粮食中玉米赤霉烯酮——胶体金快速测试卡检测方法编制说明

粮食中玉米赤霉烯酮胶体金快速测试卡检测方法编制说明粮食中玉米赤霉烯酮胶体金快速测试卡检测方法标准起草组2011年 11 月粮食中玉米赤霉烯酮胶体金快速测试卡检测方法编制说明1 任务来源及工作过程国务院粮食管理流通条例和粮食卫生标准都明确规定粮食收购要对真菌毒 素玉米赤霉烯酮进行检验控制，而我国标准体系中缺少呕吐毒素快速检测的方法 及标准因此，该项研究迫在眉睫。我国是农业大国，农产品种植区分布广泛，粮食收购多集中在县以下单位的 粮食收储库点。时间短，收购量大，存在很多隐患。主要集中在以下方面：一方 面粮食入库时间短，不宜长时间露天存放，因此对玉米赤霉烯酮的检测需要快速 定性。另一方面收购企业技术力量和硬件设备不足，利用大型仪器检测收购粮真 菌毒素无法普及。因此目前在粮食收购环节最需要解的问题就是建立高效、快速、低成本的定性检测方法。传统上，真菌毒素的分析一般采用薄层色谱法(TLC和高效液相色谱法(HPLC) TLC虽然简便，但灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操 作复杂，仪器昂贵。这两种方法都不适合在收购原粮时进行快速定性检测。因此需要玉米赤霉烯酮快速检测方法的研究，从源头解决储备粮真菌毒素污染问题。为了确保公民的饮食安全，进一步保证产品质量、规范生产、为市场监督提 供依据，需要制定粮食中玉米赤霉烯酮一一胶体金快速测试卡检测方法 标准, 按照GB2760-2007的要求，对小麦粉及其制品中玉米赤霉烯酮的含量进行监督。本行业标准的制定是根据国家粮食局标准质量中心下达的 年国家标准制修订任务，由北京市粮油食品检验所负责起草。项目编号： 2.编制过程2.1第一阶段工作第一阶段为收集国内外玉米赤霉烯酮测试分析标准及相关资料， 了解掌握玉米赤霉烯酮测定方法的最新技术发展情况阶段。本阶段查阅了大量的文献资料， 参考国内外玉米赤霉烯酮测定方法的国家标准和行业标准。 标准编制小组成员经 过研究和讨论一致认为， 胶体金快速检测方法具有较好的可操作性和实用性， 因 此我们参考这些先进方法和产品， 并根据国内粮食行业的实际生产和检测技术应 用情况，着手制定 粮食中玉米赤霉烯酮胶体金快速测试卡检测方法的基本思路和主要工作方向。2.2 第二阶段工作 第二阶段为组织起草并召开标准起草组工作会议。本标准起草组在经过收 集、整理资料和调研工作的基础上， 提出标准提纲， 确定了标准的主要内容和要 求。标准起草工作组成员单位进行讨论、论证，形成标准初步文本；标准起草组 成员单位间通过多种形式不断交流、 补充、 完善标准文本， 进行验证试验和比对 试验，最终形成该标准征求意见稿。本阶段重点组织了玉米赤霉烯酮检测方法的验证试验。 先后开展了两轮比对 试验，针对各家分析实际操作时标准文本中存在的问题及建议， 对标准进行了修 改，得到标准起草小组的一致认可，形成该标准征求意见稿。3 编制原则3.1 本标准按照 GB/T 1.1-2009、GB/T 20000.2-2009 和GB/T 20001.4-2001标 准编写规则 第4 部分 化学分析方法 的规定和要求编写， 在标准框架、 结构和 内容等方面符合这些标准的要求。3.2 强制性国家标准粮食卫生标准规定了粮食中玉米赤霉烯酮的安全限量， 且本标准所确定的检测方法能满足该标准的初步筛选测定。4. 国家标准主要内容的论据4.1 本标准的主要内容粮食中玉米赤霉烯酮胶体金快速测试卡检测方法标准为推荐性标 准，其主要内容包括：（1 ） 封面（2） 前言3） 标准主体内容：范围、规范性引用文件、原理、试剂、仪器设备、样品制备、样品测定与结果判定。4.2 主要试验（或验证）的分析4.2.1 标准方法原理 玉米赤霉烯酮毒素胶体金快速测试卡检测技术原理是基于抗原抗体反应、 免 疫金标记技术及毛细管层析技术。 以微孔膜为固相载体， 将可特异性识别玉米赤 霉烯酮的抗体标记红色或紫红色的胶体金颗粒， 检测卡的膜上两个色带分别固定 玉米赤霉烯酮抗原， 以及抗鼠源性抗体的二抗， 根据色带的颜色变化进行结果评 估。质控色带（ control line ）不会被样品中的玉米赤霉烯酮影响，而在每次反应 后都应出现，用于证明检测条是否正常。检测色带（test line）在样品中没有玉 米赤霉烯酮或样品中玉米赤霉烯酮的含量低于检测限时会显现； 在样品中玉米赤 霉烯酮含量等于或高于检测限时不出现。4.2.2 验证方案验证对象及验证单位参考粮食卫生标准， 确定本次验证粮种为小麦和玉米， 考虑到加标样品的毒 素分布、均匀性等影响， 本次验证全部采用天然阳性样品进行验证； 验证毒素为 玉米赤霉烯酮（DON）;验证用胶体金快速测试卡采用国内二家公司提供的DON三批次。验证单位为（北京）国家粮食质量监测中心、 （湖北）国家粮食质量监 测中心、（辽宁）国家粮食质量监测中心、 （重庆）国家粮食质量监测中心、 （四 川）国家粮食质量监测中心和（广西）国家粮食质量监测中心。阳性样品的制备北京中心将收集到的阳性样品粉碎，至少 80%以上通过 20 目筛，筛上和筛 下物混匀，采用免疫亲和柱高效液相色谱法对制备的阳性样品进行混合均匀度测 定，混合均匀性达到要求后将阳性样品分发给六家国家检测中心。4.2.2.3 阳性样品定值六家国家检测中心收到阳性样品后， 采用免疫亲和柱高效液相色谱法进行平 行试验测定结果报送北京中心进行统计处理，取平均值作为理论值。4.2.2.4 测试卡验证六家国家中心将分发并定值后的高浓度阳性样品与空白样品按照各测试卡样品量要求分别称取，配置所需浓度，然后按照测试卡说明书指定的方法进行测定。423结果与分析采用两种DON测试卡（测试卡A和测试卡B）,各三个批次，按照各自规定 的操作步骤和评定方法对玉米中 DON进行了测定。准确性测试卡A根据结果，共进行21个浓度150次有效测试，共出现误判21次，判定准确 率为86%,假阳误判出现3次，假阴误判出现18次。具体结果见下表1：表1玉米赤霉烯酮测试卡A误判情况表品种测试次数误判次数误判率%假阴误判次数假阴误判率%假阳误判次数假阳误判率%玉米152114.1812.32.00004.2.3.1.2 测试卡 B根据结果，共进行21个浓度142次有效测试，共出现误判24次，判定准确率为83.1%，假阳误判出现9次，假阴误判出现15次。具体结果见下表2：表2玉米赤霉烯酮测试卡B误判情况表品种测试次误判误判率假阴误假阴误假阳误假阳误数次数%判次数判率%判次数判率%玉米1422416.91510.696.3重复性测试卡A:按照验证方案，共进行240次测试，其中有效结果为240次，共 出现误判29次，判定准确率为87.9%,其中假阴性误判次数为11次，出现比例 为 4.6%。测试卡B:按照验证方案，共进行243次测试，其中有效结果为243次，共 出现误判29次，判定准确率为88.1%,其中假阴性误判次数为20次，出现比例 为 8.2%。423.3稳定性测试卡A根据有效结果，按照含量为限量标准时应判定为阳性的规则，各不同产品批次测定结果如下表3：表3测试卡A不同产品批次测定结果批次测试次数误判判定准确率%2010111016193.82010111625292.02010112624387.52010110615286.7批间相对偏差%3.84.2.3.3.2 测试卡 B根据有效结果，按照含量为限量标准时应判定为阳性的规则，各不同产品批次测定结果如下表4:表4测试卡B不同产品批次测定结果批次测试次数误判判定准确率%G101009301330100G101125304390100G10112530529582.8批间相对偏差%10.5约定误差范围试验测试卡A:在40-80ppb浓度范围内，对玉米样本共进行12个浓度的测定， 共获得有效结果102次，假阴出现16次，基本平均分布在60-80ppb浓度之间, 且110与120ppb浓度下也各出现1次误判；假阳出现3次，分别在在55ppb浓 度2次、58ppb浓度1次，总体样本假阳误判率为2.9%。测试卡B:在40-80ppb浓度范围内，对玉米样本共进行12个浓度的测定， 共获得有效结果92次，假阴出现14次，基本平均分布在60-80ppb浓度之间， 另外，在120ppb浓度下出现1次误判；假阳出现9次，分别在在40ppb-58ppb 浓度之间，总体样本假阳误判率为 9.8%。结论现有国家标准方法中规定的ZEN测定方法精密度（见表5）。表5玉米赤霉烯酮检测相关标准标准号GB/T5009.209-2008GB/T23504-2009SN/T1772-2006标准名称食品中玉进出口粮谷中米赤霉烯玉米赤霉烯酮酮的测定的测定采用方法免疫亲和层析HPLC薄层色谱ELISAHPLC重复性%15101015/再现性%/检出限/量5ug/kg20ug/kg20 ng0.25 ng5ug/kg回收率%/70-100/73.7-98.24.2.4.2测试卡性能（见表6）：表6测试卡B不同产品批次测定结果准确率批次测试卡A% 测试卡B%备注准确性8683.1玉米重复性87.988.1玉米稳定性9095.0玉米约定误差范围（5081.273.3玉米mg/kg 70 mg/kg）4.243呕吐毒素测试卡指标设定准确性判定误判率：结合4.241中目前国内方法的各项指标可设定为小于 15% 重复性判定误判率：结合4.241中目前国内方法的各项指标可设定为小于 15% 稳定性判定误判率：结合4.241中目前国内方法的各项指标可设定为小于 15% 约定误差范围（50 mg/kg70 mg/kg）内判断误判率：该方法中，两种测试卡的约定误差范围误判率提取机制上进一步改进，应当能解决误判率告的问题，因此将该浓度范围内的误判率定为小于15%5. 国家标准作为强制性国家标准或推荐性国家标准的建议建议将此国家标准列为推荐性国家标准。6. 贯彻国家标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过度办法等内容）建议职能管理机构，指定生产部门，生产贯彻本标准以达到保护消费者权益的目的。7. 新旧国家标准的总体对比8. 技术经济论证及预期的社会经济效果国际上少数国家针对粮食玉米赤霉烯酮含量的检测制定了试行方法，但方法均不统一。我国目前还未制定相关的快速筛选方法标准。随着食品安全、粮食安全战略意义的不断扩大，以及我国经济的快速发展，加入世界贸易组织，与国际 标准接轨，必须制定相应的检测标准进行安全控制。现状：我国是农业大国，农 产品种植区分布广泛，粮食收购多集中在县以下单位的粮食收储库点。时间短， 收购量大，存在很多隐患。主要集中在以下方面：一方面粮食入库时间短，不宜 长时间露天存放，因此对玉米赤霉烯酮的检测需要快速定性。 另一方面收购企业 技术力量和硬件设备不足，利用大型仪器检测收购粮真菌毒素无法普及。因此目前在粮食收购环节最需要解的问题就是建立高效、 快速、低成本的定性检测方法。该标准的制定有利于促进产业升级和产品结构的调整、 推动技术进步和技术 创新、推进与国际惯例接轨； 有利于粮食质量标准体系的建立； 有利于公共食品 安全。9. 参考的国际标准无10. 与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系11. 关于强制性条款12. 贯彻国家标准的要求和措施建议1）首先应在实施前保证文本的充足供应， 让每个使用者都能及时得到文本。 这是保证新标准贯彻实施的基础。2）发布后、实施前应将信息在媒体上广为宣传。3）本次修订，不仅与生产厂家有关，而且与消费者有关。对于使用过程中 容易出现的疑问，要在媒体上撰文事先予以解释。4）要分别标准的不同使用对象，消费者、生产厂家、质量监管部门等，有 侧重点地进行培训、宣传。5）实施的过渡期宜定为 6 个月。6）建议质量监督部门加强监测。13. 废止现行有关标准的建议 无