ICH遗传毒性研究指导原则修订的最新进展

ICH遗传毒性研究指导原则修订的最新进展中国药事2009年第23卷第5期491?国外药事?ICH遗传毒性研究指导原则修订的最新进展王雪,宋捷,张曼,胡燕平,王欣,李波,王军志(中国药品生物制品检定所国家药物安全评价监测中心,北京100176)摘要:目的介绍ICH关于遗传毒性研究的指导原则修订的最新进展.方法介绍ICH遗传毒性研究指导原则修订的背景,修订的经过及要点.结果修订的指导原则在标准试验组合,体内试验和体外试验的选择,结果分析及评价等方面做了若干修订,提出了新的要求.结论修订后的指导原则ICHS2更具科学性和可操作性.关键词:ICH指导原则;遗传毒性;标准试验组合;体外哺乳动物细胞试验;3R中图分类号:R951.01文献标识码:A文章编号:10027777(2009)0549104ICHGuidelineonGenotoxicity:LatestProgressinRevisionWangXue,SongJie,ZhangMin,HuYanping,WangXin,LiBoandWangJunzhi(NationalCenterforSafetyEvaluationofDrugs,NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100176)ABSTRACT:ObjectiveTointroducethe1atestprogressofICHS2revisions.MethodsThebackground,processandimportantpointsoftherevisionwereintroducedinthisarticle.ResultsThestandardbatteryofgenotoxicitytest,choiceofinvitroandinvivoassays,interpretationandevaluationofresultsinICHS2hadbeenrevised.ConclusionsICHS2revisionismorescientificandpracticable.KEYWORDS:ICHguideline;genotoxicity;standardbatteryforgenotoxicitytesting;invitromammaliancellsassay;3RICH(人用药物注册技术要求国际协调会议)关于遗传毒性试验现行的两个指导原则(S2A和S2B)分别制定于1995年和1997年.2006年6月,ICH指导委员会(SteeringCommittee,SC)同意对其进行修订,自此,ICH关于遗传毒性试验的修订开始.ICH专家工作组(ExpertWorkingGroup,EwG)在经过一系列工作会议后,于2008年2月完成指导原则修订案的征求意见稿.按计划于2009年6月在日本横滨召开会议,届时,新的指导原则一S2(R1):GuidanceonGenotoxicityTestingandDataInterpretationforPharmaceuticalsIntendedforHumanUse(人用药物遗传毒性试验和结果分析的指导原则)将正式发布并付诸实施.新的指导原则在遗传毒性试验标准组合,体内试验和体外试验的选择,结果分析及评价等方面做了若干修订,提出了新的要求,这将对药物安全性评价遗传毒性试验和研究产生重大影响.及时了解国际上对药物安全性评价的技术要求,对于国内该领域的研究具有重要意义.指导原则的详细内容可参考ICH发布的原案,本文就修订的背景,经过以及要点做一简介,供国内同行参考.1指导原则修订背景和修订进程的各阶段成果现行的遗传毒性试验指导原则发布实施近l0年时间,其中存在的一些问题随着时间的推移逐渐显现出来,对部分内容进行修订提上了日程,同时,遗传毒性试验技术方法的进步和数据积累也为修订提供了支持;另一方面,随着社会进步,动物作者简介:王雪,理学博士,研究方向:遗传毒理学;主要从事药物安全性评价毒理学试验和研究工作;Tel:(010)678722338209;E-mail:xuewangnicpbp.org.ca492中国药事2009年第23卷第5期爱护的理念逐渐被大众接受,欧盟更将禁止使用动物进行化妆品的安全性评价的规定法律化,这对食品和药品领域的相关法规制定也产生了影响.此两点为指导原则修订的大的背景.ICH此次对遗传毒性试验指导原则的修订目的:1)解决标准试验组合中体外哺乳动物细胞试验系统存在与人用风险不相关的阳性率过高问题;2)在实验的科学价值和人的风险评价不发生冲突的前提下,尽可能将动物实验的3R原则(减少,替代,优化)引入到遗传毒性试验中.自2006年起,在ICH召开的历次SC/EWG工作会议上,遗传毒性试验指导原则修订被列入了讨论议题,相关的几次会议经过及成果如下:(1)2006年6月,横滨:ICH指导委员会同意对遗传毒性试验指导原则进行修订,并决定设置非正式工作组(InformalWorkingGroup),自此开始对修订计划和方案进行讨论;(2)2006年1O月,芝加哥:EWG首次召开工作会议,针对遗传毒牲试验标准组合中的”体外试验问题”以及”以确认遗传毒性为目的的重复给药试验的评价终点”等内容进行了讨论;(3)2007年5月,布鲁塞尔:EWG就修订问题达成共识,一致同意起草指导原则修订案s2(R1).对指导原则S2(R1)中”新的标准组合”以及”在科学性前提下适当减少使用实验动物的遗传毒性试验”议题进行了讨论,目标定于当年秋季到达进程第二阶段;(4)2007年l1月,横滨:对指导原则S2(R1)中”新的标准组合”以及”在科学性前提下适当减少使用实验动物的遗传毒性试验”议题进行了讨论,目标定于年终到达进程第二阶段(实际于2008年2月完成了修订案的最后签字,结束了进程第二阶段);(5)2008年6月,波特兰:对S2(RI)征集的意见EWG召开会议进行审议,进一步讨论进程第四阶段的工作;(6)2008年11月,布鲁塞尔:由于”彗星试验合作研究”的数据没有完成,EWG未召开会议;(7)2009年6月,横滨(预定):预计结束进程第四阶段.由上可见,议题的讨论似没有完全按照日程完成,修订进程的进展比EWG计划有所延长(原计划在2008年末结束进程第四阶段).这是因为部分修订内容需要做进一步的调查或者通过合作研究获取数据后方可写入指导原则中,合作研究的最终数据提交拖延了修订进程.2体外哺乳动物细胞试验系统的阳性率过高问题体#bN-L动物细胞试验系统的阳性率过高问题早已引起了广泛关注,而这些阳性结果与人用风险并不相关.阳性结果一般是在与体内环境相差甚远,且非生理环境(比如受试物的细胞毒性,不溶性等)下获得的,而非真正的遗传毒性.这些阳性结果导致必须实施大量的后续试验(如体内试验)来进一步评价其遗传毒性.因此,亟需采取必要措施以解决体外试验的高阳性率问题,避免在后续试验和实验动物使用上产生更多的浪费.为此,EWG曾提出若干种补救措施意见(2007,芝加哥会议):(1)保留体外哺乳动物细胞试验方法,但要改进对证据份量(weightofevideneeW0E)的评价及后续试验的建议;(2)降低受试物处理的最高浓度以减少不相关阳性结果;(3)降低抑制细胞生长(细胞毒性)的最高浓度以减少不相关阳性结果;(4)从标准组合中取消体#VNL动物细胞试验,无需替代;(5)从标准组合中取消体外哺乳动物细胞试验,但需要追加两个体内试验.其后,EWG工作会议对包括降低最高浓度的可能性,遗传毒性试验结合到重复给药毒性试验中,大鼠外周血微核试验的利用,体外微核试验作为哺乳动物细胞试验的第三种选择,提议新的试验组合等议题均作了充分的讨论.在形成修订案之前,EWG于芝加哥会议后通过ICH三方的制药协会共同实施了一项调查,即将现行的最高浓度lOmM降低至100M,考察能否既可检测”相关(relevant)”阳性(如体内试验为阳性的物质),又能减少”非相关(notrelevant)”阳性结果.该项调查的最大成果是,EWG一致同意将最高浓度10mM(或5mg?mL-)降低至lmM(或0.5mg?mL-),同时,对于受试物产生沉淀和出现细胞毒性时的策略也达成了一致意见.3遗传毒性试验与一般毒性动物试验的结合目前的体内遗传毒性试验均单独使用实验动物,如果将体内遗传毒性试验结合到一般毒性试验中,分别进行各自的终点检测,将能够大大减少动物的使用数量,推动动物实验3R原则在业界的普及.为体现这一精神,EWG充分讨论了将遗传毒性评价终点结合到重复给药毒性试验的可能性.首先,减少实验动物数量可以直接带来受试物使用量中国药事2009年第23卷第5期493的减少;其次,一般毒性试验的数据特别是毒代动力学数据可以用于遗传毒性试验的结果分析,这些无疑是有利的一面.然而,也有不确定的一面,例如,重复给药毒性试验的最高浓度通常低于急性毒性试验,试验系统的敏感性是否会降低?另外,没有数据表明重复给药对遗传毒性检测的效果如何,如微核试验即便进行长时间处理也只反映最近的暴露水平.为此,EWG通过ICH三方的制药协会又做了一项调查,对体内微核试验或急性毒性试验(1次或2次给药至最大耐受剂量)和重复给药试验(2/4/12周给药分别至给药结束时检测)的最大血药浓度值(C瑚x)进行了对比研究,结果表明,在多数情况下高浓度(重复给药累计暴露水平类似于急毒的水平)是可以用于遗传毒性研究的.因此,EWG一致认为,结合一般毒性研究检测遗传毒性终点(如微核试验)是可以接受的,关键是必须确定一般毒性试验的最高剂量标准.确定标准时应考虑到以下几个因素,需符合其中任意一项(以大鼠为例):(1)现实可行的最大给药剂量;(2)14d或更长时间的试验,剂量限度为1000mg?kg:(3)稳定和充分的暴露,有蓄积;(4)达到或接近最大耐受量;(5)与短期试验的高剂量接近的暴露水平(应大于该剂量的50).4遗传毒性试验标准组合的两种选择此次修订的重要内容之一是增加了一种标准试验组合供选择,这种改变无疑考虑了体外试验阳性率过高的问题.选择一仍如从前,选择二则提供了不进行体外哺乳动物细胞试验仍可以实现遗传毒性评价的可能,在策略上两种选择均体现了3R的理念.选择二中,当剂量或暴露不合适时,为了优化剂量设定推荐实施的一项单次给药体内试验,指导原则亦建议”如可能时将两个遗传毒性试验合并在一项试验中”,即在一个动物试验中实现两个遗传终点的检测,事实上这种策略也能够达到减少动物使用量的目的,仍为3R原则的一种体现.此外,体内试验不再设平行阳性对照组也在修订案中被提及.选择一:(1)细菌基因突变试验(Ames试验);(2)体外哺乳动物细胞试验(染色体畸变试验或小鼠淋巴瘤tk基因突变试验);(3)体内微核试验(如可能时结合到重复给药毒性试验中).选择二:(1)细菌基因突变试验(Ames试验);(2)两种不同组织的遗传毒性体内试验(如可能时结合到重复给药毒性试验中).图l为按照新的标准试验组合进行遗传毒性试验的流程.1)Ames试验:结果为阴性方可进入选择一或选择二.2)选择一:首先实施体外哺乳动物细胞试验,可以选择染色体畸变试验,小鼠淋巴瘤tk基因突变试验或体外微核试验.a如果结果为阴性,则只选做体内微核试验即可;b如果结果为阳性,则除了选做微核试验外,尚需实施一个后续的体内试验.3)选择二:可以跳过体外试验直接进入体内试验,但必须实施两项体内试验.此时,应假设受试物为体外遗传毒性阳性,而体内试验应具有检测出”相关”阳性的能力.赫/牝_1磊/IIlIJ体内微核试验IJ体内徽核试验JJ体内触棱试验J(无需实施第二个l外加一项体冉试验lI外加一项体内试验l体内试验)l(第2个终点/组织)1(第2个照点/组织)l圈请侍塞Jf幸试骑流棵示童图通常,对于试验结果为阴性的化合物,若证据充分则不再进行其他的试验.若出现阳性结果,则根据其临床用途,可能需进行更多的试验.一些体内试验可用在选择二中体内试验的第2项试验,基于暴露和代谢能力的考虑,肝脏应是首选的组织,但是体内组织和试验方法的选择应考虑更多因素,诸如可能的机理,代谢,相关组织的暴露等信息.可供选择的体内试验有彗星试验,碱性洗脱试验,转基因动物基因突变试验,UDS试验等,EWG首推在重复给药试验中实施肝脏组织的彗星试验.目前,日,美,欧三国的制药协会已组织实施了两项合作研究,即”彗星试验结合28天重复给药试验”和”肝脏彗星试验和骨髓微核试验整合到一个单项研究中”,预计获得的数据将支持该方法被写入指导原则中.494中国药事2009年第23卷第5期增加选择二,必须对ICHM3(关于非临床研究的实施时期的指导原则)的相关部分做出修订.对于原来的规定一进入临床I期之前完成Ames和染色体畸变试验(或小鼠淋巴瘤tk基因突变试验),进入临床II期之前完成全部遗传毒性试验一而言,增加选择二意味着完成了Ames便可以直接进入临床试验,这种试验策略未免风险过高.因此,ICH在M3(R2)遗传毒性研究部分对此作了修改,即在支持多剂量临床试验的两种试验组合中“若采用选择二,应在多剂量试验的人体首次应用前完成试验;若采用选择一,其中的体外试验应在首次多剂量人体试验前完成,选择一的体内试验则应在期试验前完成”.5结语ICHS2修订案对减少实验动物的使用具有潜在的积极影响,但是体内动物试验是遗传毒性评价的重要组成部分这一事实并未因此而改变.这体现在,体内动物试验既是体外试验的必要搭配,同时,作为体外试验阳性结果的后续试验,其存在的意义更大.如前所述,EWG在波特兰会议及其后,将根据征集的意见提出补充草案以进一步完善s2(R1),同时彗星试验结合骨髓试验的合作研究也将完成,预计完善后的S2(R1)将更具科学性和可操作性,国内的相关领域同行需要关注今年6月ICH横滨会议的结果.致谢:本文的部分资料由日本国立医药品食品卫生研究所本间正充博士提供,特此致谢.参考文献:1ICHS2A.SpecificAspectsofRegulatoryGenotoxicityTestsforPharmaceuticalsEB/OLI.1995. 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:/nw.ieh.org/LOB/media/MEDIA4474.pdf.4ICH指导委员会.药品注册的国际技术要求M.周海钧主译.北京:人民卫生出版社,2007.(上接第480页)2苏菡.甘草酸二铵注射液联合多烯磷脂酰胆碱治疗脂肪肝临床观察l,J1.中外健康文摘(医药月刊),2007,4(8):128130.3高薇薇,陈运彬,谭三智.甘草酸二铵治疗新生儿肝炎综合征的疗效l-J.广东医学,2006,27(4):581582.4于滨.甘草酸二铵肠溶胶囊的保肝降酶作用口.实用药物与临床,2006,9(3):166167.5黄灿,余斌.大黄联合甘草酸二铵治疗慢性肝炎的疗效观察l-j.中国全科医学,2006,9(2O):17281729.6刘思纯,马博.甘草酸二铵治疗急性药物性肝损伤的疗效观察lJ1.中国处方药,2006,10(55):6264.73黄萍,刘丽.甘草酸二铵和丹参联合治疗酒精性肝病J.中南药学,2005,3(2):121123.8余细球,程芳洲,何小飞.甘草酸二铵三七总苷等联合治疗活动性肝硬化J1.医药导报,2002,21(4):210212.91党双锁,张正国,袁利超,等.前列腺素E1脂微球注射液联合甘草酸二铵治疗重型肝炎疗效观察J.中国药房,2006,17(15):11631164.101观晓辉.甘草酸二铵联合丹参治疗高原地区慢性乙型肝炎的疗效观察l,J1.现代中西医结合杂志,2005,14(12):15411542.111杨云华.甘草酸二铵治疗肝功异常后出现反跳的对策探讨J.四川医学,2004,25(5):562563.1,121观晓辉,温帆渊.凯时联合甘草酸二铵治疗慢性乙型肝炎肝内淤胆的疗效观察J.现代医药卫生,2004,20(13):12021204.许伟华,刘斌,林森,等.甘草酸二铵治疗肝纤维化的动态观察口.中国新药与临床杂志,2003,22(6):352354.庞晓文,赵广,史飞,等.甘草酸二铵联合清开灵注射液治疗寻常型银屑病疗效观察J.临床皮肤科杂志,2004,33(3):186188.雷小兵,高冬,张江安,等.咪唑斯汀联合甘草酸二铵治疗慢性尊麻疹疗效观察J.临床皮肤科杂志,2004,33(11):705706.吴蕊,蒋献,汪盛.a一甘草酸二铵治愈红皮病1例J1.临床皮肤科杂志,2003,32(3):167168.傅浩.甘草酸二铵联合阿昔洛韦治疗中老年带状疱疹疗效观察rJ.临床和实验医学杂志,2008,7(1):116118.陈小枫,叶纪录,叶军.甘草酸二铵对多器官功能障碍综合征治疗作用的临床研究l-J:中国急救医学,2005,25(7):495496.朱少铭,罗强,金朝霞,等.甘草酸二铵防治心脏手术患者肾损伤72例J.医药导报,2004,23(9):626627.李福兴,刘卫华,杜美兰,等.甘利欣在布鲁氏菌病患者难治性发热中的应用J.中国地方病学杂志,2003,22(4):360362.谢武艳,张文盛.甘草酸二铵联合短化治疗伴发乙型肝炎初治涂阳肺结核49例J.临床荟萃,2002,17(6):341343.于新芳,孙启云.中西医结合治疗肾综合征出血热疗效观察J.中国煤炭工业医学杂志,2005,8(3):314316.口口口口I二J口