中医药研究常用分生物学技术

第二章 遗传物质及遗传信息的传递n除了少数的RNA病毒之外，DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者。 DNA遗传信息的传递中心法则n遗传信息从DNA到RNA转录n遗传信息从mRNA到蛋白质翻译nDNA模板与模板与mRNA分子及多肽链之间分子及多肽链之间存在共线性关系。存在共线性关系。第一节第一节 DNADNA的变性、复性和的变性、复性和DNADNA杂交杂交n一、变性一、变性(denaturation)(denaturation)n在化学或物理因素的影响下，维系核酸二级结构在化学或物理因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋双螺旋解旋成为单链的过程称为变性。成为单链的过程称为变性。n变性可发生在整个变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部分子中，也可发生在局部的双螺旋阶段上的双螺旋阶段上 。nDNA变性不涉及核苷酸中磷酸二酯键的断裂。变性不涉及核苷酸中磷酸二酯键的断裂。 n引起引起DNADNA变性的因素有：变性的因素有：酸酸、碱（碱（PH=11.3PH=11.3）、热热、某些变性剂（如尿素、胍）和某些有机溶剂（如某些变性剂（如尿素、胍）和某些有机溶剂（如乙醇、丙酮）等。乙醇、丙酮）等。二、复性（二、复性（renaturationrenaturation）n变性的变性的DNA两条互补单链，在适当条件下重两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程称为新缔合成双链的过程称为DNA复性或退火。复性或退火。 n复性可分为两个阶段：首先是复性可分为两个阶段：首先是成核成核（nucleation），然后是），然后是拉链式拉链式(zippering)(zippering)。n复性开始时复性开始时, ,两条两条DNADNA单链随机碰撞形成局部单链随机碰撞形成局部双链，双链， 如果是正确的互补区形成的碱基对，如果是正确的互补区形成的碱基对，就就成核（成核（101020bp20bp）。）。如果不是正确的互补如果不是正确的互补区，就解开，继续碰撞。区，就解开，继续碰撞。n成核后，两条单链的其余部分碱基就像成核后，两条单链的其余部分碱基就像“拉拉链链”哪样完成整个复性过程。哪样完成整个复性过程。 DNA复性速度受多种因素影响：复性速度受多种因素影响： DNA大小与信息的多少大小与信息的多少 ：DNA片段小的片段小的比大的容易复性，反之亦然。信息含量比大的容易复性，反之亦然。信息含量少的比多的容易复性。少的比多的容易复性。 离子强度离子强度 ：通常增加盐浓度，可加速两通常增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。所以，要保条互补链重新结合的速度。所以，要保持单链持单链DNADNA，盐浓度低于，盐浓度低于0.01mol/L0.01mol/L。 DNADNA浓度：浓度：DNADNA浓度越大两条互补链彼此浓度越大两条互补链彼此相遇的可能性越大，复性的速度也就越相遇的可能性越大，复性的速度也就越快。快。三、杂交三、杂交n上述复性上述复性DNA中，如果两条链来源不同，中，如果两条链来源不同，这就叫做杂交分子。这就叫做杂交分子。 n杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基序列完全互补，只要有一定同源序性（不序列完全互补，只要有一定同源序性（不同来源）的单链彼此间有一定程度的互补同来源）的单链彼此间有一定程度的互补序列就可以形成杂交链。序列就可以形成杂交链。 n杂交分子可以在杂交分子可以在DNADNA和和DNADNA、DNADNA和和RNARNA、RNARNA和和RNARNA以及以及人工合成的寡核苷酸单链与人工合成的寡核苷酸单链与RNARNA或或DNADNA单链单链之间进行。之间进行。 第二节第二节 DNADNA的合成的合成n一、半保留复制一、半保留复制nDNADNA复制时，两条链间的氢键破裂并使双链复制时，两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板、按碱解旋和分开，然后以每条链为模板、按碱基配对原则进行互补合成基配对原则进行互补合成DNADNA，新形成的每，新形成的每个子代个子代DNA的一条链来自亲代的一条链来自亲代DNA，另一，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制保留复制(semi conservation replication)。1、复制起点和复制子、复制起点和复制子nDNA复制在生物细胞中要从复制在生物细胞中要从DNA分子上特分子上特定位置开始，这个特定的位置就称为定位置开始，这个特定的位置就称为复制复制起点起点(Origin of replication)，用，用ori表示。表示。nDNA复制从起点开始双向进行直到终点为复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的止，每一个这样的DNA单位称为单位称为复制子复制子或或复制单元复制单元(replicon)。 n复制起点在复制起点在DNA内部内部n原核生物只有一个复制子原核生物只有一个复制子n真核生物有多个复制子，真核生物有多个复制子，每个复制子长约每个复制子长约50-200kb。 2、DNA复制的特点复制的特点nDNA复制的最主要特点复制的最主要特点（1 1）半保留复制半保留复制 n（2 2）半不连续复制半不连续复制(Semi-ondisctinuous replication)。 n在复制起点两条链解开形成复制泡在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制向两侧复制形成两个复制叉形成两个复制叉(replication forks)。 n以复制叉移动的方向为基准以复制叉移动的方向为基准 ，一条链连续，一条链连续复制，为先导链复制，为先导链(leading strand) ；另一；另一条链不连续复制，形成条链不连续复制，形成冈崎冈崎片段片段(Okaxaki fragments) ，是后随链，是后随链(lagging strand) 。二、参与二、参与DNA复制的有关物质复制的有关物质n模板模板DNA，三磷酸核苷酸，三磷酸核苷酸(dATP,dGTP，dCTP，dTTP)是是DNADNA合成的原料。合成的原料。 n还需要一些酶参与还需要一些酶参与DNA合成合成n(一一)螺旋酶螺旋酶(Helicase)n又称为解旋酶，是一类特殊的蛋白质可以又称为解旋酶，是一类特殊的蛋白质可以促使促使DNA在复制叉处打开双链。在复制叉处打开双链。 n螺旋酶可以和单链螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与结合，并且与ATP结合，利用结合，利用ATP分解成分解成ADP时产生的能量时产生的能量沿沿DNA链向前运动促使链向前运动促使DNA双链打开。双链打开。 (二二)单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSBP)n单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand DNA binding protein SSBP)能很快地和单链能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。或被核酸酶降解。 (三三)DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA Topisomerase)nDNA拓扑酶催化同一拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋分子不同超螺旋状态之间的转变。状态之间的转变。 nDNA拓扑异构酶有两拓扑异构酶有两类类 ：拓扑异构酶拓扑异构酶 ，如如大肠杆菌的大肠杆菌的蛋白蛋白(MW-110000) ；n拓扑异构酶拓扑异构酶 ，如，如大大肠杆菌中的肠杆菌中的DNA旋转旋转酶酶(DNAgyrase) 螺旋与超螺旋螺旋与超螺旋由于强行分开双螺旋末端而由于强行分开双螺旋末端而引发产生的超螺旋结构引发产生的超螺旋结构(四四)引发酶引发酶(Primase)和和RNA聚合酶聚合酶(RNA Polymerase)n引发酶催化引物引发酶催化引物RNA分子的合成分子的合成 。nRNA聚合酶也是催化聚合酶也是催化RNA分子的合成。分子的合成。n人们认为后随链前体片段的引物是由引发人们认为后随链前体片段的引物是由引发酶合成的，而先导链的引物是由酶合成的，而先导链的引物是由RNA聚合聚合酶合成的。酶合成的。 n可能在大多数情况下，两种类型的引物都可能在大多数情况下，两种类型的引物都是由引发酶合成的，而是由引发酶合成的，而RNA聚合酶的主要聚合酶的主要作用就是通过转录过程而解开局部的作用就是通过转录过程而解开局部的DNA双螺旋。这种作用就称为双螺旋。这种作用就称为转录激活转录激活(transcriptional activation)。（五）（五）DNA聚合酶聚合酶(DNA Polymerase)n这类酶的共同性质是这类酶的共同性质是:n1以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化为前体催化合成合成DNA;n2需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在;n3不能起始合成新的不能起始合成新的DNA链链;n4催化催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链的链的3 -OH末端末端;n5催化催化DNA合成的方向是合成的方向是53。 1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶n大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApolymerase，DNApol) n这是这是1956年由年由Arthur Kornberg首先发现的首先发现的DNA聚合酶，又称聚合酶，又称Kornber酶。酶。n由一条多肽链组成，约含由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，个氨基酸残基，MW为为109KD。 n经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为两个片段，大片段分子量为76KD，通常称，通常称为为Klenow片段片段，小片段的分子量为，小片段的分子量为34KD。 DNApol I的功能的功能n1聚合作用聚合作用:在引物在引物RNA-OH末端，以末端，以dNTP为为底物，按模板底物，按模板DNA上的指令由上的指令由DNApol逐个将逐个将核苷酸加上去，就是核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。的聚合作用。 n23 5 外切酶活性外切酶活性校对作用校对作用：从从35 35 方向识别和切除不配对的方向识别和切除不配对的DNADNA生长链末生长链末端的核苷酸。端的核苷酸。 n35 3 外切酶活性外切酶活性切除修复作用切除修复作用：从从5 3 5 3 方向水解方向水解DNADNA生长链前方的生长链前方的DNADNA链，链，主要产生主要产生5-5-脱氧核苷酸。脱氧核苷酸。 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol) n 1970年发现了年发现了DNApol。此酶。此酶MW为为120KD，每个细胞内约有，每个细胞内约有100个酶分子，个酶分子，但活性只有但活性只有DNApol的的5%。该酶的催。该酶的催化特性如下：化特性如下：n(1)聚合作用聚合作用 n(2)该酶也具有该酶也具有3 5 外切酶活性，但无外切酶活性，但无5 3 外切酶活性。外切酶活性。 n(3)该酶对作用底物的选择性较强该酶对作用底物的选择性较强 n(4)该酶不是复制的主要聚合酶该酶不是复制的主要聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol) nDNA pol 全酶由多种亚基组成全酶由多种亚基组成 n大肠杆菌每个细胞中只有大肠杆菌每个细胞中只有10-20个酶分子个酶分子 ，尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催化脱氧核苷酸掺入化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是链的速率分别是DNA聚合酶聚合酶I I、的的15倍和倍和30倍。倍。 nDNA聚合酶聚合酶是细胞内是细胞内DNA复制所必需的复制所必需的酶酶 n有聚合作用：有聚合作用： 从从5 3 方向合成方向合成DNAnDNApol也有也有3 5 和和5 3 外切外切酶活性酶活性 。DNA pol 酶的组成酶的组成亚基 分子量(103) 其它名称 生物功能140dnaE蛋白，polC蛋白 聚合功能和5 3 外切酶活性 253 5 外切酶活性 10 83保证 亚基 52dnaZ蛋白 作用的发挥 32dnaX蛋白 40dnaN蛋白，copol 2 2、真核生物的、真核生物的DNA聚合酶聚合酶 n真核生物中也具有几种真核生物中也具有几种DNA聚合酶，但这些聚聚合酶，但这些聚合酶都没有合酶都没有3 5 或或5 3 外切酶活性。外切酶活性。n主要的酶主要的酶(占总量的占总量的80-90%)是是DNA聚合酶聚合酶，分子量为分子量为300KD，含有，含有4个或个或5个亚基，主要负个亚基，主要负责染色体责染色体DNA的复制。的复制。nDNA聚合酶聚合酶，分子量为，分子量为45KD，仅含有一条链，仅含有一条链，主要作用是修复核内主要作用是修复核内DNA。nDNADNA聚合酶聚合酶，分子量为，分子量为140KD，存在于线粒体，存在于线粒体内，负责催化线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。的复制。n DNA聚合酶聚合酶 ，具有具有3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 。 分子量分子量300KD45KD140KD？个数细个数细胞胞20006000/cell聚合作用聚合作用核内核内DNA复制复制修复核内修复核内DNA线粒体线粒体DNA复制复制与与协同协同作用作用3 5 外切酶活外切酶活性性无无无无无无有有真核生物真核生物DNADNA聚合酶种类及作用聚合酶种类及作用（六）（六）DNA连接酶连接酶(DNA ligase )nDNA连接酶是连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。年在三个实验室同时发现的。 n它是一种封闭它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助链上缺口酶，借助ATP或或NAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNA链的链的5 -PO4与另一与另一DNA链的链的3 -OH生成磷酸二酯键。生成磷酸二酯键。 nDNA连接酶连接酶在在DNA复制、修复和重组中起着重要复制、修复和重组中起着重要的作用的作用 。n真核生物细胞中的真核生物细胞中的DNA连接酶有两型连接酶有两型 ：DNA连连接酶接酶分子量约为分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛，主要存在于生长旺盛细胞中，细胞中，nDNA连接酶连接酶分子量约分子量约85KD，主要存在于生长于，主要存在于生长于不活跃的细胞中不活跃的细胞中(resting cell)。 三、三、DNA复制的过程复制的过程nDNA复制过程大致可以分为复制的复制过程大致可以分为复制的引发引发，DNA链的链的延伸延伸和和DNA复制的复制的终止终止三个阶段。三个阶段。n（一）（一）DNADNA复制的引发复制的引发n1 1、前引发过程、前引发过程n（1 1）解开双链：两种方法：）解开双链：两种方法：n螺旋酶在螺旋酶在OriOri处解开双链处解开双链n通过转录激活解开双链通过转录激活解开双链转录激活：转录激活：nRNA聚合酶在聚合酶在Ori处转录一段处转录一段RNA，将双链分开，将双链分开，便于引发体与便于引发体与DNA结合，在先导链模板链上合成结合，在先导链模板链上合成引物引物RNA，这一过程称为转录激活。，这一过程称为转录激活。（2）引发前体（）引发前体（preprimosome)形成形成n单链结合蛋白结合在被解开的双链上。由单链结合蛋白结合在被解开的双链上。由复制因复制因子子X（n蛋白）、蛋白）、Y（n 蛋白）、蛋白）、n 蛋白蛋白、i i蛋蛋白白、dnaBdnaB蛋白蛋白和和dnaCdnaC蛋白六种蛋白质形成引发前蛋白六种蛋白质形成引发前体体, ,并与单链并与单链DNADNA结合，这一过程叫前引发过程。结合，这一过程叫前引发过程。2、引发体（、引发体（primosome)形成形成n引发前体与引发前体与引发酶引发酶(primase)组装成引发组装成引发体。引发体可在体。引发体可在DNA上移动，在上移动，在dnaB亚亚基的作用下，识别基的作用下，识别DNA复制起点位置。复制起点位置。n首先在先导链上合成一段首先在先导链上合成一段RNA引物，然后引物，然后引发体沿引发体沿5 3 方向不断移动，在一段方向不断移动，在一段距离上反复合成引物（距离上反复合成引物（primer)primer)。（二）（二）DNA链的延伸链的延伸nDNA新生链的合成由新生链的合成由DNA聚合酶聚合酶所催化所催化 。nDNA聚合酶聚合酶在引物在引物3 3-OH-OH端连上核苷酸，以端连上核苷酸，以使使DNADNA新链得以延长。新链得以延长。n由由螺旋酶螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。在复制叉处边移动边解开双链。nDNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶要以打开一条链，使正超螺旋要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；而状态转变成松弛状态；而DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶(旋旋转酶转酶) )可以在可以在DNADNA解链前方不停地继续将负超螺解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链旋引入双链DNADNA。 n在在DNA复制叉处由两套复制叉处由两套DNA聚合酶聚合酶在同一时在同一时间分别进行复制间分别进行复制DNA前导链和滞后链。前导链和滞后链。引物的切除：引物的切除：nDNA聚合酶聚合酶I发挥发挥5 3 外切酶活性，外切酶活性，切去引物切去引物RNA并填补空缺（缺刻平移），并填补空缺（缺刻平移），留下的缺刻由留下的缺刻由DNA连接酶连接酶连上。连上。(三三)DNA复制的终止复制的终止nDNA复制在复制终止位点处终止复制在复制终止位点处终止 。n1、环形、环形DNA分子的终止分子的终止n在单向复制的环形在单向复制的环形DNA分子中，复制终止分子中，复制终止也即它的复制起点。在双向复制的环形也即它的复制起点。在双向复制的环形DNA分子中，有的有固定的终点，而大多分子中，有的有固定的终点，而大多数没有固定的终点。数没有固定的终点。2、线性、线性DNA复制的终止复制的终止n由于引物由于引物RNA的水解，两个子代分子中，各有的水解，两个子代分子中，各有一个一个5 端缺少一段核苷酸，而没有一个端缺少一段核苷酸，而没有一个DNA聚合酶能填补。聚合酶能填补。n（1）T7DNA：形成连环分子（：形成连环分子（concatemer)nT7DNA两端各有一段重复的数百个核苷酸，这两端各有一段重复的数百个核苷酸，这叫末端冗余（叫末端冗余（terminal redundancy)。n所以，两个子代所以，两个子代DNA分子中的单链末端可以互分子中的单链末端可以互补，多余的单链部分被补，多余的单链部分被DNAase除去，然后再由除去，然后再由DNA连接酶连接起来形成连环分子。连接酶连接起来形成连环分子。2、线性、线性DNA复制的终止复制的终止n（2） DNA的环化法的环化法n DNA进入宿主细胞内采用环化法，将线性分进入宿主细胞内采用环化法，将线性分子连成环形。子连成环形。n（3）真核细胞）真核细胞DNA末端复制依赖于末端复制依赖于端粒端粒和能够和能够识别或结合端粒的识别或结合端粒的端粒酶端粒酶。n首先在四膜虫中发现。四膜虫端粒中存在一种端首先在四膜虫中发现。四膜虫端粒中存在一种端粒酶（粒酶（telomerase)telomerase)，这种酶能将端粒结构中单，这种酶能将端粒结构中单链尾巴链尾巴5 5 TTGGGG 3 TTGGGG 3延长，延长部分仍是延长，延长部分仍是 5 5 TTGGGG 3TTGGGG 3 。n各种端粒这种富含各种端粒这种富含G G的序列总是突出的序列总是突出12121616个核个核苷酸。苷酸。端粒酶：端粒酶：n端粒酶是一种核蛋白，由端粒酶是一种核蛋白，由RNA和蛋白质构成。和蛋白质构成。n1990年，年，Blackburn等人证明了端粒酶中的等人证明了端粒酶中的RNA是富含是富含G序列的模板。序列的模板。n例如：游仆虫的端粒酶例如：游仆虫的端粒酶RNA含有含有n5 CAAAACCCCAAAACC3 n端粒酶实际上是一种逆转录酶，模板存在于酶分端粒酶实际上是一种逆转录酶，模板存在于酶分子中。子中。n端粒酶中的端粒酶中的RNA可能还有别的作用。可能还有别的作用。n由端粒酶连上的富含由端粒酶连上的富含G的尾巴弯起来，作为引物的尾巴弯起来，作为引物复制以填补复制以填补5 空缺。空缺。四、四、不需要不需要RNA引物的引物的DNA复制复制n有些病毒的基因组是线性有些病毒的基因组是线性DNA，在原核细胞和真，在原核细胞和真核细胞中复制时不需要核细胞中复制时不需要RNA引物引物。 n如：腺病毒如：腺病毒DNA和枯草菌噬菌体和枯草菌噬菌体29DNAn复制从复制从DNA的一端开始，而且对两端无选择性，的一端开始，而且对两端无选择性，各占各占50%的机率。的机率。 n这些这些DNA复制时，从一端开始，只能利用一条复制时，从一端开始，只能利用一条DNA链作为模板，即以链作为模板，即以35链为模板。这样，链为模板。这样，新合成的新合成的DNA链便将原来的亲代链便将原来的亲代DNA链取代。链取代。n原来的亲代原来的亲代DNA链链(从合成起始端看是从合成起始端看是53链链)作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的5和和3可以互补配对，然后在可以互补配对，然后在3端开始以此链为模端开始以此链为模板重新合成另一条子链。板重新合成另一条子链。 第三节第三节RNA的合成的合成n一、一、RNA合成的基本特征：合成的基本特征：n1、 RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸：的前体是四种核糖核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、UTP。 2、RNA链的生长方向是链的生长方向是5 3 ，核，核苷三磷酸加在新生链的苷三磷酸加在新生链的3端，同时除去端，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键，焦磷酸一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键，焦磷酸又分解为无机磷酸，从而推动反应向聚合又分解为无机磷酸，从而推动反应向聚合方向转移。方向转移。 一、一、RNA合成的基本特征：合成的基本特征：n3、 转录必须以一条转录必须以一条DNA链为模板，按照碱链为模板，按照碱基配对原则进行转录，因此基配对原则进行转录，因此DNA中的中的A、G、C、T将分别转录成将分别转录成U、C、G、A。在一个转。在一个转录区内，一般只有一条录区内，一般只有一条DNA链可以转录。链可以转录。n4、 RNA聚合酶能起始一条新链的合成，起聚合酶能起始一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌始的核苷酸一般是嘌呤呤核苷三磷酸，而且将在核苷三磷酸，而且将在RNA链的链的5末端保持这一三磷酸基团。末端保持这一三磷酸基团。二、二、RNA聚合酶聚合酶 n（一）原核生物（一）原核生物RNA聚合酶聚合酶n原核生物原核生物RNA聚合酶聚合酶全酶为全酶为2n全酶可结合约全酶可结合约60个核苷酸，提示其形状应个核苷酸，提示其形状应为椭圆球形。为椭圆球形。n亚基和其他肽链的结合不很牢固。当亚基和其他肽链的结合不很牢固。当亚基脱离全酶后，剩下的亚基脱离全酶后，剩下的 2称为称为核心酶。核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸间磷核心酶本身就能催化核苷酸间磷酸二酯键的形成酸二酯键的形成 。n亚基的功能可能是识别其相应的启动子。亚基的功能可能是识别其相应的启动子。 基因名称基因名称基因图基因图位置位置多肽链多肽链分子量分子量全酶中全酶中的数目的数目功能功能RNA聚合聚合酶的亚基酶的亚基rpoC89.51550001与与DNA结合结合rpoB89.51510001聚合作用的催化位点聚合作用的催化位点 r p oD66.5700001识别启动子，起始识别启动子，起始转录转录 r p oA723 6 5002?1 1 0001?转录因子转录因子rho84.5460006转录终止转录终止nusAnusA65690001转录延长，终止转录延长，终止E.coli RNA聚聚合酶的合酶的亚基和亚基和转录因转录因子子 RNA聚合酶可能的结构：（二）真核生物（二）真核生物RNA聚合酶聚合酶n有三类：有三类：nRNA聚合酶聚合酶，存在于核仁，合成，存在于核仁，合成5.8S 5.8S rRNArRNA、18S rRNA18S rRNA、28S rRNA28S rRNA。n聚合酶聚合酶，存在于核质，合成，存在于核质，合成hnRNAhnRNA（mRNAmRNA的前体）和的前体）和snRNAsnRNA。n聚合酶聚合酶，存在于核质，合成，存在于核质，合成tRNA和和5S rRNA以及转录以及转录Alu顺序。顺序。 三、启动子三、启动子n（一）原核生物的启动子（一）原核生物的启动子n对对100个启动子在转录上游个启动子在转录上游10和和35 处处有两个共同顺序。有两个共同顺序。nPribnow框：框：TATAAT六核苷酸序列称之。六核苷酸序列称之。位于位于10区，是区，是RNA聚合酶牢固结合位点，聚合酶牢固结合位点，简称结合位点。简称结合位点。nSextama框：框：TTGACA六核苷酸序列称之。六核苷酸序列称之。位于位于35区，是区，是RNA聚合酶初始结合位点，聚合酶初始结合位点，RNA聚合酶依靠聚合酶依靠亚基识别该位点，又叫亚基识别该位点，又叫RNARNA聚合酶识别位点聚合酶识别位点Lac CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGfdG2 CTTTTTGATGCAATTCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGACAGGGTAA PL GGCGGGTGTTGACATAAATACCACTTGGCGGTGATACTGAGCACATCA PR GTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTAtRNATyr CGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTTSextama框框pribnow+1T82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T9617bp（二）真核生物的启动子（二）真核生物的启动子n比较了比较了100个启动子，发现真核生物启动子是多个启动子，发现真核生物启动子是多部位结构（部位结构（multipatide)主要有四个部位。主要有四个部位。n1、帽子位点（、帽子位点（cap site)：即转录起始位点。其：即转录起始位点。其碱基大多数是碱基大多数是A（非模板链）两侧各有若干个嘧（非模板链）两侧各有若干个嘧啶核苷酸。啶核苷酸。A为转录起点。为转录起点。n2、TATA框：又称为框：又称为Hogness框。位于框。位于25区附区附近其一致序列为：近其一致序列为：T82A97T93A85A63A83A50，基本基本上都是由上都是由A-T组成。组成。n在在TATA框两侧有富含框两侧有富含G-C碱基对的序列，这是碱基对的序列，这是TATA框发挥重要作用的因素之一。框发挥重要作用的因素之一。（二）真核生物的启动子（二）真核生物的启动子n3、CAAT框：一般位于框：一般位于75区附近。一区附近。一致序列为：致序列为：GGCCAATCT，其头两个，其头两个G的重要性并不亚于的重要性并不亚于CAAT部分。部分。n作用作用：CAAT框控制着转录的频率。框控制着转录的频率。n4、增强子：一般在、增强子：一般在100区以上。单位区以上。单位置较灵活，也可以位于下游或基因内部。置较灵活，也可以位于下游或基因内部。n作用作用：对转录有增强效用：对转录有增强效用 四、转录过程四、转录过程n转录的基本过程转录的基本过程 无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别模板识别 转录起始转录起始 通过启动子通过启动子 转录的延伸和终止。转录的延伸和终止。四、转录过程四、转录过程n（一）（一）RNA合成的合成的起始和延伸起始和延伸1、二元复合物的形成、二元复合物的形成（只有全酶和只有全酶和DNA）n（1）封闭的启动子）封闭的启动子复合物复合物n（2）开放性启动子）开放性启动子复合物复合物2、三元复合物的形成、三元复合物的形成（全酶（全酶DNARNA）RNA合成起始合成起始大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区聚合酶全酶所识别的启动子区RNA合成的延伸合成的延伸由于基因转录所引起的由于基因转录所引起的DNA超螺旋结构变化超螺旋结构变化（二）（二）RNA合成的终止合成的终止n转录终止信号存在于已转录的序列中。这转录终止信号存在于已转录的序列中。这种提供终止信号的序列称为终止子种提供终止信号的序列称为终止子（terminator)。n终止子有两类：终止子有两类：n（1）依赖于蛋白质辅助因子才能实现终）依赖于蛋白质辅助因子才能实现终止作用，这种蛋白子因子称为释放因子，止作用，这种蛋白子因子称为释放因子，通常又称为通常又称为 因子。因子。n（2）不依赖蛋白质辅助因子就能实现终）不依赖蛋白质辅助因子就能实现终止作用。止作用。1、不依赖、不依赖 因子的终止子的特点：因子的终止子的特点：（1）在终止点前）在终止点前有一段反向重复有一段反向重复序列序列（2）方向重复序）方向重复序列中富含列中富含G-C碱碱基对基对（3）在反向重复）在反向重复序列下游有序列下游有68个个A-T对对2、依赖、依赖 的终止子的特点：的终止子的特点：（1）在终止点前有）在终止点前有一段反向重复序一段反向重复序列列（2）方向重复序列）方向重复序列中中G-C含量较少含量较少（3）方向重复序列）方向重复序列下游的序列没有下游的序列没有固定特征，其固定特征，其A-T含量较前者低。含量较前者低。终止子终止转录的机制：终止子终止转录的机制：n1、不依赖、不依赖 因子：（因子：（1）富含）富含G-C对之对之后后810碱基处，转录会出现跌宕。碱基处，转录会出现跌宕。n（2）反向重复序列形成发夹结构之后，）反向重复序列形成发夹结构之后，阻碍了阻碍了RNA链从三元复合物中释放出来，链从三元复合物中释放出来，使延宕时间延长。使延宕时间延长。n（3）一连串）一连串A转录出一连串转录出一连串Un2、依赖、依赖 因子：（因子：（1）G-C含量低，（含量低，（2）发夹结构缺乏发夹结构缺乏U，所以只有，所以只有 因子可终止因子可终止转录。转录。五、转录后加工五、转录后加工n（一）转录产物的修饰（一）转录产物的修饰n1、帽子帽子n2、多聚（、多聚（A）尾巴）尾巴真核生物真核生物mRNA的帽子结构的帽子结构（二）转录产物的剪接（二）转录产物的剪接n1、rRNA的剪接的剪接n（1）E.coli的三种的三种rRNA：5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA与与tRNA基因混杂，基因混杂，需要剪切。需要剪切。n（2）真核生物）真核生物rRNAn人人rRNA转录初产物为转录初产物为45S，经过剪切成，经过剪切成为为18SrRNA、28SrRNA、5.8SrRNA。n2、tRNA的剪接的剪接n（1）E.coli tRNA转录单位是多基因的需转录单位是多基因的需要剪切要剪切n（2）真核生物酵母约）真核生物酵母约400个核个核tRNA基因，基因，有约有约40个基因中含有内含子，内含子长个基因中含有内含子，内含子长1446bp。需要切除内含子。需要切除内含子。n3、hnRNA切除内含子切除内含子n内含子内含子5 3 的拼接点序列为：的拼接点序列为：GUAG。 snRNA参与了识别拼接点的参与了识别拼接点的作用。作用。真核生物真核生物hnRNA内含内含子剪切示意子剪切示意图图第四节第四节 蛋白质的合成蛋白质的合成n蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。n遗传密码遗传密码三联子三联子n所谓所谓翻译翻译是指将是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。这酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。这3个个核苷酸就是一个核苷酸就是一个密码子密码子。n翻译从起始密码子翻译从起始密码子AUG开始，沿开始，沿mRNA 53 方方向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成一条具有特定序列的多肽链一条具有特定序列的多肽链蛋白质。蛋白质。Crick关于关于tRNA分子破译分子破译mRNA遗传密码三联遗传密码三联子的原始构想子的原始构想n三联子密码及其破译三联子密码及其破译n因为因为mRNA中只有中只有4种核苷酸，而蛋白质中有种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸，以一种核苷酸代表一种氨基酸是不可种氨基酸，以一种核苷酸代表一种氨基酸是不可能的。若以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码能的。若以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码（二联子），它们能代表的氨基酸也只有（二联子），它们能代表的氨基酸也只有42=16种。若以种。若以3个核苷酸代表一个氨基酸，有个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种种密码子，满足了编码密码子，满足了编码20种氨基酸的需要。种氨基酸的需要。用核苷酸的插入或删除实验证明用核苷酸的插入或删除实验证明mRNA模板上每三个核模板上每三个核苷酸组成一个密码子苷酸组成一个密码子n遗传密码的性质遗传密码的性质n1. 密码的简并性密码的简并性 4种核苷酸可组成种核苷酸可组成64个密码子，现在已经知道其个密码子，现在已经知道其中中61个是编码氨基酸的密码子，另外个是编码氨基酸的密码子，另外3个即个即UAA、UGA和和UAG并不代表任何氨基酸，它们是终止密并不代表任何氨基酸，它们是终止密码子，不能与码子，不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。因子或释放因子识别，终止肽链的合成。通用遗传密码及相应的氨基酸通用遗传密码及相应的氨基酸nC亮氨酸（亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）组）组氨酸（氨酸（His，H）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）U亮氨亮氨酸（酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）组氨酸）组氨酸（His，H）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）C亮氨酸亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺）谷氨酰胺（Gln，Q）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）A亮氨酸亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺）谷氨酰胺（Gln，Q）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）GnA异亮氨酸（异亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）天）天冬酰胺（冬酰胺（Asn，N）丝氨酸（）丝氨酸（Ser，S）U异异亮氨酸（亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）天冬酰）天冬酰胺（胺（Asn，N）丝氨酸（）丝氨酸（Ser，S）C异亮氨异亮氨酸（酸（Ile，I）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）赖氨酸）赖氨酸（Lys，K）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）A甲硫氨酸甲硫氨酸（Met，M）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）赖氨酸）赖氨酸（Lys，K）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）GnG缬氨酸（缬氨酸（Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）天）天冬氨酸（冬氨酸（Asn，N）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）U缬缬氨酸（氨酸（Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）天冬氨）天冬氨酸（酸（Asn，N）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）C缬氨酸缬氨酸（Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（）谷氨酸（Glu，E）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）A缬氨酸（缬氨酸（Val，V）丙氨酸（丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（）谷氨酸（Glu，E）甘氨）甘氨酸（酸（Gly，G）Gn除色氨酸（除色氨酸（UGG）只有一个密码子外，其他氨基）只有一个密码子外，其他氨基酸都有一个以上的密码子。酸都有一个以上的密码子。9种氨基酸有种氨基酸有2个密码个密码子，子，1种氨基酸有种氨基酸有3个密码子，个密码子，5种氨基酸有种氨基酸有4个密个密码子，码子，3种氨基酸有种氨基酸有6个密码子。个密码子。n由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码），对应于同一氨基酸的密码子称为子称为同义密码子同义密码子（synonymous codon）。）。nAUG和和GUG既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是起始密码子起始密码子。 密码子的兼并性密码子的兼并性n3. 密码子与反密码子的相互作用密码子与反密码子的相互作用tRNA的反密码的反密码子在核糖体内是通过碱基的反向配对与子在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA上上的密码子相互作用的。的密码子相互作用的。1966年，年，Crick提出提出摆动摆动假说假说（wobble hypothesis），），解释了反密码子解释了反密码子中某些稀有成分（如中某些稀有成分（如I）的配对，以及许多氨基酸）的配对，以及许多氨基酸有有2个以上密码子的问题。个以上密码子的问题。n mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子配对示意图。na. 密码子与tRNA反密码子臂上相应序列配对；nb. 当反密码子第一位是I时，密码子第三位可以是A、U或C。ntRNAtRNAntRNAtRNA不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体，所以，它又被称为载体，所以，它又被称为第二遗传密码第二遗传密码。n不同不同tRNAtRNA在结构上存在大量的共性，由小片段碱基互补配在结构上存在大量的共性，由小片段碱基互补配对形成对形成三叶草形分子结构三叶草形分子结构，有，有4 4条根据结构或已知功能命条根据结构或已知功能命名的手臂。名的手臂。n最常见最常见tRNA分子有分子有76个碱基，相对分子质量约为个碱基，相对分子质量约为2.5104，不同的，不同的tRNA分子可有分子可有7495个核苷酸不等。个核苷酸不等。nD臂臂中存在多至中存在多至3个可变核苷酸位个可变核苷酸位点，点，17：1及及20：1、20：2。最常。最常见的见的D臂缺失这臂缺失这3个核苷酸，而最个核苷酸，而最小的小的D臂中第臂中第17位核苷酸也缺失了。位核苷酸也缺失了。 D臂是根据它含有二氢尿嘧啶臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。）命名的。n受体臂受体臂（acceptor arm）由链两端）由链两端序列配对形成的杆状结构和序列配对形成的杆状结构和3端未端未配对的配对的34个碱基所组成，其个碱基所组成，其3端端的最后的最后3个碱基序列永远是个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的最后一个碱基的3或或2自由羟基自由羟基（OH）可以被氨酰化。）可以被氨酰化。nTC臂是根据臂是根据3个核苷酸命名的，个核苷酸命名的，其中其中表示拟尿嘧啶；表示拟尿嘧啶；n反密码子臂反密码子臂是根据位于套索中央的是根据位于套索中央的三联反密码子命名的；三联反密码子命名的；酵母酵母tRNAphe的三级结构示意图（根据的三级结构示意图（根据X-射线衍射数据绘射线衍射数据绘制）。制）。a和和b表示用不同方法构建的模型。表示用不同方法构建的模型。ntRNA的功能的功能n只有只有tRNA上的反密码子能与上的反密码子能与mRNA上的密码子相互识别并配上的密码子相互识别并配对对，而氨基酸本身不能识别密码子，而氨基酸本身不能识别密码子，只有结合到只有结合到tRNA上生成上生成AA-tRNA，才能被带到，才能被带到mRNA-核糖体复合物上，插入到正在核糖体复合物上，插入到正在合成的多肽链的适当位置上合成的多肽链的适当位置上。n用用14C标记的半胱氨酸与标记的半胱氨酸与tRNACys结合后生成结合后生成14C-半胱氨酸半胱氨酸-tRNACys，经，经Ni催化可生成催化可生成14C-Ala-tRNACys，再把，再把14C-Ala-tRNACys加入到蛋白质合成系统中，发现加入到蛋白质合成系统中，发现14C-Ala-tRNACys插入了血红蛋白分子中通常由半胱氨酸占据的位置插入了血红蛋白分子中通常由半胱氨酸占据的位置上，表明起识别作用的是上，表明起识别作用的是tRNA。n AA-tRNA合成酶合成酶nAA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的结合的特异性酶，其反应式如下：特异性酶，其反应式如下： AA+tRNA+ATPAA-tRNA+AMP+PPi 它实际上包括两步反应：它实际上包括两步反应： 第一步是氨基酸活化生成酶第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。氨基酰腺苷酸复合物。 AA+ATP+酶（酶（E）E-AA-AMP+PPi 第二步是氨酰基转移到第二步是氨酰基转移到tRNA 3 末端腺苷残基的末端腺苷残基的2 或或3-羟基上。羟基上。 E-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+E+AMPn 核糖体核糖体n核糖体是由几十种蛋白质和多种核糖体核糖体是由几十种蛋白质和多种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）所组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约）所组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有有20 000个核糖体，而真核细胞内可达个核糖体，而真核细胞内可达106个。这些颗粒个。这些颗粒既可以既可以游离状态游离状态存在于细胞内，也可存在于细胞内，也可与内质网结合与内质网结合，形成，形成微粒体。微粒体。n核糖体蛋白约占原核细胞总蛋白量的核糖体蛋白约占原核细胞总蛋白量的9-10%，占细胞内总，占细胞内总RNA量的量的70-80%。在真核细胞内，核糖体所占的比重虽。在真核细胞内，核糖体所占的比重虽然有所下降，但仍然占总然有所下降，但仍然占总RNA的绝大部分，是细胞总蛋白的绝大部分，是细胞总蛋白的一个重要组成部分。的一个重要组成部分。n真核生物中，所有正在进行蛋白质合成的核糖体都不是在细胞真核生物中，所有正在进行蛋白质合成的核糖体都不是在细胞质内自由漂浮，而是直接或间接与细胞骨架结构有关联或者与质内自由漂浮，而是直接或间接与细胞骨架结构有关联或者与内质网膜结构相连的。内质网膜结构相连的。n细菌核糖体大都通过与细菌核糖体大都通过与mRNA相互作用，被固定在核基因组上。相互作用，被固定在核基因组上。n核糖体的结构核糖体的结构n核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可解离为核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。和许多不同的蛋白质分子。n原核生物核糖体由约原核生物核糖体由约2/3的的RNA及及1/3的蛋白质组的蛋白质组成。真核生物核糖体中成。真核生物核糖体中RNA占占3/5，蛋白质占，蛋白质占2/5。原核生物、真核生物细胞质及细胞器中的核糖体原核生物、真核生物细胞质及细胞器中的核糖体存在着很大差异。存在着很大差异。几种不同生物核糖体及rRNA的组成n大肠杆菌核糖体小亚基大肠杆菌核糖体小亚基由由21种蛋白质种蛋白质组成，分组成，分别用别用S1S21表示，表示，大亚基大亚基由由36种蛋白质种蛋白质组组成，分别用成，分别用L1L36表示。表示。n真核生物细胞核糖体蛋真核生物细胞核糖体蛋白质白质中，中，大亚基大亚基含有含有49种蛋白质种蛋白质，小亚基小亚基有有33种蛋白质种蛋白质，它们的相对，它们的相对分子质量在分子质量在81034.0104之间之间。核糖体结构模型及原核与真核细胞核糖体大小亚基比较真核生物细胞中发现的多聚核糖体现象n核糖体分子中可容纳两个tRNA和约40bp长的mRNA。n核糖体的功能核糖体的功能n核糖体上至少有核糖体上至少有5个活性中心个活性中心，即，即mRNA结合部位结合部位、结合或接、结合或接受受AA-tRNA部位部位（A位）、结合或接受位）、结合或接受肽基肽基tRNA的部位、肽的部位、肽基转移部位（基转移部位（P位）位）及及形成肽键的部位形成肽键的部位（转肽酶中心）。此（转肽酶中心）。此外，还应有负责外，还应有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。n核糖体小亚基负责对模板核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，大亚进行序列特异性识别，大亚基负责携带氨基酸及基负责携带氨基酸及tRNA的功能，肽键的形成、的功能，肽键的形成、AA-tRNA、肽基肽基-tRNA的结合等，的结合等，A位、位、P位、转肽酶中心等主要在大亚位、转肽酶中心等主要在大亚基上。基上。n 蛋白质合成的生物学机制蛋白质合成的生物学机制n核糖体是蛋白质合成的场所，核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合是蛋白质合成的模板，转移成的模板，转移RNA是模板与氨基酸之间的接合是模板与氨基酸之间的接合体。体。蛋白质合成是一个需能反应蛋白质合成是一个需能反应。真核生物中可。真核生物中可能有近能有近300种生物大分子参与蛋白质的生物合成，种生物大分子参与蛋白质的生物合成，这些组分约占细胞干重的这些组分约占细胞干重的35%。n细胞用来进行合成代谢总能量的细胞用来进行合成代谢总能量的90%消耗在蛋白消耗在蛋白质合成过程中。大肠杆菌只需要质合成过程中。大肠杆菌只需要5-6秒钟就能合成秒钟就能合成一条由一条由100个氨基酸组成的多肽。个氨基酸组成的多肽。蛋白质的生物蛋白质的生物合成包括氨基酸活化、肽链的起始、延伸、终止合成包括氨基酸活化、肽链的起始、延伸、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。以及新合成多肽链的折叠和加工。 蛋白质合成各阶段的主要成分简表蛋白质合成各阶段的主要成分简表n氨基酸的活化氨基酸的活化n蛋白质合成的起始是指在模板蛋白质合成的起始是指在模板mRNA编码区编码区5端形成核糖体端形成核糖体-mRNA-起始起始tRNA复合物并将甲酰甲硫氨酸放入核糖体复合物并将甲酰甲硫氨酸放入核糖体P位位点。点。n原核生物中原核生物中30S小亚基首先与小亚基首先与mRNA模板相结合，再与模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与结合，最后与50S大亚基结合。大亚基结合。n真核生物中，真核生物中，40S小亚基首先与小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与相结合，再与模板模板mRNA结合，最后与结合，最后与60S大亚基结合生成大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物。起始复合物。n起始复合物的生成除了起始复合物的生成除了GTP外，还需要外，还需要Mg2+、NH4+及及3个起个起始因子（始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。）。n翻译的起始翻译的起始 翻译起始复合物的形成翻译起始复合物的形成n第一步，第一步，30S小亚基与翻译起始小亚基与翻译起始因子因子IF-1，IF-3结合，通过结合，通过SD序序列与列与mRNA模板相结合模板相结合。n第二步，第二步，fMet-tRNAfMet在在IF-2的协同下进入小亚基的的协同下进入小亚基的P位位，tRNA上的反密码子与上的反密码子与mRNA上上的起始密码子配对。的起始密码子配对。n第三步，带有第三步，带有tRNA、mRNA、三个翻译起始因子的小亚基复合三个翻译起始因子的小亚基复合物物与与50S大亚基结合，释放翻译大亚基结合，释放翻译起始因子起始因子。 真核生物翻译起始复合物的形成n肽链的延伸肽链的延伸n生成起始复合物，第一个氨基酸（生成起始复合物，第一个氨基酸（fMet/Met-tRNA）与核）与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽肽链延伸中的每个循环都包括链延伸中的每个循环都包括AA-tRNA与核糖体结合、肽与核糖体结合、肽键的生成键的生成和和移位移位三步。三步。多肽链上肽键的形成缩合反应n1后续后续AA-tRNA与核糖体结合与核糖体结合n细菌中肽链延伸的第一步反应：第二细菌中肽链延伸的第一步反应：第二个氨基酰个氨基酰-tRNA的结合。的结合。 该该氨基酰氨基酰-tRNA首先与首先与EF-Tu GTP形成复合物，进入核糖体的形成复合物，进入核糖体的A位位，水，水解产生解产生GDP并在并在EF-Ts的作用下释放的作用下释放GD