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一. 氨基酸1八种必须氨基酸的英文命名及缩写。赖氨酸 Lysi ne Lys K甲硫氨酸 Methio nine Met M缬氨酸 vali ne Vai V异亮氨酸 isoleuc ine Ile I苯丙氨酸 phe nylanine Phe F亮氨酸 leuc ine Leu L色氨酸 tryptopha n Try W苏氨酸 thre onine thr T2俩种氨基酸组成多肽时，有几种？成二肽，有四种成三肽时，有八种(仅供参考，不一定正确，有不同意见请指出来) 二酶分析1酶活性的定义，国际常用的单位：酶活性(enzyme activity )也称为酶活力，指酶促反应速率, 即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。酶活性单位：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间 内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。a .国际单位IU (卩mol/min )mol定义：在规定条件下(25C及其他最适条件)，每分钟催化1卩底物转变为产物的酶量，为 1IU或1U 1IU=1卩mol/min。B. Katal 单位（mol/s ）定义：IKatal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量。IKatal = 1mol/s。IU 与 Katal 单位的关系：Ikatal = 60 x 106IU,1IU = 16.67 nkatal3酶促反应酶促反应的历程：延滞期，线性期，非线性期a.酶促反应式：k血3心E + S * ES吃 +酶 底物酶届物复合物酶产物*B.米氏方程v =_-_ A 4J +刃C. Km的含义与意义V maxv =.Km的含义：当Km二S时，2 可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vma一半时的底物浓度。Km的意义：Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关反映酶对底物亲和力的大小选择酶的最适底物或天然底物计算不同底物浓度时的反应程度鉴别酶的种类判断可逆反应的速率判断酶偶联反应的限速反应计算工具酶的用量3. 两种测定酶活性的方法：a.定时法原理：定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1t2 ）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。 该方 法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等终 止反应。优点：简单、不需要保温设备、不用考虑酶的活性。缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2 ）是 否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。b.连续检测法：原理：连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线 性期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法， 又称速率法、零级反应速率法、斜率法。该方法是在一定的反应时间区段内（至少 9120s）每隔一定时 间（常为230s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少 4点）, 然后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位 时间内的反应速率 A/min，最后计算出酶活性。VTutu连续监测法的特点：属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添 加其他呈色试剂，可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶 促反应进程，很容易找到呈直线的线性期；连续监测法要求不显色而是直接测定底物 （或辅助底物即中间底 物）或产物量的变化，因此，可以选择紫外吸收法或生色原显色法； 能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温 装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要 求；测定结果常较定时法高。4. 固定化酶和游离酶的优点和缺点：a. 固定化酶优点：增加了酶的活性和稳定性可回收重复使用，降低了酶耗酶反应过程便于控制适用于连续反应易于反应体系分离对环境的耐受性增强缺点：对酶的物理化学性质产生一定的影响。b. 游离酶优点：易溶于水于底物的作用面积大，反应充分活性接近生理状态缺点：难与底物分离反应条件控制严格不能反复利用，易失活三.蛋白质分析1. 蛋白质的盐析，变性及二者的区别盐析：在蛋白质溶液中加入某些无机盐的浓溶液，使蛋白质的 溶解度下降而从溶液中析出来的现象。变性：在热、重金属、酸、碱、某些有机物等作用下，蛋白质的物理性质和生理功能发生改变的现象，称为蛋白质的变性。蛋白质盐析和变性的区别与对比1 第 定JHnI是出T ft体本皿 A tt 可8 搐一 “/JN4 g不 一ft 免痰原要求免疫原純度高，毓偉 纯度才能商不纯的免疫原可以东闱高呢號抗体产主細胞家克隆性单克隆性均质性高度异质高度纯质特异性较高，与抗扁上辛种决 定旗结舍髙.与抗原上特定决定熊詰合権定性_较好栩对较嘩对理化条件战黛标准化较难，不同批次的抗体慣 量差异大易于标准化，弛次间醴异小交叉反应很常见.帝遐免非特昇性 反应不常见+可避免非特异反应沅淀反应有密9投有实用的血清学试鉴大霉数血清学试验一种或多神，需适当选择供应量有限无醍0.1-0.3 mgml卜邕腹 4C2.0-30 mg/ml无效【耳含量10.0-15.0 mg ml体外晤养一-般没有.小鼠腹水0.S5.0 mg ml其它血清蛋白存在体外培养可能肓少童小半血淸 蛋白.小魁惶水有少昼采蛋白6. 设计合适的方案检测生活中的小分子有机物。五，核酸（DNA和RNA1. DNA是双螺旋结构，RNA是单链的!DNA:A-TGCRNA: A-UG-C2. PCR的意义和简单操作流程意义：PCR（Polymerase chain reaction） 是用一对寡聚 DNA 作为引物，通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环， 使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累 的，经25 -30个循环后，扩增倍数可达106.流程：（一）原理双链DNA通过高温变性解离成互补单链 DNA变性与一对寡核苷酸引物（5 3 降低温度退火DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火适温延伸5 /3 引物形成新链变成4条链DNA延第二轮：变性一退火一延伸呈指数增长理论值:轮倍103轮 10 =1000倍20轮10 630轮10 9理论模板扩增30轮1ng-1g实际模板扩增30轮1ng-10 模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板 DNA双链或经 PCRT增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合， 为下轮反应作准备； 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 55C左右，引物与模 板DNA单链的互补序列配对结合； DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一一 条新的与模板DNA链.每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩 增放大几百万倍.3. DNA测序的俩种方法基本原理：a. sanger双脱氧链终止法：引入了双脱氧核苷三磷酸(2 ,3 -ddNTP)作为链终止剂；2 ,3 -ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的 3位 又少了个羟基。它可以在 DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的 3羟 基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核 苷酸链的延伸终止；在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的dNTP#，再加入一种 少量的ddNTP反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。在 4组独 立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP结果将生成4组 核苷酸链，它们将分别终止于每一个 A,每一个G,每一个C,每一 个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 就可读 出序列.b. Gillbert 化学裂解法：将DNA片段的5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5端被标 记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离， 再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列.4. 分子印记的原理和流程：(一) Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通 过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位 置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或 RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的 片段及其相对大小.DNA脂糖电泳印迹转移 十 预杂交+ 杂交（变性探针） *洗膜 “放射自显影或显 色用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态，如是 否有点突变、扩增重排等.（二） Northern Blot原理：在变性条件下将待检的rnA羊品进行琼脂糖凝胶电泳， 继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检 测.操作过程mRNA 提取 亠甲醛变性电泳 * 印迹转移* 预杂交 -杂交（变性探针） 亠洗膜 亠放射自显影或化学 发光。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物 （mRN）及其含量。 六生物大分子。1俩种分离纯化蛋白质的方法：a。反向高效液相色谱 蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH -NH -COOH SH等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3 -CH2和-CH等）. 不同的蛋白质在相同流动相中由于疏水基团多少、种类以及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到分离. 结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋白质 就容易被洗脱.其分离蛋白质和酶等生物大分子具有速度快、分离性能好，重复 性好，溶剂和流动相易除去等优点.在所有的液相色谱法中反相 色谱的分离性能.缺点是很多蛋白质或酶在分离过程中失活，而且回收的样品中总含有有机溶剂.b.凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶 把分子大小不同的物质分离开的一种方法.其机理是分子筛效应。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛” 一样，因分子大小的不同得 以彼此分开.它具有分离条件温和，产品收率高，生物活性好，分离面宽 等优点，广泛用于蛋白质或多肽物质的分离纯化中.2. 核酸的分离纯化方法：a.沉淀法：沉淀是浓缩核酸最常用的方法.优点：改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质.当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它 与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解， 也不会被有 机溶剂变性.常用的盐盐贮存液浓度终浓度(mol/L)MgCl210,01NaAc3 (pH5.2)03KAc3 (pH5.2)03NH4Ac102.5NaClP50.2IJCIS0.8常用的有机溶剂：乙醇，异丙醇，聚乙二醇(PEG,c. 精胺精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀 DNA.原理是：精胺与DNA吉合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与 DNA分开，达到纯化DNA勺目的.一般核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验.般使用0C冰水，10-15min , DNA样品足可达到实验要 求.C.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE凝胶是由丙烯酰胺聚合而成；样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离的主要依据；聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对 pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电 泳支持介质.分类：1、变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链DNA片段的分离或纯化。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完 全无关。用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链DNA片段的分离和纯化注：迁移率受其碱基组成和序列的影响用途：制备高纯度的DNA片段
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