COX及AKT在鼻咽癌中的表达及意义

广东医学院硕士学位论文COX-2及AKT2在鼻咽癌中的表达及意义姓名：蔡章达申请学位级别：硕士专业：指导教师：戴德202105COX2及AKT2在鼻咽癌中的表达及意义中文摘要【目的】本研究旨在了解环氧化酶2(COx2)及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶22)在鼻咽癌和正常鼻咽粘膜组织中的表达水平，探讨C0x2、U汀2与鼻咽癌的关系及两者间的相关性，从细胞 信号传导途径方向分析鼻咽癌的发病机制及临床意义。【方法】用免疫组化sP法和RTPCR技术检测cOX2、AKT2基因蛋白及相应mRNA在鼻咽癌和正 常鼻咽粘膜组织中的表达情况。采用SPSSl30统计学软件，根据资料特点分别使用卡方检验、 方差分析、f睑验、等级资料用秩和检验及印鲫删口，l相关性检验进行统计学分析，PQ05有统计学意义。【结果】COX2蛋白阳性表达主要定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色不同强度的染色。52例鼻咽 癌组织中COX-2蛋白的平均光密度为O2863士00145，2l例正常鼻咽粘膜组织中COX2蛋白的 平均光密度为O0851圭O0079，两组间差异有统计学意义CP001)；COX2 m砌蛆在鼻咽癌中的平均光密度为0735士0230，在正常鼻咽粘膜组织中的平均光密度为O2745士O0265，两者之 间差异有统计学意义(P001)。J蛆汀2蛋白阳性表达主要定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色不同强度的染色。52例鼻咽癌组织中删蛋白的平均光密度为O3567士O0379，21例正常鼻咽粘膜组织中AKT2蛋白的平均光密度为01241士O03 12，两组间差异有统计学意义(P001)：AK，r2 mRNA在鼻咽癌中的平均光密度为O931士0398，在正常鼻咽粘膜组织中的平均光密度为035肚0135，两者之间差异有统计学意义(P001)。COX-2、越汀2的蛋白及1115嫩A表达与鼻咽癌分化程度，淋巴结转移范围，TNM分期有关 (IP005)。COX2、AKT2蛋白及mI斟A在鼻咽癌组织中表达有相 关性伊叼01)。【结论】1Cox2与川5汀2在鼻咽癌组织中的表达明显高于正常鼻咽粘膜组织中的表达，提示COX2、AKT2与鼻咽癌的发生，开展有关。 2COX2与AKT2的表达与鼻咽癌分化程度，淋巴结转移范围，TNM分期有关。CoX2与删在鼻咽癌患者不同性别及组织学类型(低分化鳞状细胞癌与未分化癌)的表达差异无统计学意义。提示COX2与AKT2可能可以作为判断鼻咽癌的生物学指标之一，以及作为治疗 鼻咽癌的靶点。3COX2与AKT2在鼻咽癌组织中表达有相关性，提示COX2与AKT2在鼻咽癌的发病机 制中存在着协同调节作用。【关键词】鼻咽癌；COX-2；AKT2；免疫组织化学；RT-PCR2Thel ne ExpressionEXpIeSSlOn aIldand significallceSlgnltlCanCe ofOt COX2UU灭一Z aIldanlCl AKT2AK l：z in1nNasopharyngeal carcinomaAbstract【Objective】The propose of仕lc research is f0c潞on nle expression levels of CoX2 and AKT2 in me tissues of n髂ophar)ngeal carcinoma and no彻al naSophar)，Ilgeal m锄bmeThe relatior塔betweenCoX-2 and剐【T2讹ch may rclate to tllc pamog饥esis锄d climcal si鲥ficance of naSopharyIlgealcarcinoma haVe beeIl obseed in me field of cell cycle【Methods】hIlllluIlollistoChemis缸畎SP)and ImPCR have beeIl used t0 ex锄ine nle expression levels ofCOX-2，姗protein and IYlI斟A in the tisSu鼹of nausopharyllgeal carcinoma锄d no姗alnaSopharyngeal melllbr觚eAccording t0吐le featllre of dataclli-square test，ANOVA a11alySis，ttcst，rallk-sum test and spe锄n觚have be饥1lsed t0 mal【e nle statistical aIlalySis舶m me statisticalf时are called Spss1 6The st；atistical si鲥ficaIlCe h嬲bem confinned while PO05【Result】Most of nle COX-2 protein positive expression haS beell f0珊d in cell koplasm，锄d its color is brown yellow 0r d破brownOptical densi吼OD)of她COX2 in吐sSues of naSophaDrllgeal carcinoma缸Im 52 patients is O2863士00145，and廿1at ofme 2l nomal nasoph邺，Ilgeal m锄bralles is O0851士00079OD of COX-2 mRNA in me tisSu懿ofn舔opha巧ngeal c躺inoma is 0735士0230， 锄d tllat of t11e nomal n嬲opharyngeal m印曲r卸ne is O2745士O0265The difj衙饥ce bet、)I，e髓 IlasopharyIlgeal carcilloma黟oup觚d nomal group h路been fourld sigIlifican廿y(fO01)栅p-0teiIl positivc expression also h嬲be吼f0硼【d in cell kopl嬲m锄d me color isbrown yellow or dark brow，11OD ofleU汀2 in tisSues of nasoph矽皿gead carci蚴a缸吼52patients is O3567士00379，and mat oftl圮21 nonnal Ilasopharyngeal m即小r觚豁is 01241士o0312 OD of AKT2 mRNA iIl tlle tis跚es of n嬲opha驴geal cardnoma is 093 l士0398，锄d tllat of廿地 n0衄al I娜opbaryngeal m曲如珊is O350士O135The dif|衙胁bet、)Irn n嬲ophar)，llgeal3carCinoma group觚d no肌al group h嬲been f011Ild sig伍ficantly(P001)111e IIl】必A锄d protein positive eXpression of COX-2 and6姻2 in怆tissu鹪of nasopharyngeal c砌noma are related t0 nle di伍。reIltial de孕，nle r觚ge of lyInph node met；减嬲鹤and dinical st晤ng of n嬲opharyIlgeal c盯cinoma(P005)TIlere were c0盯elatioIls bet、)IrecIl COX-2锄d AKT2 mRNA觚d tlleir protein positive eXpr鼯sion iIl the tisss ofn弱0pharyngeal carcilloma(P001)【Conclusion】11k cXpression levels of COX-2 aIld Al汀2 iIl tl玲tissues of n淞opharyIlgeal carCino嫩isobViously hi911er m姐mat of nle nomal n勰opha驴geal m锄br锄e、)l，：hich me锄s oC)：X一2 a11dAKT2 may rclate t0 tlle舀=Ilesis aIld deVelopment of n勰ophaf)，llgeal carcirloma2The e)【pression levels of COX2锄dU汀2 are related t0 tlle di脑tial deg眦，tlle跚ge oflymph node met豁t嬲es and cliIliCal sta西ng of n嬲oph娜，Ilgeal carCiIlom如But t11e relation betw嘲the戗pression dif!f；溯lce of COX-2 and AKT2 in patielltsgender盯histolo百c type w勰not found COX一2趾d AKT2 may be趾import觚t biolo百cal parameter of naSopharyIlgeal carcinoma，觚d the target of仃eatiIlg n鹤opharyIlgeal carcinoma 3The conelation bet、)I，eeIl COX-2孤d AKT2 in eXpressions of nle tisSues of naSophaqy，Ilgeal carciIloma me黜t11at COX2觚d AKm may haVe c00rdinate regulation in me pamog饥esis of rl弱opharyngeal c椭noma【Keywords】Napharyngeal C甜cinoma；COX一2；AKT2：In瑚mnollistoch锄is仃y；IU-PCR41前言11研究背景鼻咽癌(nasophar)，119eal cardnom钆NPC)是我国高发肿瘤之一，占头颈部肿瘤发病率首位， 具有恶性程度高、转移性强的特点，在中国南方和国外中国南方移民及后裔中发病率极高， 严重危害了我国人民的生命健康。目前放射治疗仍是其最根本、最有效的治疗手段，但由于鼻 咽癌具有生长迅速以及高转移特性，最终仍有超过一半的患者由于远处转移或局部复发而治 疗失败。迄今，尽管有很多的研究，但对鼻咽癌的原因和发病机制至今仍不十分清楚，因此， 寻找鼻咽癌发生、开展和预后相关的分子标志物，以及寻找鼻咽癌新的治疗靶点，成为一个 重要的研究方向【卜2】。近年来研究发现，不同原因导致鼻咽黏膜受到刺激或损伤是鼻咽癌发生的重要诱因之一， 而鼻咽黏膜受到刺激或损伤时，局部前列腺素E2合成明显增加，环氧化酶一2(Cyclooxygell嬲e2，COX-2)是催化花生四烯酸产生多种前列腺素这一过程的重要限速酶【31，蒋代华等【钾检测了10、例正常鼻咽黏膜组织和62例鼻咽癌标本中COX-2的表达情况，结果显示，COX2在正常鼻咽 黏膜组织中不表达，在鼻咽癌组织中大局部表达，阳性率为77。42，即鼻咽癌组织中COx2 的阳性率明显高于周围正常组织，两者差异有统计学意义(P001)；EB病毒感染是鼻咽癌发 生的另一个重要原因，Muron0【5】研究发现，至少70的鼻咽癌患者中存在EBV致癌蛋白 LMPl(Latent M即曲rane Protein 1)的表达，而且LMPl阳性鼻咽癌样本中有CoX2的高表达，但 在LMPl阴性鼻咽癌样本中COX-2几乎不表达。因此COX2可能在鼻咽癌的发生、开展中起着 非常重要的作用。许新华等【6】检测了86例鼻咽癌组织中COX-2蛋白表达情况，发现COX-2在鼻咽癌组织中阳性表达率为733(6386)，与原发灶范围(尸005)、颈淋巴结转移(P005)和 肿瘤分级(p，o05)均密切相关；且与预后有关，生存期5年组COX-2蛋白表达阳性率(844呦 显著高于(P5年组(61O)；COX模型多因素分析显示，鼻咽癌的分期、复发、 转移和预后均与COx2有相关性。其结果与苗北平等【刀的研究结果相符，且苗进一步研究发 现COX一2的阳性表达与生存率成负相关。因此，COx2的高表达可能是影响鼻咽癌预后的重 要因素，可以作为判断预后的一种有用指标。人类的COX2基因定位于第一号染色体q252q253，长约83kb；由5端08kb的转录起 始点上游区，602kb的蛋白质编码区(其中包含lO个外显子和9个内含子)以及252kb的3端非编 码区组成，编码603或604个氨基酸。COX-2与COx1有5961的同源性，与COX1相比， CO)(-2基因少一个编码区信号肽的外显子；另外COX-2 II汛NA的3端非编码区大约多出15kb，5其中包含了22个拷贝的AI兀I，A基序，此基序能够迅速降解IIl】A的信息，与111附A的不稳定性有关，因此COX2是迅速反响基卧引。目前COX-2对鼻咽癌的发生、开展的作用机制有： (1)COX2参与癌前物质的活 化【91。(2)cOX-2刺激肿瘤细胞的增殖f101。(3)cOx2促进肿瘤血管的形成【Il】。(4)cOx2 抑制肿瘤细胞的凋亡【12】。(5)COX-2抑制机体的免疫反响【13】。(6)COX-2促进肿瘤的侵润与转移【体151。临床应用COX2抑制剂对鼻咽癌的治疗已经取得一定的疗效，但其治疗中仍然 存在一定副作用【161。COX2的具体作用机制及COX-2抑制剂的应用仍有待进一步研究。1987年，Staal等【17。18】发现小鼠的白血病病毒AI(t8可以引起水貂肺上皮细胞系CCL-64出现 恶性转化灶，随后在这个反转录病毒中找到了一个癌基因，被命名为朋灯。1991年，3个独立 的研究小组分别宣布找到了越汀基因，并发现它是一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，与蛋白激酶A0rotein kin勰e A，PKA)和蛋白激酶C Qrotein kinaSe C，PKC)在结构上很相似。因此，AKT又 被命名为蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)。在哺乳动物中PlAKT存在三种亚型： P；a以ktl、PKBBA虹2、Pl叫Akt3，它们有85的序列相似性，PKBAKT家族蛋白分子为 单链结构，尽管存在不同的亚型，但它们均具有类似的结构域，即由3个结构域组成：N端调节区(AH domain)由第1147氨基酸构成，其中1106氨基酸组成PH区(Pleckstrin homol090us domai曲，主要功能是将PKBAKT定位在细胞膜；中间的激酶区由第148411氨基酸构成，其 内包含一个保守的苏氨酸位点(Thr308厂rhr30911lr305)，该位点的磷酸化是PKBAKT活化所必 需的；C末端调节区由第412480氨基酸构成，富含疏水氨基酸和脯氨酸，可以和SH3(srC同源 序列3)区结合，除PKB丫外，PKB和Plp在这个区域均有一个丝氨酸位点(Ser473S卅74)【l蛇11。PKB，AKT的激活分为磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3kin嬲e，P13K)依赖和P13K非依赖 两种方式。P13KAKT信号传导通路(又称u汀通路)被视为癌细胞存活的重要通路。舢汀处于 该信号通路的枢纽部位，其功能除了涉及细胞周期调控、细胞凋亡启动等细胞生存调节外， 还参与血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭等诸多重要的生理及病理过程。因而剐|T是肿瘤发生的重要信号分子。剐5(T2是U汀的重要亚型之一，定位于人类染色体的19q131-q132，在人类多种肿瘤组织中都存在删的过度表达。P13KAKT2通路(艘通路)被证实参与了多种肿瘤的发生和开展瞄231。王晓鹏等【24】通过研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)调节鼻咽癌上皮样细胞系(C鲫cinoma印itlldioid cdlliIl骼1，CNED鼻咽癌细胞生长过程与P13鼬信号传导途径的关6系，发现P13幽介导bFGF对CNEI鼻咽癌细胞的信号传导，鼻咽癌细胞的即刻早期应答基因c-fos表达增加。Yip等【25】认为在鼻咽癌中，AKT的过表达与表皮生长因子受体(EGFR)的磷 酸化、Fl(HR(fbd(1lead gelle)、BAD(Bcl-2 aIltagonist ofcell deatll)有关，AKT通过灭活FR和 BAD促进细胞的增殖和存活，EGFRP13KAKT信号途径对于鼻咽癌的发病机制非常重要。EB 病毒(EBV)感染与鼻咽癌的发病有关，而EBv的主要致瘤蛋白潜伏膜蛋白1(Latent m翎1brane protein l，LMPl)可以改变上皮细胞的生长和移植特性，在EBV阳性的C6661鼻咽 癌细胞株中观察到，LMPl这些特性的变化需要P13KAKT信号传导途径和核因子KB(NFKB) 参与。而EBV的另一种致瘤蛋白潜伏膜蛋白2A(LMP2A)也能通过P13KAKT信号传导途径 和细胞外的信号调节激酶(E砌p上调UDP葡萄糖脱氢酶(UDP-酉ucosedehyd加genaSe，UGDH) 基因的表达，并且LMP2A在鼻咽癌中经常能检测到，它与鼻咽癌的高转移能力有关。可见 LMP2A相关的UGDH基因激活是鼻咽癌的一种分子机制【2铊7】。综上所述，COx2及AKT2在鼻咽癌的发生、开展中都有着重要的作用。且二者的作用机 制存在一定的交叉点。已有研究说明在结肠癌细胞中前列腺素E2是通过活化P13KAKT途径经 EP4受体促进癌细胞的生长和运动【281。这进一步说明了二者之间可能存在一定的相关性。目前对cOX-2及舢汀2作用机制的研究已经开展并不断完善，但仍有待进一步研究。本研究诣在探讨COX2及姗与鼻咽癌的关系以及二者在鼻咽癌中的相关性，以了解其在鼻咽癌发生、发展过程中的作用。12研究目的 本课题通过采用免疫组化染色SP法及lmPCR法分别从蛋白水平及lII】斛A水平研究COX2及肥在鼻咽癌组织中的表达水平，及其在鼻咽癌组织中的相关性。从细胞信号传导途径方向探讨鼻咽癌的发病机制及临床意义。13研究内容131采用免疫组化染色SP法及RT-PCR法，分别比拟鼻咽癌组织和正常鼻咽粘膜组织中 COX-2、AKT2蛋白及IIlI斟A的表达差异。以及COX2与U汀2在鼻咽癌组织中的相关性。 132测定不同性别、肿瘤侵润深度T、淋巴结转移范围N、临床TNM分期及组织学类型的鼻咽癌组织中CoX-2、AKT2蛋白和111】刚A的表达差异72材料与方法21材料211取材及标本处理2021年6月至2021年10月收集广东医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科内镜室52例鼻咽癌 患者为实验组，组织学类型为低分化鳞状细胞癌或未分化癌，其中男性33例，女性19例，患 者年龄30岁78岁，中位年龄54岁。21例“鼻咽粘膜慢性炎症患者为对照组。所有标本常规HE 染色，由有经验的病理医师核实诊断。所获标本按照2002年国际抗癌联盟制定的标准进行TNM分期【291。一局部标本均经lO福 尔马林固定，并在三日内进行石蜡包埋；而另一局部标本放入灭RNA酶的EP管并立刻放进液氮罐中保存，用于RTPCR式验。每个石蜡标本均做4岬连续切片数张，l张HE染色核实诊断，l张用于CoX-2免疫组化染色，1张用AKT2免疫组化染色，其余备用。PBS代替一抗作阴性对照。212病例纳入标准病例纳入标准病理学诊断确诊为鼻咽癌。无放、化疗史。均为首次门诊确诊的鼻咽癌。病例排除标准：鼻咽癌复发的患者有放、化疗史鼻咽部的良性肿瘤鼻咽部其 它恶性肿瘤。213主要实验仪器鼻内镜成像系统广州白云蓝天医疗器械液氮罐四川金凤YSD125型MDF38270超低温冰箱日本Sany0公司-20冰箱日本S舭y0公司普通冰箱海尔集团YJ1450SA型超净工作台苏州市净化设备厂 电热手提式压力蒸汽灭菌锅上海医用核仪器Y)(QSG4128型3SC0tsmaIl自动颗粒制冰机意大利Frirnont公司54l 5R高速低温离心机德国Eppelldorf公司微量移液器德国EppeIldorf公司，BP210S万分之一型天平德国Sanorius公司Uv-160型紫外分光光度仪日本Stlimadzy公司Leica胁2135石蜡切片机德国Leica公司 M2LstercycIe黟adient型PCR仪德国EppeIldorf公司， 水平式电泳槽北京市六一仪器厂Powerpac200型电泳仪美国BioRad公司m仃I型倒置相差显微镜日本olyIllpuS公司越CHT2光学照相显微镜日本OlyIIlpus公司凝胶成像分析系统美国BioRad公司214主要试剂(1)免疫组化试剂兔抗人COX2单克隆抗体 北京中杉金桥生物技术 鼠抗人U汀2单克隆抗体 北京中杉金桥生物技术 SP免疫组化通用试剂盒 北京中杉金桥生物技术DAB显色试剂盒北京中杉金桥生物技术多聚赖氨酸防脱片剂北京中杉金桥生物技术抗原修复缓冲液北京中杉金桥生物技术梯度酒精、PBS等广东医学院病理研究室常备试剂 (2)RTPCR试剂DEPC 美国IlIvi怕g吼公司EDlA 美国si舯a公司9三氯甲烷广东省西陇化工厂异丙醇广东省西陇化工厂无水乙醇广东省西陇化工厂内参上海生物工程公司引物上海生物工程公司Trizol总RNA提取试剂盒美国IlIVi昀geIlCO公司ImPCR试剂盒大连宝生物工程公司琼脂糖美国si舯a公司DNA marker DL2，OOO大连宝生物工程公司6L0ading bufl衙大连宝生物工程公司荧光显色剂SYBGreen I美国si舯a公司215实验主要试剂的配制(1)lDEPC处理水：吸取lml DEPC到1000lIll双蒸水中，放在lOOOml容量瓶中静置过夜，高压灭菌。(2)75无I矾ase乙醇的配制：用75ml无水乙醇+lDEPC处理水25Inl配制，然后放于-20保存。 (3)5TBE电泳缓冲液的配制：Tris硼酸O5M EDlA(PH8O)，用三蒸水溶解并定容为1000IId。配成5TBE(储存液)， 再将5xTBE稀释10倍成O5TBE，成为工作液浓度。22方法221免疫组化SP法检测Cox-2、Al汀2蛋白在鼻咽癌中的表达(1)染色方法采用免疫组化S-P法，按照SP检测试剂盒说明书所示步骤操作。同时北京中杉金桥生lO物技术的阳性对照片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。 (2)染色步骤把所有经中性福尔马林处理、石蜡包埋的蜡块标本经自动连续4岬的切片贴覆于经多聚L赖氨酸防脱片处理的载玻片上，60烘烤过夜；石蜡切片用二甲苯常规脱蜡、梯度酒精水化(由高浓度至低浓度)后用蒸馏水冲洗，PBs液浸泡5分钟。3H202去离子水孵育lO分钟，以消除内源性过氧化物酶的作用；将切片置于耐高温玻片架上，放入盛有柠檬酸组织修复液的压力锅中加热修复，至沸腾时开始计时，2分钟后取下，自然冷却至室温后取出玻片于蒸馏水中浸泡约2分钟；(D磷酸盐缓冲液(PBs)洗5分钟3次；甩去PBs液，滴加正常山羊血清，室温孵育15分钟以封闭荷电点消除非特异性着色，“倾去血清，勿洗；吸干液体，每张切片滴加相应一抗(coX2兔抗人单克隆抗体稀释度为：1；100；舢【T2鼠抗人单克隆抗体稀释度为：1：100)；PBS液代替一抗作为阴性对照；4冰箱过夜；謦(DPBs洗5分钟3次；(D甩去PBs液，滴加生物素标记二抗，室温10分钟； (DPBs洗5分钟3次；甩去PBs液，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37孵育1015分钟；PBs洗5分钟3次；甩去PBs液，每张切片滴加30分钟内新鲜配制的DAB显色液，镜下控制反响时间(一般5一15分钟)，自来水充分冲洗；o苏木素轻度复染，自来水充分冲洗lo分钟；ll盐酸酒精及氨水处理，自来水冲洗。 0依次经50、75、95、loo、100梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片； (3)结果分析每一批的免疫组化均设有阳性对照和用PBS替代一抗的空白对照，染色结果的判断 COx2及AKT2均以细胞质内出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性染色(详见附图)。两人按 盲法原那么分别独立对实验结果进行评估。在400倍镜下每一切片随机选择5个视野。具体判断标准【30】：采用专业图像分析软件IPP60对COx2及AKT2蛋白的表达进行定量分 析。每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(400)，测定每个视野下阳性反响的阳 性反响面积和所有细胞总面积，以每例5个视野的平均光密度作为该例的测量值。(平均光密 度=累积阳性反响的总面积细胞总面积)222半定量lmPcR检测COX-2、AKT2 mRNA在鼻咽癌中的表达水平RT-PCR检测时的考前须知： (1)防止RNA酶的污染，试验中的玻璃器皿洗涤干净后，硫酸泡酸过夜，清水冲洗干净，蒙锡纸，220中烘烤4小时；金属制品冲洗干净后220中烘烤4小时，每次使用之前高压消毒；所有塑料制品均已灭RNA酶，每次使用之前经过高压消毒30分钟，烤干后使用。 实验过程佩戴帽子、手套及口罩。(2)为了防止非特异性的扩增，必须设立阴性对照。(3)内参的设定：主要为了用于靶I斟A的定量。其目的在于防止RNA定量误差、加样误差以及各PCR反响体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。 (4)PCR不能进入平台期。出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。 实验步骤：(1)总砌恬的提取(总RNA提取所用的器皿均已经lDEPC水处理) 按1抛ol试剂盒说明书要求对所有标本组织进行总I斟A的提取 1)翻开超净工作台的紫外灯和抽风机，30分钟后开始操作；2)用保温瓶准备好液氮，取出放于70中的标本，用已灭酶的镊子取出组织标本；3)经电子天平称重，取50100mg的待测组织置于准备好的陶瓷研钵器中，两次参加液氮研磨， 参加lml放于冰上的碱zol试剂。在超净工作台内继续研磨，转至15ml的EP管中，颠 倒混匀10下，室温下静置5分钟；4)参加O2m1(为总体积的15)的氯仿，盖好盖子后颠倒混匀15s，室温下静置10min；5)转入低温(4)离心机离心，12000915min。离心后试管出现分层现象(三层)：上层无色的为总I斟A，中层白色膜状的薄层为蛋白质层；下层红色的为DNA。小心将上清液体吸出(约35叫50ll 1)，转移至15ml新离心管中(勿碰及中间白色絮状物)；6)参加等体积异丙醇，约3550 u l，振荡混匀后室温下静置10min；7)低温(4)离心，12000910min。离心后可见RNA呈白色片状附着在管壁底部，弃上清；8)参加冰预冷的75乙醇(1的DEPC水配置)1m1，温和振荡，使白色沉淀悬浮在乙醇中；9)低温4离心，750095min，弃去上清液：10)室温下枯燥5lO分钟(不能完全枯燥)；11)参加30II l的DEPC处理水，保存在70低温冰箱；12)RNA纯度和浓度的检测：取RNA2 u l加198 u l的DEPc处理过的水，稀释loo倍，霉 白对照为200 u l的DEPC处理过的水。RNA样品用Biophotometer生物分光光度计测定 A260和A280(A2A280=1820)。所得到的I斟A浓度按照以下公式计算： IA浓度(1I咖1)=A260幸40(u咖1)I埘A样品稀释倍数13)提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳结果证实。见以下图。13(2)引物的设计与合成目的基因COX2、川盯2以及内参pactin的mRNA引物设计运用引物设计软件Pm砑 PI也MIER50并且参照文献【3l-321设计而成，引物序列由上海生物工程公司合成。设计过程如 下：1)序列查找：h_ttp：价哪wn曲i111m1lih90v佃ubmed查找所需基因的序列。 2)参照文献并用PriIner PREMIER5O设计并筛选引物。3)同源性比拟：到h婶：肋lastncbi111mnih90v仍l嬲tc百上将所设计的引物进行同源性分析。引物序列如下：C025TGTGTCAAGCACTGTGGGl门r-35GAGGCACTGAAACA丌CGCA-3扩增产物长度为：317bpAKT25GGCTGGGATGAGATGGAAGA3 5AGCTACAGCTAGGACTCG丁L3扩增产物长度为：204bppactin5一AGAGCTACGAGCTGCCTGAC一35AGCACTGTG丌GGCGTACAG-3扩增产物长度为：184bp 引物离心后用1DEPC处理水稀释至100“M的储存液，并分装，20保存。实验时在用1DEPC处理水稀释至10斗M。 (3)两步法RT-PCR按照TaK出a公司的PrimeScriptlM RTPcR瞄t使用说明书操作，均在冰上操作。1)反转录反响：在20叫的EP管中按照表21配制以下混合液14表21反转录体系的组成1Compon铋tvol啪em、ITPMi)【tu他(10mM each)lmOli90 dTPm盯(25 pM)1山1b叩late RNAldable l pgactionRNase FrdH20upt0 10山心20sec：T0tal Vblu眦(D将上述的混合液低温4离心20sec，然后在PcR仪上进行反转录反响：42，25min；95，5min；将反转录液放于冰上。2)PCR反响在200II l的EP管按照表23中配制混合液15表23 PCR反响液的组成Colnponentvohl加旧lOPCR Buffer叫椰Mixtll豫(10mM each)触lOM P血ler-FlOuM P而mer-RMTal妣Ex T锄fMHs(5 u似)表22中的反转录液轧剐N船e FrdH20加样时Prim昏F及Prim昏R必须一致，分别为COX-2 or越汀2 or p-actin。反响条件Predeg吼eration将PCR管置于已预热至94的PCR仪上，按表24进行ImPCR。表24 I盯PCR的反响条件Xx退火温度为：CoX2为57；舢为54；p-枷n为57。(4)琼脂糖凝胶电泳和图像分析 1)用蒸馏水将电泳槽及梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子；2)本实验选用15浓度的琼脂糖凝胶；3)配制O5TBE电泳缓冲液30IIll于三角烧瓶内，称取0459琼脂糖凝胶粉后参加三角烧瓶内，16放置微波炉上加热两次，冷却至60后倒入电泳槽中，等待凝固； 4)向电泳槽中倒入O5TBE电泳缓冲液，保持液面高于凝胶23mm，轻轻地拔去梳子，防止加样孔撕裂；5)取SYBR帆eIl I染料与6Loadingbu脓的比例l：6，离心混匀；6)取上述染料1pl与PCR产物5Il混匀，参加点样孔；7)接通电源，让DNA样品由负极向正极泳动15 mV锄，本实验选用80mV；8)根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。当二甲苯菁F达凝胶底部时，停止电泳；9)电泳完后，紫外透射仪观察结果，并拍图片(详见附图)。图片用扫描仪扫描后，用BaIldScaIl50 图像分析软件进行光密度积分值的分析，计算出COX2、AKT2的灰度，分别与内参照pactiIl的光密度积分值之比作为COX2、AKT2的相对含量值。 223统计学分析p实验数据统一采用SPSSl3O统计学软件分析，计量资料用均数标准差(XS)表示； 两组间差异比拟用t检验，三组间差异比拟用方差分析和q检验。分类资料的两组间差异比较用卡方检验，四格表资料的相关行分析用Pearson相关分析，单向有序行乘列表资料用秩和检验，双向有序行乘列表资料用Spe锄孤相关性检验。以尸O05为差异有统计学意义。173结果31 COX2、舢汀2蛋白在鼻咽癌和正常粘膜组织中的表达情况COx2、剐订2蛋白阳性表达均主要定位于细胞质，少数有细胞核着色。主要呈现棕黄色 和棕褐色等不同程度的染色。在52例鼻咽癌中COx2、剐订2蛋白阳性表达平均光密度分别为 O2863士O0145，O3567士00379；在21例对照组中COX-2、甜汀2蛋白阳性表达平均光密度分别为00851士00079，O1241士O0312；COx2、AKT2蛋白阳性表达分别与对照组比拟，尸0001， 差异有统计学意义。详见表1。表lCOX2、AK，r2蛋白在鼻咽癌和正常粘膜对照组中的表达与对照组比拟：户5993，p(O00l；卢2489 P，000l32 COX2、AKT2蛋白表达和鼻咽癌病理参数的关系321 COX2蛋白表达和鼻咽癌临床病理参数的关系 经统计检验分析得出鼻咽癌组织中，在不同性别中的COX-2蛋白表达强度无显著性差异；在不同组织学类型中的COX-2蛋白表达强度亦无显著性差异，胗005；在不同侵润深度、颈淋巴结转移程度、删临床分期中COX-2蛋白表达强度有所不同，各组内的差异有统计学意义，PO01，其中对超过两组的多样本进行两两比拟，差异均有统计学意义(PO05女190278士0089侵润深度Tl2901 19士O0125，乏4726P(O00lT216O1 89士O057T3470286士O078颈淋巴结转移No20O1036士00115犀6436JP000l NI24O1 912士O049N238O29 l士0059删分期O1245士00124户：=4092POOOlII260189士O042III8O297士O078组织学类型低分化90248士O054户1536尸身005未分化43O298士0094方差分析多样本两两分别比拟，均有统计学意义，pO0519323艘蛋白表达和鼻咽癌临床病理参数的关系经统计检验分析得出鼻咽癌组织中，在不同性别中的u(T2蛋白表达强度无显著性差异； 在不同组织学类型中的COx一2蛋白表达强度亦无显著性差异，胗O05；在不同侵润深度、颈 淋巴结转移程度、TNM临床分期中AKT2蛋白表达强度有所不同，各组内的差异有统计学意 义，PO05女l 90369+0092侵润深度Tl290146士O059，-500lP0oolT2160267士O046T347O379士0093颈淋巴结转移N0200159士O045，-5567尸o05未分化43O384士O043方差分析多样本两两分别比拟，均有统计学意义，PO0533 Cox2、AKT2 mRNA在鼻咽癌和正常粘膜组织中的表达情况52例鼻咽癌中COX2、址玎2 mI矾A阳性表达量分别为0735士O230，O931士0249；在2l 例对照组中CoX一2、AK，r2 mRNA阳性表达量分别为O2745士O0265，0350士O135；CoX2、 AKT2 mRNA阳性表达量分别与对照组比拟，尸0ool，差异有统计学意义。详见表4。表4COX2、AKT2 mRNA在鼻咽癌和正常枯膜对照组中的表达与对照组比拟：户9113，pO00l；卢1008，Po05；但是COx2 mRNA的表达量分别在不同侵润深度、颈淋巴结转移、盯婚嗄分期中的表达量有所不同，各组内的差异有统计学意义，PoOl；其中对超过两组的多样本进行两两比拟，差 别均有统计学意义，pO05。详见表5。2l表5 COX2训妣表达和鼻咽癌病理参数的关系方差分析多样本两两分别比拟，均有统计学意义，po05； 但是衄n瓜NA的表达量分别在不同侵润深度、不同颈淋巴结转移、不同TNM分期中的22表达量有所不同，各组内的差异有统计学意义，氏0Ol；其中对超过两组的多样本进行两两比拟，差异均有统计学意义，Po05。详见表6。表6AKT2 mI埘A表达和鼻咽癌病理参数的关系方差分析多样本两两分别比拟，均有统计学意义，pO0535 COX2、Al汀2表达在鼻咽癌中的相关性CoX一2、栅蛋白在鼻咽癌中表达情况用直线相关分析发现两者具有正相关关系(尸O622；p：O001)；COX-2、AKT2 IIl】e斟A在鼻咽癌中表达亦具有正相关关系(严O656：pO001)。COX-2与AI汀2蛋白表达的散点图COX2与舢mRNA表达的散点图4讨论41CoX2与鼻咽癌鼻咽癌(n鹤opharyIlgeal carcinoma，NPC)是我国多发肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉科恶性 肿瘤之首。我国是世界各大洲中鼻咽癌的最高发地区之一。国内鼻咽癌分布有明显的地区性 差异，以广东省为高发中心。迄今病因仍欠明了，与其发生有密切关系的因素有：遗传因素、 EB病毒感染、环境因素、微量元素等。其病变首发于鼻咽粘膜上皮，但是由于部位较隐蔽， 临床表现复杂多变，早期不易发现，故大多数患者初诊时就有颈部淋巴结转移。目前放射治 疗仍是其最根本、最有效的治疗手段，但由于其具有生长迅速以及高转移特性，最终仍有超 过一半的患者由于远处转移或局部复发而治疗失败【l埘。因此寻找能用于其早期诊断以及预测 预后的生物标志物成为鼻咽癌防治研究，特别是高发区普查的一个重要课题。环氧化酶(COx)是前列腺素(PG)合成过程中的一个重要限速酶，前列腺素作为重要的炎 症介质，具有促进细胞增生、抑制细胞凋亡以及刺激新生血管生成等多种功能。COX有两种A 基因型即结构型COX-l和诱导型COx2。COX-1呈结构性表达，其稳定表达对维持细胞正常的生理功能有重要意义。CoX2为诱导型基因，在大多数正常组织中检测不到，可由细胞。 因子、生长因子、原癌基因、癌基因、肿瘤启动子等诱导，它与细胞生长和肿瘤发生密切相 关【31。近年的研究说明，COX2参与多种致肿瘤机制：(1)COX2的产物前列腺素E2在局 部以自分泌和旁分泌的形式与邻近组织其它类型的细胞或同种细胞的细胞膜上的EP(Es嘶骼孵 ofProsta哲alldin Rec印tors)受体结合，通过G2蛋白偶联途径或核内过氧化物酶增殖体激活受体(Peroxisome Proli衔ative ACtivatI耐Rec印tor，PP埘来促进肿瘤细胞的生长【101。(2)COX2通过调节基质金属蛋白酶来促进肿瘤血管的生成【ll】。(3)Cox2通过调节Bcl2(B cell lynlphoma_2)的表达以及产生前列腺素和去除花生四烯酸来完成对肿瘤细胞凋亡的抑制【12】。 (4)COX