C后，ROCK1和RhoA的蛋白含量依然 没有明显变化(P0.05)。提示Dex和PMA在短时间内并不影响ROCK1和RhoA的蛋白合成情况。112345R0CK1P-actinP-actinRhoA1.对照组 2.PMA 3.PMA+Dex4.PMA+Dex+M 5.PMA+Dex+C图2各组细胞中R0CK1及RhoA蛋白表达情况3讨论多种炎症反应对机体的损伤机制是由于中性粒细胞释放颗粒内容物对血管内皮细胞造成损伤，并且释 放大量细胞因子诱导更多的白细胞粘附在血管内皮和上皮细胞。因此，抑制中性粒细胞释放和降低白细胞 对内皮细胞的粘附成为治疗急性炎症的首要环节。糖皮质激素在抗炎、免疫抑制等方面发挥重要的作用四。 在人们熟知的糖皮质激素基因组效应外，还存在着另外作用途径：非基因组效应，又称快速效应。其不影 响基因转录和蛋白质合成过程而发挥作用，起效时间短、见效快。临床上为r抑制急性炎症反应而通常 使用大剂量糖皮质激素冲击疗法，效果较为显著】。但其作用机制尚待进步研究。我们前期研究发现精 皮质激素在快速抑制炎症阶段并不是通过经典的基因组效应，而是通过非基因组效应发挥作用。本研究进 一步探讨R0CK1在糖皮质激素在非基因组效应中所起的作用，以及如何充分发挥糖皮质激素治疗时的积 极作用。木实验发现，受PMA刺激后中性粒细胞的释放。2-和MPO的功能可在短时间内被地塞米松有效抑制， 目.该作用并不因为加入糖皮质激素受体经典拮抗剂米非司酮（RLM86）或加入蛋白合成抑制剂放线萌酮 （CHX）而发生改变。提示地塞米松可能是通过非基因组效应发挥作用。而ROCK的特异性抑制剂法舒 地尔在短时段内并不能抑制中性粒细胞的释放，提示ROCK在此快速效应中并不发挥主要作用。法舒地尔作为ROCK的特异性抑制剂，在缓解蛛网膜下腔出血后血管痉挛、缺血性脑损害【和治疗 心血管疾病叫中发挥重要作用。有学者证明ROCK的两种亚型中，ROCK1对于炎性细胞的粘附、侵润 起重要调节作用，ROCK2则无此作用以。由此推断出在炎症细胞粘附过程中其主要作用的是ROCK1,而 不是ROCK2。在以U937单核细胞为模型的黏附实验中，我们发现使用地塞米松和法舒地尔均可有效抑制 其黏附HUVEC的能力。提示地塞米松可能是通过抑制ROCK1而发挥其抑制炎症细胞粘附的作用。随后 的实验进一步表明地塞米松可以有效抑制ROCK1活性，而不影响其mRNA和蛋白的表达四，该结果与 Rubenstein的实验结果相吻合。并且地塞米松的作用并不被米非司酮和放线菌酮所逆转。由此我们推测： 地塞米松可能通过非基因组途径来发挥作用。RhoA作为ROCK1的经典上游效应分子，在ROCK1活性调节中起到了重要作用。糖皮质激素是 否通过调节RhoA来影响ROCK1的活性变化，尚不得而知。本研究提示在此短时效应中，地塞米松并不 能对RhoA的活性及蛋白表达产生影响。提示地塞米松可能通过另外的途径抑制ROCK1的活性。若在应用糖皮质激素抑制炎症细胞过度粘附的过程中，突出其对ROCK1的抑制作用，并尽量避免其基 因组、非基因组效所应带来的一系列副作用的发生，将会是提高糖皮质激素治疗的特异性的一条新的思路。综上所述，在快速抑制炎症反应阶段，地塞米松发挥其非基因组效应来中性粒细胞的释放，旦通过非 基因组效应下调ROCK1活性进而抑制U937单核细胞的粘附功能。法舒地尔也可以抑制U937细胞的粘附， 但对中性粒细胞释放功能并没明显调节作用。本实验结果进步解释了糖皮质激素发挥作用的机制以及 ROCK1在其中所起的作用。参考文献：1. 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