生物技术制药：3-动物细胞工程制药-2

转基因动物转基因动物一、转基因动物的产生和发展一、转基因动物的产生和发展l转基因动物转基因动物(transgenic (transgenic animalanimal）: :通过基因工程技通过基因工程技术将外源术将外源DNADNA导导入动物生殖入动物生殖细胞，干细胞，早期胚胎，细胞，干细胞，早期胚胎，并在染色体上整合，稳定传并在染色体上整合，稳定传给子代的技术，转基因技术给子代的技术，转基因技术诱导基因组改变的动物称转诱导基因组改变的动物称转基因动物基因动物19741974年年JaenischJaenisch等获得含有等获得含有SV40 DNASV40 DNA的的嵌合体小嵌合体小鼠鼠。19801980年，年，GordonGordon应用显微注射法首次成功地将重应用显微注射法首次成功地将重组的外源组的外源DNADNA直接注入小鼠受精卵雄原核中，获得直接注入小鼠受精卵雄原核中，获得了了携带外源基因小鼠携带外源基因小鼠。19821982，PalmiterPalmiter将大鼠的生长激素基因用微注射将大鼠的生长激素基因用微注射方 法 导 入 小 鼠 的 受 精 卵 中 获 得方 法 导 入 小 鼠 的 受 精 卵 中 获 得 巨 型 小 鼠巨 型 小 鼠（supermousesupermouse），从而在理论上和实践意义上都），从而在理论上和实践意义上都将转基因技术提高将转基因技术提高一步，引起生物学界极大的关一步，引起生物学界极大的关注，为基因工程育种提供诱人的前景。注，为基因工程育种提供诱人的前景。早期以提高生长为主早期以提高生长为主 以生产药用蛋白以生产药用蛋白 和可移植的器官和可移植的器官Supermouse-1982年年转一个简单的标志基因转一个简单的标志基因GFP恒河猴恒河猴名叫安迪（名叫安迪（Andi, inserted DNA）2001年年猪的一个能引发人体排斥反应的基猪的一个能引发人体排斥反应的基因因 -GT基因基因被关闭被关闭 ，使猪的器官，使猪的器官成功移植到人体内的可能性大大增成功移植到人体内的可能性大大增加加-2002年年二、转基因动物技术的原理和方法二、转基因动物技术的原理和方法（一）基本原理（一）基本原理体外构建的重组体外构建的重组DNADNA分分子通过显微注射，病毒载子通过显微注射，病毒载体转移，胚胎干细胞转染等方法注入动物的受体转移，胚胎干细胞转染等方法注入动物的受精卵或床前的胚胎细胞，然后将此受精卵或胚精卵或床前的胚胎细胞，然后将此受精卵或胚胎细胞植入子宫，使其发育成携带外源基因的胎细胞植入子宫，使其发育成携带外源基因的转基因动物转基因动物外源目的基因的制备外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系筛选所得的转基因动物品系GFP-, GFP+ mice目的基因目的基因表达载体表达载体转基因方法转基因方法纯化技术纯化技术临床实验临床实验（二）外源目的基因转入动物的早期胚胎方法（二）外源目的基因转入动物的早期胚胎方法l1.显微注射法显微注射法 在光学显微镜下，利用显微操作仪，直接把在光学显微镜下，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。细胞中，然后生产动物个体的技术。microinjection经过显微注射经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整发育而成的动物中，有少数整合了被注射的合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。分子，成为转基因动物。目前是创造转基因动物的最有效，最成功的途径目前是创造转基因动物的最有效，最成功的途径基质附着序列基质附着序列MAR，富含，富含AT。通过与核基质的结合，它能使染色质形成独立的环状结构，。通过与核基质的结合，它能使染色质形成独立的环状结构，调控基因的转录和表达，减少由于位置效应引起的转基因沉默。调控基因的转录和表达，减少由于位置效应引起的转基因沉默。MARs在提高在提高转基因表达水平、消除转基因个体间表达水平的差异、抑制转基因沉默等方转基因表达水平、消除转基因个体间表达水平的差异、抑制转基因沉默等方面起着重要的作用面起着重要的作用 通过注射妊娠血清和人绒毛膜促进腺激素的通过注射妊娠血清和人绒毛膜促进腺激素的激素疗法激素疗法使小使小 鼠鼠超数排卵超数排卵3535个（一般情况下排卵个（一般情况下排卵5-105-10个）个） 交配交配后，从输卵管内后，从输卵管内取出受精卵取出受精卵；转基因样品注射入受精卵转基因样品注射入受精卵中变大的雄性原核内中变大的雄性原核内将将25-4025-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ；从小鼠子代体内取出从小鼠子代体内取出DNADNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合样品，进行杂交，鉴定转基因的整合 与否及位子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗与否及位子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗 传及表达传及表达 。 DNADNA显微注射法的基本程序显微注射法的基本程序优点：优点： 转基因范围广转基因范围广转移基因大转移基因大，可达数百，可达数百kbkb；且转基因且转基因不含任何病毒基因组片段不含任何病毒基因组片段，绝对安全，绝对安全 。非嵌合体非嵌合体已成功制备转基因的鼠，兔，羊，猪已成功制备转基因的鼠，兔，羊，猪整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达整合导致转基因不表达整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等易位缺失等需显微操作仪，技术性要求强。需显微操作仪，技术性要求强。 成功率低成功率低l2.2.反转录病毒感染法反转录病毒感染法将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，（也病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的）获得转基因动物的方共同培养以达到感染目的）获得转基因动物的方法法在培育在培育转基因禽类转基因禽类研究中有广泛应用，是目前制研究中有广泛应用，是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法，主要集中在备转基因鸡最有效和最成功的方法，主要集中在鸡的良种培育及抗病毒感染研究方面。鸡的良种培育及抗病毒感染研究方面。如果在第一次卵裂如果在第一次卵裂之前外源之前外源DNADNA整合到整合到胚胎基因组中，可获胚胎基因组中，可获得转基因动物得转基因动物在第一次卵裂之后在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，整合，会产生嵌合体，其第二代可能出现转其第二代可能出现转基因动物。基因动物。 （1 1）反转录病毒基因）反转录病毒基因反式作用序列反式作用序列顺式作用序列顺式作用序列（2 2）反转录病毒感染法的载体的构建反转录病毒感染法的载体的构建复制型缺陷重组病毒载体复制型缺陷重组病毒载体的构建：只能产生病毒的构建：只能产生病毒RNARNA 不编码结构蛋白不编码结构蛋白 提取病毒未整合的环状形式提取病毒未整合的环状形式DNADNA；将环状将环状DNADNA克隆到适当的载体中；克隆到适当的载体中；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；将外源目的基因克隆到载体中将外源目的基因克隆到载体中（3 3）包装细胞）包装细胞 在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒能生产病病毒RNARNA和所有蛋白质，但不能包装和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；成病毒颗粒；病毒包装细胞病毒包装细胞：染色体除整合序列的整个病毒：染色体除整合序列的整个病毒基因组，为重组蛋白载体转录的基因组，为重组蛋白载体转录的RNARNA提提供包装供包装蛋白蛋白病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。粒。Retrovirus ReplicationRecombinant Retrovirus（4 4）通过物理方法将重组）通过物理方法将重组DNADNA分子转入分子转入包装细胞包装细胞利用反转录病毒利用反转录病毒DNADNA的的LTRLTR区域具有转录启动子的区域具有转录启动子的特点，外源基因随病毒特点，外源基因随病毒RNARNA转录，并在载体上转录，并在载体上 序序列的作用下，重组病毒转录的列的作用下，重组病毒转录的RNARNA和包装细胞提供和包装细胞提供的包装蛋白就可以组装成有感染性的病毒颗粒的包装蛋白就可以组装成有感染性的病毒颗粒病毒收获后感染早期胚胎或直接感染受精卵。病毒收获后感染早期胚胎或直接感染受精卵。或构建好的或构建好的DNADNA注射入囊胚腔中和重组病毒及辅助注射入囊胚腔中和重组病毒及辅助病毒共培养进行转染病毒共培养进行转染病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法优点：优点：同时感染大量胚胎同时感染大量胚胎整合率高，转基因整合后能稳定地遗传整合率高，转基因整合后能稳定地遗传单拷贝整合型单拷贝整合型不需复杂设备不需复杂设备 缺点：缺点：外源基因难植入生殖系统，成功率低外源基因难植入生殖系统，成功率低载量较小，一般只有载量较小，一般只有8 kb8 kb，不能插入大片段，缺，不能插入大片段，缺少邻近的调控元件而影响转基因表达；少邻近的调控元件而影响转基因表达；l3.胚胎干细胞方法胚胎干细胞方法胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonic stem embryonic stem cellcell，ESES）是从早期胚胎内细）是从早期胚胎内细胞团（胞团（ICMICM）分离出来的，能在）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。多能干细胞。含正常二倍体染色体的具有发含正常二倍体染色体的具有发育育全能性的细胞全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存增，并能以克隆的形式保存。胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。动物上应用较晚。猪的胚胎干细胞克隆系，猪的胚胎干细胞克隆系， 牛的胚胎干细胞。牛的胚胎干细胞。ESES细胞成为个体细胞成为个体1.1.将将ESES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体转基因动物。合体转基因动物。2.2.通过通过核移植核移植将将ESES导入去核的卵母细胞，在子宫种导入去核的卵母细胞，在子宫种植发育成个体植发育成个体胚胎干细胞转基因过程胚胎干细胞转基因过程1.ES1.ES细胞的建立与维细胞的建立与维持持动物的准备：动物的准备：受精后受精后3.53.5天的母鼠分离鼠胚。天的母鼠分离鼠胚。胚胎的分离和初培养：胚胎的分离和初培养：3.53.5天孕鼠天孕鼠 鼠断颈处死鼠断颈处死 解剖小鼠取出胚胎解剖小鼠取出胚胎 体外培养胚胎体外培养胚胎 4-64-6天天 后，离散后，离散ICMICM。 ICM的离散与的离散与ES的分离：的分离：分离分离ICMICM 酶解细胞团酶解细胞团 培养离散细胞培养离散细胞 ESES细胞集落细胞集落ES细胞的扩增：细胞的扩增：离散离散ESES细胞细胞 置四孔培养板中置四孔培养板中 培养培养 ES细胞的常规培养：细胞的常规培养：ESES细胞由四孔板转至培养皿进细胞由四孔板转至培养皿进 行常规培养行常规培养2.ES2.ES细胞的基因组操作细胞的基因组操作 将外源基因移入到将外源基因移入到ESES细胞基因组后，既能高细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响效稳定表达，又不影响ESES细胞的各种功能。细胞的各种功能。 这就要求目的基因必须要这就要求目的基因必须要定点参入定点参入，并且参，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。响最小。 与整合位点两端区域与整合位点两端区域同源的两段同源的两段DNADNA序列序列（HB1HB1和和HB2HB2） 转入的目的基因（转入的目的基因（TGTG） 编码抗编码抗G418G418的新霉素的新霉素磷酸转移酶基因磷酸转移酶基因（neoneor r） 两个不同的胸苷激酶两个不同的胸苷激酶基因（基因（HSV-HSV-tktk1 1和和HSV-HSV-tktk2 2）定点参入定点参入3.3.转基因转基因ESES细胞的筛选细胞的筛选正负选择法正负选择法 正选择法筛选出转基因整合型正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：细胞：重组重组DNA导入导入ES细胞，在含有细胞，在含有G418的培养基中，没有整合外源基因的细的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。的细胞才可以存活下来。负选择法筛选出特异整合型负选择法筛选出特异整合型ES细胞：细胞：如果非特异性整合发生，则两个如果非特异性整合发生，则两个tk基基因或其中一个基因很大可能与因或其中一个基因很大可能与TG和和neor一起整合，这时用一起整合，这时用GCV筛选，筛选， tk基因表达的胸苷激酶能基因表达的胸苷激酶能GCV转化成有转化成有毒的化合物，使细胞死亡。毒的化合物，使细胞死亡。丙氧鸟苷丙氧鸟苷 4.4.转基因转基因ESES细胞的检测细胞的检测5.5.移植移植将胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。将胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。（6 6）获得纯合的转基因鼠）获得纯合的转基因鼠优点优点：整合率高：整合率高同源重组实现定点整合，而非随机整合同源重组实现定点整合，而非随机整合缺点缺点：不容易建立胚胎干细胞系：不容易建立胚胎干细胞系长期培养，导入外源基因的胚胎干细胞会由于细长期培养，导入外源基因的胚胎干细胞会由于细胞分化使生产的动物成为嵌合体胞分化使生产的动物成为嵌合体第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长4.4.精子载体导入法精子载体导入法 将外源将外源DNADNA与破坏细胞膜的精子一起孵育，与破坏细胞膜的精子一起孵育，精子可精子可捕获外源捕获外源DNADNA，并通过，并通过受精过程将外源受精过程将外源DNADNA导入导入受受精卵。精卵。意大利意大利LavitranoLavitrano等等19891989年首次报道利用精子作为年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。载体获得了转基因小鼠。改进的方法是精子头部纤维注射改进的方法是精子头部纤维注射此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不少繁杂的操作和条件准备。少繁杂的操作和条件准备。但该法有些但该法有些结果不稳定，不能重复结果不稳定，不能重复, ,外源外源DNADNA分子分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能的功能需在继续改进需在继续改进5.5.基因打靶基因打靶 (gene targeting)(gene targeting)包括包括基因敲除基因敲除(Knock-out)(Knock-out)：靶基因被灭活：靶基因被灭活. . 无功无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活成功能基因的缺失或失活.基因敲入基因敲入(Knock-in):(Knock-in):引入不存在的新基因引入不存在的新基因. . 将外将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，细胞内获得表达，基因替代基因替代：基因修正：基因修正(gene repairment(gene repairment) )NeoRHSVtkGene segment 1Gene segment 2Linearized replacement plasmidNeoRHomologousrecombinationNeoR+/ HSVtk-Random integrationNeoR+/ HSVtk+HRDS同源重组指导序列同源重组指导序列基因打靶的必备条件基因打靶的必备条件胚胎干细胞胚胎干细胞(ES(ES细胞细胞) )能在体外培养，保留发育的全能性能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体打靶载体NeoNeo（新霉素）阳性筛选标志（新霉素）阳性筛选标志HSV-tkHSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) (herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶(thymidine(thymidine kinase kinase) )KNOCK-OUTKNOCK-OUT MICEKNOCK-OUT MICEIsolate gene X and insert it into vector. Inactivate the gene by inserting a marker gene that make cell resistont to antibiotic (e.g. puromycin)Transfer vector with (-) gene X into ES cells (embryonic stem)MARKER GENEVECTORGenome Normal (+) gene XDefective (-)Gene Xe.g.(NeoR)Inject ES cells with (-) gene X into early mouse embryoResulting chimaras have some cells with (+) gene X and (-) gene X. Transfer embryos to surrogate mothersMate them with normal miceScreen pups to find -/+ and mate them Lucky you, if germline contain (-) gene XNext generation will split as 3:1 (Mendelian)Knock-in animalsKnock-in animalsDNAMicroinjection in fertilized eggsTransformation of ES cellsES cells are selected by Neomycin(Neo accompany Your Gene)Transformed ES cells are injected into 3 day embryo (blastula)Chimerae etc as for knocksThe transgene is injected into the male pronucleus of a fertilized eggThe DNA is inserted in the genome RANDOMLYby non-homologous recombinationG0 offsprings from surrogate mothers contain transgene in ALL cellsG0 crossed with non-transgenics. Offsprings called FOUNDERS基因敲除的技术路线如下：基因敲除的技术路线如下：（1 1）构建重组基因载体）构建重组基因载体（2 2）打靶载体导入）打靶载体导入ESES细胞：重组置换细胞：重组置换（3 3）基因敲除）基因敲除ESES细胞注射入胚泡细胞注射入胚泡（4 4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中）胚泡植入假孕小鼠的子宫中（5 5）嵌合体的杂交育种）嵌合体的杂交育种6. YAC (Yeast Artificial Chromosome)6. YAC (Yeast Artificial Chromosome)人工酵母染色体法人工酵母染色体法transfer transfer large gene/cluster large gene/cluster genegene (100kb):YAC (100kb):YAC具有自主复制具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受酵母菌染色体一些特点；可接受1001001000kb1000kb的外源的外源DNADNA片段片段 avoid DNA damage:YACavoid DNA damage:YAC已成为人已成为人类基因组计划和图位克隆基因的类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；重要工具；方方法法显微注射显微注射核移植核移植胚胎干细胞胚胎干细胞逆转录病毒逆转录病毒基因基因敲除敲除精子介导精子介导优优点点外源基因整合外源基因整合效率较高，不效率较高，不需要载体，目需要载体，目的基因的长度的基因的长度可达可达100Kb100Kb转基因效率转基因效率高；预测基高；预测基因表达水平；因表达水平；可以使用定可以使用定点整合技术点整合技术外源外源DNADNA的的整合率高；整合率高； 整合在生殖整合在生殖细胞中的比细胞中的比例也很高。例也很高。 可在整合点可在整合点整合转移基整合转移基因的单个拷因的单个拷贝；贝； 该方法简该方法简单、方便单、方便 缺缺点点精密仪器，精密仪器， 技术操作较难，技术操作较难，易造成宿主动易造成宿主动物基因组的插物基因组的插入突变入突变供体细胞易供体细胞易衰老衰老ESES细胞株不细胞株不易建立，长易建立，长期培养后出期培养后出现分化现象；现分化现象；生产的转基生产的转基因动物都是因动物都是嵌合体嵌合体 插入的基因插入的基因有大小限度；有大小限度；嵌合性很高；嵌合性很高；外源外源DNA DNA 在在动物各种组动物各种组织中的分布织中的分布不均不均 应用应用具有具有一定一定局限局限性性有些结果有些结果不能重复不能重复 三、转基因动物反应器三、转基因动物反应器动物生物反应器（动物生物反应器（bioreactorbioreactor）: :目的片段在器目的片段在器官或组织中表达的转基因动物官或组织中表达的转基因动物生产生产克药物蛋白质，用细胞基因工程需克药物蛋白质，用细胞基因工程需800-800-50005000美元，而利用转基因动物只需美元，而利用转基因动物只需0.02-0.500.02-0.50美元。美元。一种新药从研制到上市通常需要一种新药从研制到上市通常需要10-1510-15年，而转年，而转基因动物基因动物乳腺生物反应器，生产周期仅为年左乳腺生物反应器，生产周期仅为年左右右 。几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器经过人为驯化为生物反应器, ,从生产的角度考虑，从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了乳腺生例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了乳腺生物反应器物反应器, , 血液生物反应器和膀胱生物反应器等。血液生物反应器和膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。人注目。（一）动物乳腺反应器（一）动物乳腺反应器乳腺生物反应器的研制，就是通过基因转移技术，将乳腺生物反应器的研制，就是通过基因转移技术，将外源基因导入动物体内，通过乳腺特异启动子的控制，外源基因导入动物体内，通过乳腺特异启动子的控制，获得乳腺生产外源蛋白质的转基因动物。获得乳腺生产外源蛋白质的转基因动物。药用蛋白基因药用蛋白基因 表达细胞株表达细胞株 细胞核细胞核供体动物供体动物 受精卵受精卵 无核受精卵无核受精卵 组装的核细胞组装的核细胞 胚胎胚胎药用蛋白药用蛋白 乳汁雌性乳汁雌性 转基因动物转基因动物 动物幼崽动物幼崽 假孕动物假孕动物受体动物受体动物商业要求：商业要求： 1g/L1g/L乳腺是外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响乳腺是外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器动物乳腺生物反应器20062006年年8 8月，欧洲药品估计局（月，欧洲药品估计局（EMEAEMEA）批准了哺乳动）批准了哺乳动物细胞乳腺生物反应器（改名为物细胞乳腺生物反应器（改名为乳腺生物反应器乳腺生物反应器） 1 1、动物乳腺是一个、动物乳腺是一个封闭的系统封闭的系统：表达的蛋白绝大：表达的蛋白绝大部分不会回到血液循环部分不会回到血液循环, , 避免大量表达的外源蛋白避免大量表达的外源蛋白对动物健康的危害。对动物健康的危害。2 2、乳腺组织是一种、乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器有效的蛋白质合成器。奶牛一。奶牛一年生产乳蛋白年生产乳蛋白250-300kg, 250-300kg, 山羊生产乳蛋白山羊生产乳蛋白25-30kg, 25-30kg, 家兔生产乳蛋白也可达到家兔生产乳蛋白也可达到3-5kg3-5kg。3 3、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，生物学后加工，生物学活性接近天然产品活性接近天然产品。4 4、动物乳腺表达的外源基因可以遗传，获得生产、动物乳腺表达的外源基因可以遗传，获得生产有价值蛋白质的动物个体后有价值蛋白质的动物个体后, ,可以可以常规繁殖常规繁殖生产群生产群体。体。8080年代，在鼠的乳腺组织高效表达了人年代，在鼠的乳腺组织高效表达了人AATAAT，开创，开创了此研究的先河了此研究的先河全世界有全世界有20-3020-30家公司致力于开发动物乳腺生物反家公司致力于开发动物乳腺生物反应器重组蛋白药物，可进行商业生产的有近应器重组蛋白药物，可进行商业生产的有近3030种种, ,包括人包括人AATAAT、EPOEPO、乳铁蛋白、乳铁蛋白、BSABSA、血红蛋白，、血红蛋白，、和抗凝血酶和抗凝血酶、血纤维蛋白原、血纤维蛋白原、tPAtPA组织纤溶酶原组织纤溶酶原激活物激活物等十余种稀有药品，临床试验的有等十余种稀有药品，临床试验的有l0l0余种，余种，研发阶段的有上百种研发阶段的有上百种20062006年年6 6月，由美国月，由美国GenzymeGenzyme公司研制成功的第一个公司研制成功的第一个转基因动物乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶转基因动物乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶IIIIII（商品名：（商品名：ATrynATryn）已经获准上市）已经获准上市AATAAT转基因羊，其乳汁中含有转基因羊，其乳汁中含有a-a-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶(AAT)(AAT) ，可治，可治疗遗传性肺气肿病。每升羊疗遗传性肺气肿病。每升羊奶售奶售60006000美元。美元。英国英国PPLPPL公司与德国拜耳公司公司与德国拜耳公司生产生产羊乳腺特性表达载体羊乳腺特性表达载体pBC1pBC1在山羊奶中生产在山羊奶中生产ATT荷兰的荷兰的GenPharmGenPharm公公司用转基因牛生产乳司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶牛奶生产出来营养奶粉的销售额是粉的销售额是5050亿美亿美元。元。我国乳腺反应器的研制我国乳腺反应器的研制19961996年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子、年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子、EPO EPO 的转基因羊的转基因羊19981998年获得了能表达人年获得了能表达人BSABSA的转基因奶牛的转基因奶牛20002000年获得了我国首例转有人年获得了我国首例转有人AATAAT的转基因羊的转基因羊20052005年研制的人乳铁蛋白和人乳清年研制的人乳铁蛋白和人乳清BSABSA转基因奶牛均转基因奶牛均获得高效表达，含量分别达到获得高效表达，含量分别达到3.4g/L3.4g/L和和1.5g/L1.5g/L，标，标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白应器重组人类蛋白乳腺产品的缺点乳腺产品的缺点转基因高等哺乳动物乳液蛋白糖基化仍有别于人，转基因高等哺乳动物乳液蛋白糖基化仍有别于人，可能导致抗原性的变化。可能导致抗原性的变化。欧盟人用医学制品委员会（欧盟人用医学制品委员会（CHMPCHMP）曾对）曾对ATrynATryn上市上市提出过反对意见，理由是临床例数太少。提出过反对意见，理由是临床例数太少。另外，美国另外，美国GenzymeGenzyme公司重组人酸性公司重组人酸性-葡萄糖酶葡萄糖酶（商品名（商品名MyozymeMyozyme），原本在转基因兔奶中生产，），原本在转基因兔奶中生产，最终换为最终换为CHOCHO细胞生产并获得细胞生产并获得FDAFDA批准上市批准上市 （二）血液（二）血液血液生物反应器比较适合生产人血红蛋白、抗体血液生物反应器比较适合生产人血红蛋白、抗体和生产非生物学活性状态的融合蛋白和生产非生物学活性状态的融合蛋白而有活性的蛋白或多肽而有活性的蛋白或多肽(如激素、细胞分裂素、组如激素、细胞分裂素、组织血纤维溶酶因子等织血纤维溶酶因子等)由于进入了动物血液循环系由于进入了动物血液循环系统而影响动物的健康。统而影响动物的健康。到目前为止，已有多种通过转基因动物生产的具到目前为止，已有多种通过转基因动物生产的具有生物学功能的人血红蛋白问世。有生物学功能的人血红蛋白问世。大家畜的血液容量较大大家畜的血液容量较大, ,利用动物血液生产某些蛋利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来外源基因编码产物可直接从血清中分离出来, ,血细血细胞组分可通过裂解细胞获得。胞组分可通过裂解细胞获得。血液蛋白质血液蛋白质促红细胞生成素促红细胞生成素(EPO)(EPO)：以转：以转基因猪生产。基因猪生产。这种药物存于转基因猪的血液这种药物存于转基因猪的血液中。目前转基因猪血球素合成中。目前转基因猪血球素合成的遗传控制机制已十分清楚，的遗传控制机制已十分清楚，用基因重组技术合成的用基因重组技术合成的EPOEPO已已在多个国家上市。在多个国家上市。（三）尿液（三）尿液动物膀胱生物反应器动物膀胱生物反应器体液容易收集；动物出生后即可表达；外源蛋白体液容易收集；动物出生后即可表达；外源蛋白不进入血液循环不进入血液循环膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且而且它的基因是高度保守的它的基因是高度保守的,将外源基因插入将外源基因插入55端调端调控序列中控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。就可以指导外源基因在尿中表达。 多用哺乳动物中保守性高的多用哺乳动物中保守性高的UroplakinUroplakin启动子启动子（四）精液（四）精液猪等，精液是体积较大的液体，容易收集猪等，精液是体积较大的液体，容易收集可在雄性动物中表达可在雄性动物中表达还处于研究状态还处于研究状态（五）鸡蛋（五）鸡蛋在卵黄蛋白和清蛋白中表达人类基因在卵黄蛋白和清蛋白中表达人类基因有进一步成为生物反应器的潜能有进一步成为生物反应器的潜能还需进一步解析鸡的基因图谱还需进一步解析鸡的基因图谱转基因鸡的蛋转基因鸡的蛋清清可高水平表达重组药物，但目可高水平表达重组药物，但目前尚无任何一个转基因鸡制备的药物被批准，前尚无任何一个转基因鸡制备的药物被批准，主要问题仍是糖基化问题。主要问题仍是糖基化问题。 尚待解决的问题尚待解决的问题转基因动物的成功率较低。转基因动物的成功率较低。目的基因在宿主染色体的整合及其特异性表目的基因在宿主染色体的整合及其特异性表达问题。达问题。产品纯化问题。产品纯化问题。安全性问题。安全性问题。卵细胞卵细胞C母绵羊子宫母绵羊子宫母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植胚胎移植胚胎移植早期胚胎早期胚胎多莉羊多莉羊分娩分娩卵裂卵裂融合后的卵细胞融合后的卵细胞细胞拆合技术细胞拆合技术妊娠妊娠细胞核移植技术细胞核移植技术供体细胞（供核）供体细胞（供核）细胞培养细胞培养体细胞体细胞卵巢卵母细胞（卵巢卵母细胞（M中期：供质）中期：供质）去核去核无核卵母细胞无核卵母细胞注入注入细胞细胞融合融合重组重组细胞细胞构建重组胚胎构建重组胚胎胚胎移植胚胎移植代孕母体代孕母体生出与供体奶牛遗传生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛基础相同的犊牛归纳归纳:1.共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植核移植和和胚胎移植胚胎移植2.取卵细胞作受体细胞的取卵细胞作受体细胞的原因原因是是:它是最大的细胞它是最大的细胞,易操作易操作,它发育可直接表达性状它发育可直接表达性状3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状两个亲本的性状核移植之前先把目的基因和标记基因的融合基因核移植之前先把目的基因和标记基因的融合基因导入体细胞中。导入体细胞中。筛选阳性细胞。筛选阳性细胞。阳性细胞核移植到去核的卵母细胞中。阳性细胞核移植到去核的卵母细胞中。第五节第五节 动物细胞工程在制药工业上的应用动物细胞工程在制药工业上的应用一、动物细胞大规模生产重组蛋白一、动物细胞大规模生产重组蛋白CHOCHO细胞表达细胞表达HBsAgHBsAg细胞株：细胞株：CHO-C28CHO-C28（1919代代) )细胞培养：转瓶培养，细胞培养：转瓶培养，DEMEDEME培养基培养基纯化：盐析，离心，层析纯化：盐析，离心，层析检测检测二、转基因动物生产药物二、转基因动物生产药物EPOEPO的生产的生产EPOEPO为糖蛋白，由肾脏产生，刺激造血细胞分化，为糖蛋白，由肾脏产生，刺激造血细胞分化，保持外周血红细胞水平，用于治疗贫血保持外周血红细胞水平，用于治疗贫血 1.1.材料：材料：pEPOpEPO质粒，质粒， pWAPpWAP ( (乳清蛋白），乳清蛋白），pWAP3pWAP3（乳清蛋白基因（乳清蛋白基因3 3非翻译区非翻译区UTRUTR）2.2.构建表达载体：乳腺特异性表达载体构建表达载体：乳腺特异性表达载体 pWAP-pWAP-EPO-WAP3EPO-WAP33.3.导入大鼠乳腺：脂质体与质粒混合物注射入乳导入大鼠乳腺：脂质体与质粒混合物注射入乳腺腺4.4.表达：表达：ELISAELISA检测乳汁中表达检测乳汁中表达三、转基因动物作为药物筛选模型三、转基因动物作为药物筛选模型转基因动物可建立敏感动物系以及人类相同疾病转基因动物可建立敏感动物系以及人类相同疾病的动物模型用于药物筛选，避免了传统的动物模的动物模型用于药物筛选，避免了传统的动物模型与人类相似的疾病致病原因、机理不尽相同的型与人类相似的疾病致病原因、机理不尽相同的缺点，其结果准确、经济，试验次数少，试验时缺点，其结果准确、经济，试验次数少，试验时间大大缩短，现已成为人们试图进行药物间大大缩短，现已成为人们试图进行药物“快速快速筛选筛选”的一种手段的一种手段目前，已经培育出较多的转基因动物用于药物筛目前，已经培育出较多的转基因动物用于药物筛选研究，并已在抗肿瘤药物、抗艾滋病病毒药物、选研究，并已在抗肿瘤药物、抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物的筛选中取得突抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物的筛选中取得突破性进展。破性进展。转基因动物是当今分子药理学研究的重要手段，转基因动物是当今分子药理学研究的重要手段，是作为疾病模型用于药物筛选的一种重要工具。是作为疾病模型用于药物筛选的一种重要工具。但仍存在选择的实验动物的种族差异、性别不均但仍存在选择的实验动物的种族差异、性别不均衡、转基因产物不一定能长期表达、目的基因能衡、转基因产物不一定能长期表达、目的基因能否准确地定位于等位基因上等技术问题否准确地定位于等位基因上等技术问题近期主要研究和改进方向近期主要研究和改进方向改进表达载体，提高表达水平和产量改进表达载体，提高表达水平和产量利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本抑制细胞凋亡，延长培养周期抑制细胞凋亡，延长培养周期采用糖基化工程，提高产品质量采用糖基化工程，提高产品质量转基因动物的研究转基因动物的研究组织工程的研究组织工程的研究第一次作业第一次作业l（1 1）85-10085-100分分l临床临床IIII期期-III-III期的某一新基因工程药物，制备，原理等。期的某一新基因工程药物，制备，原理等。l针对某一类疾病，或某一公司的基因工程药物的综述（包括已上针对某一类疾病，或某一公司的基因工程药物的综述（包括已上市的，临床试验阶段，临床前试验阶段疫苗）市的，临床试验阶段，临床前试验阶段疫苗）l基因工程制备方法或新技术的综述基因工程制备方法或新技术的综述l（2 2）70-8570-85分分l近年已上市基因工程药物的综述（针对某一类疾病，或某一公司）近年已上市基因工程药物的综述（针对某一类疾病，或某一公司）l课堂所讲的复习总结课堂所讲的复习总结l（3 3）60-7060-70l教科书本章的复习总结教科书本章的复习总结http:/www.fda.govhttp:/http:/clinicaltrials.gov