麻疹和风疹病毒感染的实验室诊断手册第二版翻译终稿

麻疹和风疹病毒感染的实验室诊断手册第二版国家麻疹实验室译2008年本手册为世界卫生组织疫苗和生物制品部制定的麻疹和风疹病毒感染的实验室诊断手册2007年8月第二版的中文译本。由WHO西太平洋地区级参比实验室/国家级麻疹实验室翻译，是麻疹/风疹实验室网络的工具书之一，对于我国麻疹/风疹的实验室和流行病学监测工作具有重要的参考价值。英文原版可以从以下链接获得：www.who.int/vaccines-documents/翻译：张燕，毛乃颖，朱贞，姬奕昕，崔爱利，许松涛校对：许文波目录缩略语 .v1. 目的 . 12. 引言 . 12.1 全球麻疹和风疹疾病负担 . 12.2 麻疹 . 32.3 风疹 . 82.4 WHO 全球麻疹控制和CRS预防策略. 143. 实验室网络在麻疹控制和CRS预防中的作用和功能.183.1 实验室网络在麻疹和风疹监测中的作用. 183.2 实验室网络在麻疹和风疹监测中的角色和功能.193.3 网络实验室的协调 . 223.4 分子流行病学和基因分型. 224. 标本的采集，运输，接收和处理. 304.1 标本资料的收集. 324.2 用于抗体检测的血清学标本. 324.3 用于病毒分离的标本. 354.4 用于RT-PCR的标本. 384.5 替代标本的采样方法（干血标本和口腔含漱液）. 384.6 接收标本的一般安全预防措施. 405. 麻疹/风疹的实验室诊断. 415.1 IgM抗体检测法. 425.2 IgG抗体检测法. 475.3 RT-PCR . 48 5.4 病毒分离. 486. 资料管理和上报. 496.1 资料管理的目的. 506.2 记录接收的标本. 526.3 结果记录. 536.4 报告实验室工作和结果.537. 标本和毒株安全运输. 547.1 运输计划. 547.2 运输物品的包装. 557.3 准备工作和运送. 568. 实验室网络的质量保证. 578.1 实验室质量保证系统的建立. 578.2 标准化操作规程（SOPs）. 608.3 记录 . 618.4 设备和仪器. 618.5 供应 . 628.6 实验室安全. 638.7 年度认证. 649. 附件. 669.1 麻疹和风疹实验室调查表格示例. 669.2 从干血片提取麻疹特异性IgM抗体和应用Dade Behring麻疹IgM抗体间接检测法进行检测（接39）. 689.3 麻疹和风疹血清学实验质量控制和问题检查. 709.4 分离和鉴别麻疹风疹病毒. 759.5 标本和病毒分离物的运输包装. 939.6 试剂成份. 9610. 建议进一步阅读的文献资料 .9810.1 全球麻疹和风疹的影响. 9810.2 控制策略 . 9810.3 实验室. 9910.4 实验室安全和运输 . 10111. 参考文献 .102 手册列图图 1: 报告的全球麻疹发病率. 2图 2: 典型麻疹的临床特征- 疾病出疹起的时间过程. 4图 3: 急性麻疹感染的免疫应答. 5图 4: 麻疹病毒毒粒和基因组结构示意图. 6图 5: 典型风疹病毒感染的临床特征疾病发生的时间进程. 10图6: 典型风疹病毒感染的免疫反应. 11图 7: 风疹病毒颗粒及其基因组结构图（E1和E2糖蛋白以二聚体形式存在） . 12图 8: 2004年使用风疹疫苗进行常规免疫的国家. 17图 9: 在麻疹监测活动中不同水平上的麻疹风疹实验室网络. 21图 10: WHO各区麻疹基因型的全球分布1995-2006. 27图 11: 1995-2005年全球风疹病毒基因型分布. 30图 12: 血清标本的包装A -密封袋或盒中的单个标本包装B -多个标本放入绝热容器中包装. 35图 13: 血片收集卡格式示例. 39图 14: 捕获法ELISA原理图. 42图 15: 间接法ELISA原理图. 43图16: 麻疹/风疹IgM抗体检测策略. 45图 17: A显示Vero/SLAM细胞上的麻疹病变。左上角为未感染病毒的正常细胞；其他为麻疹野毒株细胞病变的进展（1+到4+的细胞病变进展）. 79图 18: 两种不同的免疫测定法检测风疹病毒：免疫荧光法（上图，感染风疹病毒和未感染对照），比色法（下图，感染风疹病毒和未感染对照）. 80手册列表表 1: 没有并发症的首次感染麻疹病毒的过程. 4表 2: 典型风疹病毒感染的临床特征疾病发生的时间进程. 9表 3: 1999-2004年不同地区估计麻疹死亡数和降低的比例. 15表 4: 麻疹/风疹控制和消除阶段中实验室的作用. 18表 5: 用于麻疹野毒株基因特征分析的参考株. 24表 6: 用于风疹野毒株基因分型的参考毒株. 29表 7: 麻疹不同控制期对麻疹和风疹血清学和病毒检测的最小需求. 31表 8: 不同温度和气压条件下的水密度. 74缩略语mg miligram 毫克g microgram 微克l microlitre 微升B95a Epstein-Barr virus-transformed, marmoset B lymphoblastoid cell line EB病毒转染的绒猴B淋巴母细胞BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白BSC biological safety cabinet 生物安全柜BSL biological safety level 生物安全水平CDC Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta USA 疾病预防控制中心，亚特兰大，美国cDNA complementary DNA 互补DNACO2 carbon dioxide 二氧化碳CPE cytopathic effect 致细胞病变效应CRI congenital rubella infection 先天性风疹感染CRS congenital rubella syndrome 先天性风疹综合症DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸DMEM Dulbeccos Minimal Essential Medium DMEM培养基DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜EIA enzyme immunoassay 酶联免疫实验ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附实验EPI Expanded Programme on Immunization 扩大计划免疫FBS foetal bovine serum 胎牛血清FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素G relative centrifugal force 相对离心力g gram 克GAVI Global Alliance for Vaccines and Immunization 全球疫苗免疫联盟GSL Global Specialized Laboratory 全球专项实验室HPA Health Protection Agency, London UK 健康防护局，伦敦UKIATA International Air Transport Association 国际空运协会ICAO International Civil Aviation Organization 国际民航组织IgA Immunoglobulin class A 免疫球蛋白AIgG Immunoglobulin class G 免疫球蛋白GIgM Immunoglobulin class M 免疫球蛋白MIFA immunofluorescence assay 免疫荧光实验IVB Department of Immunization, Vaccines and Biologicals 免疫、疫苗、生物部kPa kilopascals 千帕LQA laboratory quality assurance 实验室质量保证LSM Lymphocyte Separation Medium 淋巴细胞分离液MEM minimal essential medium 最基本必需培养基mg milligram 毫克ml milliliter 毫升MM maintenance medium 维持液MR measles rubella combination vaccine 麻疹风疹二联疫苗MMR measles mumps rubella combination vaccine 麻疹风疹腮腺炎三联疫苗NL National Laboratory 国家实验室nm nanometer 纳米OD optical density 吸光度PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液PBMC peripheral blood mononuclear cells 外周血单核细胞PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应PT proficiency test 职能测试QC quality control 质量控制RF rheumatoid factor 类风湿因子RNA ribonucleic acid 核糖核酸RNase ribonuclease 核糖核酸酶RPM revolutions per minute 每分钟转速RRL Regional Reference Laboratory 地区参比实验室RT reverse transcription 反转录RT-PCR reverse transcription - polymerase chain reaction 反转录聚合酶链式反应SIAs supplemental immunization activities 补充免疫活动SLAM signaling lymphocyte-activation molecule; also known as CDw150 信号淋巴激活分子，也称作CDw150SNL Sub-National Laboratory 亚国家实验室SOP standard operating procedure 标准操作规程TMB 3,35,5-tetramethylbenzidine 3,35,5四甲基联苯胺UNICEF United Nations Childrens Fund 联合国儿童基金会V&B Department of Vaccines and Biologicals (now named IVB, see above)疫苗和生物部（现在称IVB，见上）Vero cells continuous cell line derived from African green monkey kidney 传代细胞系，来自于非洲绿猴肾Vero/SLAM Vero cells transfected to express the human SLAM molecule 转染表达人SLAM分子的Vero细胞VTM viral transport medium 病毒运输液WHA World Health Assembly 世界卫生联盟WHO World Health Organization 世界卫生组织1111. 目的此操作手册的目的是通过以下几点来加强麻疹控制和预防先天性风疹感染：l 提供关于病原体、疾病、免疫反应和预防策略等方面的准确信息。l 讨论实验室在疾病预防和控制中的作用。l 概述进行有效实验室监测工作的要求。l 详述推荐使用的实验室诊断麻疹和风疹病毒感染的操作规程。概述麻疹和风疹野毒株的基因定型的实验室规程。本手册适用于承担麻疹和风疹控制及消除任务的实验室病毒学专家和技术专家。参加麻疹控制项目和先天性风疹感染项目相关领域的管理者和工作人员，恰当地使用本书可正确评价实验室的作用，从而更好的管理麻疹风疹控制规划。截至2005年1月，4个WHO区设立了麻疹消除的目标（美洲区，欧洲区，东地中海地区和西太区）；2个区已经设立了风疹消除或大大降低风疹发病率的目标（分别是美洲区和欧洲区）；剩下的2个WHO区（非洲区和东南亚地区）已经建立了降低麻疹死亡率的目标。而在当时，大概有60的国家和地区报告给WHO已经在常规免疫接种规程中引入了风疹疫苗，通常是麻风腮三联疫苗（MMR）。麻疹和风疹监测工作的一体化，尤其在实验室证实感染方面，在多数情况下是合理而经济有效的方案，而本手册对于麻疹风疹监测一体化提供了参考方法。WHO各区成员国中还没有设立风疹控制目标的，以及还没有在常规免疫接种项目中使用风疹疫苗的，应该向WHO地区办公室和地区实验室协调员寻求特定的监测和风疹感染实验室证实方面的推荐方案。2. 引言 2.1 全球麻疹和风疹的疾病负担在1960年引入麻疹疫苗之前，几乎每个人对麻疹都易感，尤其是儿童。每年估计有1亿3千万病例和超过250万的死亡病例是由麻疹引起的（主要是儿童）1。尽管40多年来有安全有效、相对便宜的疫苗，但是在疫苗可预防疾病中麻疹仍然是引起儿童死亡最多的，主要在发展中国家。2004年全球估计有20003000万麻疹病例和45.3万死亡病例（大约：32.9万59.5万死亡病例）2， 占疫苗可预防疾病中儿童死亡病例的1/3。麻疹感染会引起发热，出疹和咳嗽，主要感染儿童，但也累及青年人。儿童通常不会直接死于麻疹，而是死于由于免疫抑制而导致的并发症，如肺炎和腹泻。麻疹也可引起终生残疾包括脑损伤，致盲和致聋。麻疹是已知的对人类传染性最强的疾病之一，经常引起暴发流行。在麻疹疫苗广泛使用的国家，很少有严重的并发症和麻疹死亡病例。高死亡率出现在最贫穷落后的国家。全球死亡率最高的国家已经作出巨大的努力来提高疫苗覆盖率，和1999年相比，2004年麻疹死亡率估计降低48，但是在WHO的非洲区仍有超过47的麻疹死亡病例2。图 1. 全球报告麻疹发病率风疹是相对轻微的疾病，其临床表现为发热和出疹。风疹在公共卫生方面重要是因为在怀孕早期感染风疹会影响胎儿发育3。胎儿感染风疹会引起胎儿流产，胎儿死亡或严重的先天性出生缺陷。先天性风疹综合征（CRS）是致盲，致聋，先天性心脏病和精神发育迟缓的重要原因。据估计，全球每年有10万CRS新生儿。大多数这些病例出现在还没有使用风疹疫苗的发展中国家3。CRS监测的范围和质量还很不够，只有0.1估计的CRS病例被报告。许多国家在传染病监测系统中还没有包括CRS的监测，有些已经建立了良好CRS监测的国家没有向WHO/UNICEF上传完整的数据。还有很多国家需要在真正了解风疹疾病负担之前建立有效的CRS监测系统并将监测结果报告给WHO/UNICEF。2.2 麻疹2.2.1 流行病学，感染和免疫反应麻疹这一名词来自于拉丁语，misellus, 意思是悲惨的，痛苦的。这种病有时也称作rubeolus （拉丁语微红的意思），或者morbus（拉丁语疾病的意思）。有麻疹记载的历史可以追溯到7世纪，而在10世纪，Rhazes，波斯的一名内科医生，将麻疹描述为比天花更可怕的疾病。在麻疹疫苗使用前，麻疹几乎是每个儿童都要感染的疾病。在人口密集的地区，麻疹最易感染3-4岁的儿童；在不太拥挤的城市地区和乡村地区，5-10岁儿童发病率最高，这个年龄段的孩子因入学而感染麻疹4。在温和气候地区，每隔2-5年有一次麻疹流行，每次持续3-4个月。一般来说，越大的社区，流行周期越短。麻疹免疫接种在控制麻疹发病及其并发症方面有明显的作用。麻疹流行的年龄分布也有一定的变化。在能够长期维持高免疫覆盖率的发达国家，麻疹的传播现在主要在没有接受免疫接种的人群和免疫接种后血清未阳转的大年龄组儿童中。在高免疫覆盖率的国家仍然有麻疹的暴发，这样的暴发说明了在相关人群中有免疫空白。麻疹是传染性最强的疾病之一，主要通过呼吸道飞沫或直接接触感染者的鼻或咽喉分泌物而传播，偶尔也通过空气传播的微小的气溶胶颗粒或者间接接触新鲜污染的物品。麻疹具有高度传染性，在易感人群中的二代发病率超过90。很多因素可以增加发展中国家的麻疹严重性，例如，过度拥挤会增加病毒在人与人之间的传播，还会增加暴露于高病毒载量的可能性5。麻疹疫苗病毒没有传染性。麻疹病毒感染后，首先侵入到鼻咽部的呼吸道上皮并传播到局部淋巴结（表1），并在这些部位复制2-3天后，形成最初的病毒血症并随后将感染扩展到网状内皮系统。随后的进一步复制,形成了感染后5-7天的第2次病毒血症,往往持续4-7天。在这次病毒血症过程中，可能会有病毒在皮肤、结合膜、呼吸道和其他器官，包括脾、胸腺、肺、肝和肾脏中的感染和复制。病毒血症在感染后11-14天达到高峰，几天后迅速减轻。表1. 没有并发症的首次感染麻疹病毒的过程(接6)天过程0呼吸道飞沫中的麻疹病毒接触鼻咽部的上皮细胞表面。感染上皮细胞和病毒复制。1-2病毒传播至局部淋巴结2-3初次病毒血症3-5麻疹病毒在呼吸道上皮，局部淋巴结和远端组织的复制5-7第2次病毒血症7-11感染皮肤和其他组织，包括呼吸道11-14病毒到达血液，呼吸道，皮肤和其他器官15-17病毒血症减轻以至停止，随着免疫屏障的建立，病毒及其产物迅速减少。呼吸道的感染导致咳嗽和卡他症状(图2)，有时还会有喉炎，毛细支气管炎和肺炎。对于呼吸道的损伤通常是呼吸道纤毛的丢失和继发细菌感染，例如肺炎和中耳炎。皮肤毛细管上皮细胞对于病毒的免疫反应导致了出疹和柯氏斑，一般认为病毒感染细胞和局部的细胞免疫因子的相互作用和麻疹脑炎有关4。图2. 典型麻疹的临床特征临床分期（接4, 6 和7）初次免疫反应会产生IgM和IgG抗体，出疹后几天内可在血清中被检测到（图3）。使用敏感的ELISA IgM检测试剂，出疹后3天，90的病例IgM阳性8。IgM抗体水平在出疹后7-10天达到高峰，然后迅速下降，出疹后6-8周就很难检测到。IgG抗体水平在出疹后大约4周内达到高峰，并能够维持很长时间。血清IgA和分泌型IgA抗体也能被检测到9。再次接触麻疹病毒可以导致强烈的记忆免疫应答，IgG抗体迅速升高，可以阻止临床疾病的发生。初次免疫反应通过自然感染而获得的免疫力通常可以维持终生。细胞免疫由细胞毒性T-细胞和自然杀伤细胞组成，在免疫应答中和急性感染的恢复中起到关键性的作用。细胞免疫应答缺陷的病人经常有严重的进展性的麻疹感染，死亡风险也大大提高。麻疹特异性的免疫抑制起始于临床症状的出现，通常在出疹前，恢复期后仍要持续若干周7。图3. 急性麻疹病毒感染的免疫反应(接 7)2.2.2 麻疹病毒麻疹病毒是副粘病毒科，麻疹病毒属的成员。副粘病毒科的病毒之所以称之为副粘病毒是因为此类病毒对于粘膜有亲和力（希腊语：myxa = mucus）。副粘病毒颗粒呈多形态结构，直径范围为100200nm，平均150nm。在进化关系树中，麻疹病毒和牛疫病毒组成员最为接近，和犬瘟病毒组成员相对较远。F和H蛋白是2个包膜糖蛋白，对于病毒的致病性是相当重要的。F（融合）蛋白负责病毒包膜和宿主细胞膜的融合、病毒侵入和红血球溶解；H（血凝素）蛋白负责病毒和细胞的结合（图4）。尽管麻疹病毒只有一个血清型，但在野病毒中有基因的变异。目前，WHO已经鉴定出23个基因型，其中1990年后鉴定出16个。基因型变异不会影响生物学特性，因为疫苗效力并没有改变，也就是说目前的麻疹疫苗能预防保护所有基因型的麻疹病毒。麻疹病毒是单股负链RNA病毒，其线性基因组结构由基因间三核苷酸，GAA, 所分隔。每个基因含有一个开放读码框（P基因除外）、转录起始和终止信号，以及一个多聚腺苷酸信号。麻疹基因组全长含有15894个核苷酸，有些全长基因组序列可以通过序列号从EMBL/GenBank下载获得，如序列号K01711; X16565。麻疹病毒在室温物体表面可以存活不足2小时，气溶胶形态病毒的感染性可以维持30分钟以上。麻疹病毒对热敏感，56C 30分钟可以灭活。但是，冻干麻疹病毒可以存活很久，如果加入蛋白稳定剂，于70C可以存放几十年。麻疹病毒对脂溶剂（如乙醚和氯仿）、酸碱（PH10）、紫外线和可见光敏感，对许多消毒剂也敏感，包括1%次氯酸钠、70酒精和甲醛。 图4. 麻疹病毒毒粒及其基因组结构示意图 (接12, 13)2.2.3 临床和实验室诊断麻疹的疾病特征包括持续3天或3天以上的全身斑丘疹，发热=38.3C (101F)，咳嗽，卡他性症状或结膜炎。如果病人出现柯氏斑、出疹、并且出疹的先后顺序是从头面部、躯干然后到四肢，就可以做出麻疹的临床诊断7。但是，由于非特异性的前驱症状和临床上轻型麻疹病例的存在，依据临床表现作为麻疹诊断的单一标准是不可靠的。随着麻疹流行的下降，许多临床医师未见过麻疹病人也无诊断麻疹的经验，急需实验室诊断方法来鉴别麻疹和与其临床表现相类似的其他疾病。麻疹在幼儿中的误诊更常见，暴发的病例比散发病例更需要实验室的确认。与麻疹相似的疾病很多例如：风疹、 登革热、 埃可、柯萨奇、人类小DNA病毒B19和疱疹病毒6型等感染引起的疾病，还有一些细菌和立克次体引起的疾病，另外像川崎病（KAWASAKIS）、中毒休克和药物反应也可引起与麻疹相似的疾病。 实验室可以使用以下方法证实可疑病例：l 在经过认可的实验室检测到麻疹特异性IgM抗体 但如果病例标本采集前8天6周接种过麻疹疫苗，而其所在社区没有麻疹流行，并且也没有旅行的历史，则不能判定为麻疹野病毒感染。或者l 恢复期IgG抗体阳转或者滴度有4倍或4倍以上升高（第2份血标本至少在第1份急性血标本采集后10天采集）但如果病例标本采集前8天6周接种过麻疹疫苗，而其所在社区没有麻疹流行，并且也没有旅行的历史，则不能判定为麻疹野病毒感染（注意：成对血清必须平行测试）。或者l 在适当的标本中检测到麻疹野病毒基因 (不作为常规诊断方法，因为敏感性比血清学方法低)。或者l 在临床标本中分离到麻疹野病毒 (不作为常规诊断方法，因为敏感性比血清学方法低), l 但是对于处在麻疹暴发控制和消除阶段的国家，最终的麻疹病例的定义通常基于以下原则11。2.3 风疹2.3.1 流行病学、感染和免疫反应风疹的名字来源于拉丁语，意为“小红点”。风疹最初被认为是麻疹或者猩红热的一种变种，因此被称为是“第三种疾病”。直到1814年，德国医学文献首先将这种疾病描述为一种不同于麻疹或猩红热的疾病，称之为“德国麻疹”。1914年，Hess以猴子为模型进行动物实验研究了病毒病原学。1938年， Hiro和Tosaka通过使用来源于急性患者的经过滤的鼻洗液感染儿童使之患病，从而证实了病毒的病原学。1941年，澳大利亚眼科医生Norman Gregg报告了先天性白内障和妊娠期感染风疹病毒之间的关系。随后，证实了风疹病毒可以引起先天性风疹综合症（CRS），症状通常包括白内障、心脏疾病和耳聋等14。除了一些国家已经消除风疹外，风疹呈全球性分布。它通常也有季节性分布的特点（例如，温带地区发病高峰在冬末和春季），流行周期为59年。然而，不论是发展中国家还是发达国家，风疹流行的范围与周期是有所不同的。那些妊娠期妇女风疹易感率较高的国家，CRS的发生率最高。尽管一些国家对部分选择性人群的研究结果显示，报告风疹易感率较低，但这只是反应了当地部分人群的情况，如果就此推断其它地区也是这样的话，就会掩盖国家开展风疹疫苗免疫接种所带来的显著作用3。风疹可以通过接触感染者的鼻分泌物或咽分泌物传播。这可能是通过空气飞沫传播、直接接触感染者或间接接触被感染的物品而感染的。在封闭的公共场所里，如军营和幼儿园等，所有暴露的易感人群都可能被感染。CRS患儿在鼻咽分泌物和尿液中含有大量的风疹病毒，是一个传染源。风疹具有中度的传染性，在刚出疹时传染性较大，但是在出疹前一周至出疹后57天或更长时间都有传染性（表2）。CRS患儿在出生后一年内都可以排出病毒。目前还没有证据表明疫苗病毒可以传播给接触者。表2. 典型风疹病毒感染的临床特征疾病发生的时间进程天进程0患者呼吸道分泌物中的风疹病毒侵入接触者鼻咽上皮表面而感染易感者。在呼吸道上皮组织中建立局部感染，然后病毒传播到局部淋巴结。 1-22病毒在鼻咽部和局部淋巴结复制3-8病毒首次从鼻咽部排出6-20病毒血症8-14在皮肤和其它部位出现感染灶10-17大量的病毒血症和病毒尿症10-24大量的病毒自鼻咽部排出（在出疹前3天至疹后7天）17-19病毒血症减少，随后停止风疹通常感染儿童和青少年，大约50%风疹感染者为亚临床感染，只有通过实验室诊断才能证实。当出现症状时，通常比较轻微，主要临床症状包括淋巴结发炎和斑丘疹，还可能伴随轻微的卡他症状。淋巴结肿大（淋巴结病）出现在出疹前57天至出疹后2天。尽管这些症状不是风疹的特异症状，但淋巴结病是比较重要的，因为与其它出疹性疾病如麻疹相比，风疹感染后淋巴结病持续时间更长，可以是几周。风疹病毒感染鼻咽部组织后，在进入血液前于呼吸道和局部淋巴结中进行繁殖。病毒血症开始于感染后57天，扩散到包括皮肤在内的身体其他部位。与麻疹相同，出疹是免疫介导的，同时产生特异性的抗风疹病毒抗体。病毒可以在出疹前1周至疹后2周在鼻咽部分离到。图5. 典型风疹病毒感染的临床特征疾病发生的时间进程风疹的潜伏期平均为1418天，一般范围在1223天。在青少年和成年人中，风疹感染可以在出疹前15天出现一个短暂的前驱期，但儿童不会发生。在儿童中，出疹通常是出现的第一个症状。前驱症状通常表现为低热、头痛、身体不适、食欲不振、轻型结膜炎、鼻炎、咽喉痛、咳嗽和枕骨下、关节后和颈部淋巴结出现淋巴结病（图5）。在感染后大约1418天，开始出现斑丘疹（为散在的粉红色皮肤疹）。皮疹，可能比较难以看出来，开始于面部和颈部，随后迅速向下扩散至躯干和四肢，在之后的13天内褪去，偶尔会有瘙痒。关节疼痛和暂时的关节症状在儿童中不常见，但常见于成年人特别是妇女中。伴随风疹病毒的感染，开始出现体液免疫和细胞介导的免疫。IgG和IgM抗体出现在风疹病毒感染后的1418天，大约是在皮疹出现的时间（图6）。风疹IgM抗体滴度下降很快，通常在出疹后2个月内就检测不到了，但风疹IgG抗体仍然存在。风疹特异性的细胞介导的淋巴细胞反应开始于体液反应后的1周，并可以持续终生。尽管自然风疹感染通常可以终生免疫，但也有报道称，经血清学证实，极少数病例在初次感染（或免疫接种）后，可能会发生再次感染。还有妊娠期妇女在自然感染或疫苗免疫导致的重复感染后的出现CRS患儿的报道，但是这种情况非常少见。母传风疹抗体可以为新生婴儿在最初几个月内提供保护免受风疹病毒的感染，因此如果在早期进行疫苗免疫接种会影响疫苗免疫效果。图6. 典型风疹病毒感染的免疫反应2.3.2 CRS和CRI先天性风疹综合症(CRS)是风疹最严重的危害。在妊娠期前三个月胎儿感染风疹病毒可以导致早产、流产、死产或多种缺陷，事实上所有器官系统都会受到影响。耳聋是最常见的，经常是CRS的唯一症状。当发生了胎儿感染而没有出生缺陷，这种情况被认为是先天性风疹感染（CRI）。妊娠期风疹病毒感染造成先天性缺陷的机率为1090%。这些缺陷的严重性和特性取决于感染发生时胎儿的孕龄。最危险的时间是在妊娠期的最初12周；在妊娠期20周后感染很少发生缺陷。器官特异性通常与妊娠期感染的阶段有关，但是，胎儿的畸形和感染的时间的关系却不总是明确的。一旦发生感染，风疹病毒可以传播到很多器官，并且损伤可以累积。如果在妊娠期的最初8周内感染通常会导致眼和心脏的损伤，在妊娠期18周内感染可能会出现脑部的损伤和耳聋症状6，13，14。虽然妊娠期妇女是不能接受风疹疫苗免疫接种的，但是一项研究表明，1000多名易感妊娠期妇女在妊娠早期不经意地接种风疹疫苗，没有发生一例CRS患儿。另一项关于大约19，000名易感妊娠期妇女在大规模的强化免疫中不经意地接种了风疹疫苗的调查中，也没有发现发生CRS病例的证据（未发表资料）。因此，在妊娠期不经意地接种了风疹疫苗不是进行流产的一个指标16。2.3.3 风疹病毒图7. 风疹病毒颗粒及其基因组结构图（E1和E2糖蛋白以二聚体形式存在）风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员。与甲病毒属关系最密切，如东方和西方马脑炎病毒。与大部分披膜病毒科病毒不同的是，它不以节肢动物为媒介传播，而是通过呼吸道传播的。风疹病毒呈圆形，直径为6070nm，由二十面体的核衣壳组成，包含单股正链RNA基因组，周围包绕着一层类脂囊膜。风疹病毒有三个结构蛋白，E1和E2蛋白位于包膜上，衣壳蛋白或C蛋白位于核心，包绕着RNA（图7）。膜蛋白（E1和E2）是糖蛋白，以二聚体形式存在，形成突出于病毒毒粒表面的6-8nm刺突。E1是主要的表面分子，是中和和血凝决定簇17。虽然病毒只有一个血清型，但是基于E1基因编码区的亲缘性关系树分析显示，存在至少7个不同的基因型所代表的2个进化枝18。与其它披膜科病毒没有交叉反应。风疹病毒包含长度为9762个核苷酸的RNA，基因5端有帽状结构，3端具多聚腺苷酸尾（poly A）。风疹病毒蛋白的合成和加工通过高分子量的多聚蛋白前体发生17。一些风疹病毒的核苷酸序列信息可在EMBL/Genbank中得到，序列号为M15240、M18901和M32735。风疹病毒对温度敏感，但是较麻疹病毒有更好的热稳定性；病毒可以分别在5630分钟、704分钟和1002分钟的条件下灭活。如果冻存于-20，病毒滴度下降很快，但是病毒在-60或更低的温度和带有稳定剂的冷冻干燥状态下比较稳定。如果使用蛋白来稳定，它可以反复冻融而滴度不会下降。脂溶剂、弱酸和弱碱、紫外线可以灭活风疹病毒。对多种消毒剂也比较敏感，1%次氯酸钠、70%乙醇和甲醛均可将其灭活 14，17，19。2.3.4 临床诊断和实验室诊断如果仅仅基于临床体征和症状进行风疹的诊断是不可靠的，因为有许多其它出疹性疾病可以表现出与风疹病毒感染后相类似的症状，而且有近50%的风疹病毒感染者表现为亚临床感染14。实验室可以使用下列一种或多种方法来提供风疹病毒感染的证据。l 在被认可的或经过认证的实验室中进行风疹IgM抗体的检测如果在样品采集前8天至8周内患者接种过含有风疹疫苗成分的疫苗，并且在社区中没有风疹传播的证据，也没有旅游的历史，则不能判定为风疹病毒感染。l 风疹病毒IgG抗体阳转或滴度四倍及四倍以上升高（第二份血清采集的时间至少比急性