第2章 植物组织培养技术

精品范文模板 可修改删除撰写人：_日 期：_第2章 植物组织培养技术第二节 植物组织培养概述一、授课章节第二节 植物组织培养概述。二、学时安排2学时。三、教学目标1掌握植物组织培养的含义。2了解植物组织培养的类型划分。3理解植物组织培养的应用原理。4掌握植物组织培养的特点和应用。四、教学重点、难点分析重点：植物组织培养的含义、特点和应用。难点：植物组织培养的应用原理。五、教具电化教学设备，植物组织培养试管苗。六、教学方法讲授法，多媒体课件。七、教学过程.导入前面我们学习了有关植物育种的一些知识，今天，请看我给同学们看一样东西(教师拿出试管苗)，问同学们这是什么呢？这就是我们要学的植物组织培养。II.新课一、植物组织培养的含义植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的过程。由于培养物脱离母株在试管内培养，故又称离体培养、试管培养。二、植物组织培养的类型植物组织培养由于分类依据不同可划分为不同的类型。植株培养：对幼小植株的培养。植物组织培养根据培养对象器官培养：对根、茎、叶、花、果实、种子等离体器官的培养。组织培养：对植物体的各部分组织进行的培养。细胞培养：对单个细胞或较小细胞团的培养。原生质体培养：对除去细胞壁的原生质体的培养。根据培养方式固体培养：加入琼脂等凝固剂，使培养基固体化，在此培养基上的培养。液体培养：培养基中不加凝固剂，培养基为液体，在此培养基上的培养。根据培养过程初代培养：将外植体进行的第一次培养。继代培养：将培养一段时间的培养物转接到新鲜培养基继续培养的过程。光培养：培养过程中需要光照的培养。暗培养：培养过程中不需要光照的培养。根据培养条件三、植物组织培养的应用原理（一）植物细胞全能性植物细胞全能性，是指植物体上每个具有完整细胞核的植物细胞，都具有该植物体的全部遗传信息和产生完整植株的能力。植物的体细胞一旦脱离所在器官或组织的束缚成为离体状态时，在一定的营养、激素和外界条件作用下，就可能表现出全能性，而生长发育成为完整的植株。（二）细胞的分化和形态建成（三）植物的再生功能四、植物组织培养的特点（一）研究材料来源单一，无性系遗传信息相同（二）试验经济，管理方便，工作效率高（三）培养条件人为控制，可周年连续进行试验或生产（四）生长快，周期短，繁殖率高五、植物组织培养的应用（一）优良品种的快速繁殖（二）脱毒及脱毒苗的再繁育（三）植物新品种的培育（四）种质资源的保存和交换（五）有用次生代谢产物的生产III.作业1.简述植物组织培养的概念和培养类型。2.植物组织培养技术有哪些特点？3.植物组织培养在生产上有哪些方面的应用？ 4.通过学习，你对植物组织培养技术是怎样理解的？第二节 植物组织培养厂房的设计与构建一、授课章节第二节 植物组织培养厂房的设计与构建。二、学时安排2学时。三、教学目标1了解组培工厂的基本结构、各部分结构的具体功能。2理解组培工厂的设计原则与总体要求，能够根据需要和实际情况科学设计组培工厂。3掌握厂房的基本组成，仪器设备配备与设计要求。4了解常用仪器与用具的使用方法。四、教学重点、难点分析重点：组培工厂的设计原则与总体要求。难点：根据需要和实际情况科学设计组培工厂。五、教具电化教学设备、组培工厂现场或实验室。六、教学方法讲授法，演示法。七、教学过程.导入复习：植物组织培养的概念，类型及应用。提问：细胞全能性的概念。上次课我们学习了植物组织培养的基本知识，那么从事植物组织培养的生产需要一些基本的仪器和设备，今天我们来学习植物组织培养的厂房的设计与构建。II.新课一、植物组织培养厂房的设计（一）设计原则1.环境清洁、安静、远离污染源。2.按照工作的目的和规模决定厂房的设计。3.按照自然工作程序先后合理布局，避免生产环节倒排。4.经济实用，节能安全。（二）具体要求1.厂房选址时应选择周围安静、阳光充足、无高大建筑物遮挡的环境；最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染；要求交通便利，便于产品的运送。2.厂房各车间的大小和比例相对合理，车间的设计和设备的配置、摆放与其功能相适应。3.厂房必须满足3个基本的需要：生产准备（器皿洗涤与存放、培养基制备、各种器具的灭菌）、无菌操作和控制培养。4.厂房的建筑与装修材料要耐腐蚀，便于消毒和清洁。（三）厂房基本组成厂房根据结构和应用范围一般设计为药品配制间、洗涤间、培养基制作间、缓冲间、无菌操作间、试管苗培养间、试管苗驯化移植间。1.药品配制间（1）任务：主要用于化学药品的储藏、称量和溶液的配制。（2）设计要求：干燥、通风、无直射光线。房间内设立工作台，工作台最好用抗盐碱，耐腐蚀的台面，要牢固、平稳，具有较好的抗震性能。注意磁力搅拌器与电子天平要分开台面放置。（3）仪器与用具配置：大型工作台、药品柜、普通冰箱、电子分析天平、托盘天平、磁力搅拌器、容量瓶、烧杯、量筒等。2.洗涤间（1）任务：洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存；外植体的预处理与清洗；试管苗的出瓶、清洗与整理等工作。（2）设计要求：房间内应宽敞明亮，方便多人同时操作；配备大型水槽，上下水道要畅通；地面、天花板及墙壁应耐湿和便于清洁；应有晾干台，用于放置洗涤后的培养器皿。（3）仪器与用具配置：水槽、晾干台、周转箱、烘箱等。3.培养基制作间（1）任务：主要负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。（2）设计要求：房间宽敞明亮、通风良好，方便多人同时操作；目前灭菌大多采用电加温，墙体建筑时要预先设计电路线，确保用电线路和灭菌锅的用电安全。在灭菌锅上方的墙壁设置换气窗，利于通风排气。地面、墙壁应用耐湿材料铺设，防水、防潮、防腐蚀。（3）仪器与用具配置：托盘天平、酸度计、工作台、高压灭菌锅、周转箱、储物柜等。4.缓冲间（1）任务：防止工作人员进出时带进杂菌。（2）设计要求：面积一般23m2为宜；缓冲间应安装紫外灯，用以照射灭菌；配备鞋柜、衣柜、拖鞋，用于工作人员进入无菌操作室前在此更衣换鞋，（3）仪器与用具配置：紫外灯、鞋柜、衣柜、工作服等。5.无菌操作间(接种间)（1）任务：进行植物材料的分离接种及培养物转移。（2）设计要求：接种室宜小不宜大，一般78m2。地面、天花板及四壁要求尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置推拉门，以减少开关门时的空气扰动。房间密闭，干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装12盏紫外灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。（3）仪器与用具配置：超净工作台、紫外灯、空调机、医用小推车、接种器具消毒器、酒精灯、接种工具、搁物架等。6.试管苗培养间（1）任务：接种材料的培养生长。（2）设计要求：培养间的大小可根据生产规模和培养架的大小、数目及其它附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁和天花板要求光滑平坦、有绝热防火的性能。能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境；适当位置安装紫外灯进行照射灭菌。（3）仪器与用具配置：培养架、空调机、光照时控器、温度计、摇床等。7.试管苗驯化移植间（1）任务：进行试管苗的驯化和移植。（2）设计要求：通常在日光温室内进行，其面积大小根据生产规模而定。要求能够控温调湿、控光通风、控菌防虫。（3）仪器与用具配置：移栽容器、弥雾装置、遮阳网、移栽基质等。二、基本仪器设备和用具（一）灭菌设备1.湿热灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅）：用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有小型手提式、中型立式、大型卧式等不同规格；根据控制方式分为手动控制、半自动控制和全自动控制等不同类型。2.过滤灭菌设备（防细菌滤膜）：防细菌滤膜的网孔直径为0.45m以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。主要用于赤霉素、玉米素、脱落酸等不耐热物质的灭菌。3.干热灭菌设备：利用高温烘烤或灼烧的方法进行灭菌，包括烘箱（器皿和器械的灭菌）、酒精灯（用于接种工具的灭菌）、接种器械灭菌器等。4.其它灭菌设备：利用紫外光波、超声波、臭氧等杀菌，主要用于对空气和物体表面进行消毒。常用设备包括紫外灯、超声波清洗器、臭氧发生器等。（二）接种设备与用具1.超净工作台：超净工作台是植物组织培养最常用、最普及的无菌操作装置。根据风幕形成的方式可分为水平风和垂直风两种；根据使用方式分为单人单面、双人单面、双人双面等。2.接种工具：外植体接种或培养物继代转接时使用的各种工具。常用的有：尖头镊：用于分离植物组织等；枪型镊：用于夹取植物器官继代转接和外植体接种；解剖剪：用于幼嫩组织、细胞团等剪取；弯头剪：用于转接、剪取试管苗茎段等；解剖刀：用于外植体或培养物切割；接种针：用于茎尖剥离和愈伤组织转移；切割盘：用于原球茎、愈伤组织、植物器官等切割分离。3.显微镜：包括双目体视显微镜(解剖镜)、生物显微镜、倒置显微镜和电子显微镜，用于剥离茎尖和进行培养物的观察、分析、拍照等。（三）培养设备与用具1.培养架：试管苗在培养间里培养时通常摆放在培养架上。培养架大多由金属制成，一般设58层，最低一层离地高约20cm，其他每层间隔30cm左右。培养架长度根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，宽度一般为60cm。2.恒温振荡器：用于液体培养时改善培养过程的氧气供应状况。3.光照培养箱：对于一些对环境条件要求特别严格的培养物，可培养在能自动调控温度、湿度、光照等的智能光照培养箱里。4.培养器皿：根据培养目的和要求不同，可选用不同类型和规格的培养容器。（1）三角瓶：主要用于外植体静置培养、振荡培养或试管苗继代培养。规格有50mL，l00mL，150mL，250mL，500mL等，一般使用l50mL三角瓶。优点：其培养面积大，利于组织生长；透光度好；由于瓶口较小，不易污染。（2）试管：主要用于茎尖培养、液体培养。试管要求口径大，长度稍短、以2cm15cm、2.5cm15cm、3cm15cm 为宜。优点：占空间少，单位面积容纳的数量多。（3）果酱瓶：主要用于继代和生根培养。优点：在工厂化大批量生产时使用，价格低廉，成本低；口径较大，便于操作。缺点：污染率较高；透光性稍差。（4）塑料瓶：主要用于兰科植物的培养。有100mL、150mL、200mL、250mL的规格。优点：密封好、透气性差、瓶内湿度大；质轻，便于操作，不易破损，污染率低；长方盒形的培养株数多，且叠摞起来节约空间。缺点：可重复利用性较差。（四）称量设备与用具1.天平：用于进行琼脂、蔗糖和各种药品的称量，需要有称量微量元素和植物激素等的分析天平；称量大量元素、蔗糖和琼脂等的托盘天平等不同精度的天平。2.烧杯：用于配制培养基母液时溶解各种化合物，规格有501000mL不等。3.量筒：用于量取不同体积的液体，规格有501000mL不等。4.试剂瓶：用于贮存不同容量的溶液，规格有501000mL不等。5.移液管：用于吸取各种用量较少的母液，规格有0.110mL不等。6.容量瓶：用于配制培养基母液时进行定容，规格有501000mL不等。（五）环境控制设备与用具1.空调机：自动控制植物组织培养厂房的温度，为培养物提供最适宜的温度条件。2.冰箱：用于母液和某些试剂的贮存及培养材料的保鲜或与处理等。3.光照时控器：用于自动控制培养间的光照时间。（六）其它设备与用具1.磁力搅拌器：磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质等。磁力搅拌器还可加热，加快物质的溶解。2.蒸馏水发生器或纯水机：用于制备配制母液和培养基的蒸馏水或去离子水。3.药品柜：用于存放各种化学药品。4.加热设备：制备固体培养基时需加热使固化剂溶化，因此需要加热设备如液化气灶、电炉、恒温水浴锅等。5.pH计：用于精确测量和调节培养基的pH，大规模生产中一般用精密pH试纸代替。III.作业1.植物组织培养厂房的设计原则和要求有哪些？2.植物组织培养的工艺流程是怎样的？3.组建一个植物组织培养生产车间应包括哪几部分，各部分的设计要求以及主要功能是什么？4.植物组织培养需要哪些基本设备，各有何作用？第三节 植物组织培养操作技术（1）一、授课章节第三节 植物组织培养操作技术（1）。二、学时安排2学时。三、教学目标1掌握组培的一般工作程序。2掌握不同类型培养器皿和用具的洗涤技术。3了解常用消毒灭菌方法的原理，掌握其操作技术，能根据物品种类正确选用消毒灭菌方法。四、教学重点、难点分析重点：常用的消毒灭菌技术。难点：灭菌和消毒的区别及无菌意识的树立。五、教具电化教学设备。六、教学方法讲授法，演示法。七、教学过程.导入提问：植物组织培养实验室的基本构成。本次课主要介绍的是植物组织培养洗涤和消毒灭菌技术。II.新课一、洗涤技术植物组织培养除了要对培养材料和接种用具进行严格消毒外，各种用具更要求洗涤清洁，因为各种灭菌方法的有效作用时间都是以材料或用具清洁为前提的。（一）洗涤液1.洗衣粉、洗洁精洗涤液 适用于玻璃器皿和金属类器具的洗涤。2.铬酸洗涤液 由重铬酸钾和浓硫酸混合而成，属强氧化剂，对无机离子、灰尘效果好，对油污无效。铬酸洗涤液的配制：称取重铬酸钾50g，加入1L蒸馏水，加热搅拌至完全溶解；冷却后注入90mL浓硫酸，混合均匀即可。刚配好的洗液是棕红色，反复使用至变成青褐色则失效。【注意事项】（1）配制时重铬酸钾溶液一定要冷却后才能加浓硫酸，且只能把浓硫酸缓慢加入重铬酸钾溶液中，决不能将重铬酸钾溶液或蒸馏水倒入浓硫酸中。（2）由于铬酸洗涤液具有极强的氧化能力和腐蚀作用，故不要用手直接接触洗涤液。（二）各类器皿和用具的洗涤方法1.新的玻璃器皿：使用前先用1%稀盐酸浸泡1224h用毛刷蘸洗衣粉水刷洗干净流水冲洗34次最后用蒸馏水冲淋1遍晾干（或烘干）后备用。2.已用过的培养器皿：除去容器内的残渣自来水冲洗浸泡在洗衣粉水中1530min用毛刷刷洗干净流水冲洗34次最后用蒸馏水冲淋1遍晾干（或烘干）后备用。3.已被霉菌等杂菌污染的器皿：121高温高压蒸汽灭菌30min趁热倒去残渣自来水冲洗浸泡在洗衣粉水中1530min用毛刷刷洗干净流水冲洗34次最后用蒸馏水冲淋1遍晾干（或烘干）后备用。4.移液管、量筒等量器：铬酸洗涤液中浸泡2h以上取出后在流水中冲洗30min蒸馏水冲淋1次晾干（或烘干）后备用。5.载玻片和盖玻片：洗涤液中浸泡数小时水洗绸布擦干放在95%的洒精中备用。6.解剖刀、镊子、剪刀等：新购置金属器皿因其上有润滑油或防锈油，用蘸有四氯化碳的棉布擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。每次使用后先用洗衣粉水刷洗，再用酒精擦拭。二、灭菌与消毒技术（一）灭菌与消毒的区别1有菌和无菌的范畴有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他理化灭菌方法处理后的物体一般可认为是无菌的。2.灭菌与消毒的区别灭菌是指用物理或化学方法杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体。消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。由灭菌和消毒的含义可以看出，二者的主要区别是：灭菌是把所有有生命的物质全部杀死；而消毒主要杀死或抑制物体表面的微生物，但芽孢、厚垣孢子一般不会死亡。（二）常用的消毒灭菌方法（三）消毒灭菌技术1.环境消毒：方法主要有空气过滤灭菌、紫外线照射消毒、喷雾消毒和熏蒸消毒等。空气过滤灭菌：成规模的植物组织培养车间可采用空气过滤系统对整个环境进行空气过滤灭菌，这种方法投入较高，操作要求比较严格，一般较少采用。组织培养中普遍采用的是对无菌操作的微环境进行空气过滤灭菌，如超净工作台的局部无菌环境。紫外线照射消毒：利用紫外光波照射灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。缓冲间、接种间、培养间等均可采用紫外线照射消毒，一般照射2030min。喷雾消毒：利用70%75%的酒精或0.2%的新洁尔灭对环境进行喷雾，既可以起到直接杀死环境中微生物的作用，又可以使飘浮的尘埃降落，防止尘埃上附着的杂菌污染培养基和培养材料。熏蒸消毒：利用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，按2mLm3用量，将甲醛置于广口容器中，加0.2g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿，关闭紧密，24h后打开门窗通风。2.用具的消毒灭菌：根据用具种类不同分别采用干热灭菌、湿热灭菌、浸泡消毒、擦拭消毒等方法。干热灭菌：利用烘箱进行烘烤灭菌的方法，适用于各种玻璃器皿和器械的灭菌消毒。方法是将清洗后的玻璃器皿和器械妥为包扎，放入箱内，将箱温控制在150170，烘烤120min，即可达到灭菌效果。在干热条件下，细菌的营养细胞抗热性大为提高，故能源消耗大，又浪费时间，所以目前多采用湿热灭菌代替，接种工具也可采用消毒器烘烤和酒精灯外焰灼烧的方法消毒。湿热灭菌：适用于培养基、玻璃器皿、棉塞、布制品及金属用具等的灭菌，一般灭菌掌握在0.10.15MPa压力下2030min。浸泡消毒：在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入70%75%的酒精中浸泡，使用之前取出在酒精灯外焰上灼烧，待冷却后使用。擦拭消毒：接种用具及超净工作台表面等使用前可用70%酒精或0.10.2%新洁尔灭溶液进行擦拭消毒。3.培养基灭菌：培养基灭菌一般采用湿热灭菌，特殊情况下采用过滤无菌。湿热灭菌：采用高压蒸汽灭菌锅灭菌。过滤灭菌：主要针对一些不能处于高温高压环境的物质，如GA3、IAA、ABA（脱落酸）、ZT（玉米素）、部分维生素、多数抗生素和酶。过滤灭菌的原理是细菌滤膜的网孔直径为0.45m以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子（直径1m以上）等因大于滤膜网孔直径而被阻。4.外植体消毒：从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物，因此，植物材料必须经严格的表面消毒处理。接种的植物材料叫做外植体。外植体的消毒要求比较严格，既要能有效杀灭微生物，又要保证植物组织尽量少受伤害。外植体一般采用浸泡消毒的方法，具体方法在以后课程中讲授。III.作业1.不同的培养器皿怎样选择与洗涤？2.植物组织培养环境如何进行消毒灭菌？3过滤灭菌的技术原理？第三节 植物组织培养操作技术（2）一、授课章节第三节 植物组织培养操作技术（2）。二、学时安排2学时。三、教学目标1掌握培养基的作用。2掌握培养基中生长调控物质的作用。3了解培养基的类型。四、教学重点、难点分析重点：培养基的基本成分。难点：培养基中生长调节物质的作用。五、教具电化教学设备。六、教学方法讲授法，演示法。七、教学过程.导入培养基是进行植物组织培养的基质，进行植物组织培养必须掌握培养基的基本知识，今天我们就学习培养基的种类和基本成分。II.新课三、培养基制备技术（一）配制培养基的目的配制培养基的目的是人为提供离体培养材料的营养源。配制的不同培养基，是为满足不同类型植物材料对营养的不同需要。没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。（二）培养基的种类1.培养基的种类划分培 养 基 种 类固体培养基：在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态。根据形态液体培养基：培养基中没有凝固剂为液体状态。根据培养阶段根据培养进程根据营养水平初代培养基：初代培养阶段所用的培养基。继代培养基：继代培养阶段所用的培养基。完全培养基：在基本培养基中加入适宜的植物激素和有机附加物的培养基。基本培养基：只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合成培养基。如Ms、White、Nitsch、N6等培养基。诱导培养基：初代培养时诱导外植体生长与脱分化的培养基。增殖培养基：继代培养中促进培养物快速增殖的培养基，也称扩繁培养基。生根培养基：诱导试管苗生根的培养基。2.常用培养基的配方和特点 目前已公开报道的基本培养基有许多种类，各有不同的特点和适用范围，在植物组织培养生产中应根据不同的植物种类和培养部位及不同的培养目的选用不同的培养基。常用的培养基配方：表1 常用培养基配方含量（mg/L） MS（1962）B5（1968）White（1943）SH（1972）Knudson C（1946）VW（1949）N6（1974）(NH4)2S04NH4N03KN03Ca(N03)24H20CaCl22H20Ca3(PO4)21650l900440134250015080200250020050010005005252004632830166MgS047H20KH2PO4NaH2P04H20Na2SO4Na2EDTA37017037.325015037.3720172004001525025025025018540037.3FeSO47H20Fe2(SO4)3KClFe2(C4H4O6)327.827.82.56520252827.8NH4H2PO4MnSO4H20MnS044H20ZnSO47H20H3B03KINa2Mo042H20MoO3CuSO45H20CoCl26H2022.38.66.20.830.250.0250.025102.03.00.750.250.0250.025531.50.750.0010.01300101.05.01.00.10.20.17.57.54.43.81.60.8盐酸硫胺素VBl烟酸盐酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸0.10.50.51002.0101.01.01000.10.30.135.05.05.0100010.50.52蔗糖pH300005.8200005.5200005.6300005.8200005.8200005.5500005.8表2 常用基本培养基的特点基本培养基种类设计由来特点适用范围MS1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液；它的硝酸盐和铵盐含量较其他培养基为高，比例也比较合适，不需要添加更多的有机附加物。广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养B51968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计除含有较高的钾盐外，还含有较低的氨态氮和较高的盐酸硫胺素适合双子叶植物，尤其木本植物的培养White1943年由White为培养番茄根尖而设计无机盐数量较低，提高了MgSO4的浓度适于生根培养SH1972年由Schenk和Hidebrandt设计盐分浓度较高，铵态氮含量较低，盐酸硫胺素和硝酸钾含量较高在不少单子叶和双子叶植物的组培中应用效果较好Knudson C1922年由Knudson为兰科种子培养而设计，后经多次改良成分简单，不能满足大多数植物组织细胞的生长发育所需的营养物质适用于兰科植物种子培养和萌发VWVacin 和Went 在1949年设计培养基的总离子强度稍低些，磷以磷酸钙的形式供给适用于气生兰的组培N61974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计成分较简单，KN03和(NH4)2S04含量高适用于单子叶植物花药培养，广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养（三）培养基的组成培养基主要有水、无机盐、有机物、植物生长调节物质、培养基的支持材料五大类组成。1.水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以确保母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质，大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。2.无机元素(1)大量元素指浓度大于0.5 mmolL的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS047H20、CaCl22H20等化合物来提供。(2)微量元素指浓度小于0.5 mmolL的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成必要的。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制作培养基时不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其pH在5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeS047H20和Na2-EDTA结合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长发育异常。3.有机化合物(1)糖类：这类有机物的作用一是培养物赖以生长的碳源；二是使培养基维持一定的渗透压。 种类：常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖，麦芽糖、半乳糖、甘露糖等在组织培养中也有应用。 使用浓度：一般在23。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。（2）维生素类：这类化合物在植物细胞中主要以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。 种类：硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、烟酸(维生素B3，又称维生素PP)、泛酸(维生素B5)、生物素(维生素H)、钴胺素(维生素B12)、叶酸(维生素B11）等。 使用浓度：0.11.0 mg/L(3)肌醇(环己六醇)： 作用：在糖类的相互转化中起重要作用；参与细胞壁和细胞膜的构建；能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成；对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用。 使用浓度：一般为1OO mgL。(4)氨基酸： 作用：是很好的有机氮源，可被细胞直接吸收利用。 常用种类：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。有时应用水解乳蛋白（LH）或水解酪蛋白（CH），但由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。(5)天然复合物：其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般尽量不使用。 椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物，一般使用浓度在1020。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1 mm时，椰乳就不发生作用。 香蕉 用量为150200 g/L。主要在兰花的组织培养中应用，对原球茎增殖有明显促进效果，并有利于壮苗与生根。 马铃薯 去掉皮和芽后，加水煮30 min，经过过滤，取其滤液使用。用量为150200 gL。添加后可得到健壮的植株。4.植物生长调节物质 植物生长调节物质是培养基的关键性物质，对植物组织培养起着决定性作用，控制着培养物的脱分化、再分化和形态建成。（1）生长素类： 作用：在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。 种类及活性：常用种类有IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)等。作用能力的强弱顺序为：2，4-DNAAIBAIAA。 稳定性：IAA是天然存在的生长素，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解，故要避光贮存，过滤灭菌。其他3种生长素为人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏。特别是NAA稳定性好，活性较高，价格低廉，所以应用最普遍。 溶解性：生长素不溶于水，IAA、NAA、IBA配制时可先用少量95酒精助溶。2，4-D可用0.1 molL的NaOH或KOH助溶。（2）细胞分裂素类： 作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。 种类及活性：这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-苄氨基嘌呤)、Kt(激动素)、Zt(玉米素)等。作用能力的强弱顺序是：ZT6-BAKT，常用的是人工合成的、性能稳定的、价格适中的6-BA。 溶解性：细胞分裂素不溶于水，也不溶于酒精，一般可溶于0.1mol/L的盐酸或NaOH溶液中。（3）赤霉素(GA)：有20多种，培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70-100失效，应当过滤灭菌。生长调节物质的使用量甚微，一般用mgL表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.055 mgL，细胞分裂素0.0510 mgL。5.培养基的其他成分(1)琼脂：在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在90以上热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量在610 gL之间。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比，优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，缺点是培养物的吸收面积小；各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用；培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。(2)抗生物质：抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520 mgL之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用。（3）抗氧化物：培养基中添加抗氧化物是为了抑制外植体和培养物褐变。常用的抗氧化剂有半胱氨酸、维生素C、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。（4）活性炭：活性炭有很强的吸附作用，它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚类、醌类物质及激素等。通常使用浓度为0.110gL。培养基中添加活性炭的作用：防止褐化；促进生根；降低玻璃苗的产生频率；活性炭在胚胎培养中也有一定作用。但是，活性炭具有副作用：吸附培养基中的生长调节物质；削弱琼脂的凝固能力，添加时须注意。III.作业1.培养基的作用是什么？2.培养基一般包括哪些基本成分？3. 培养基中添加的植物生长调控物质有哪些？ 各有什么作用？第三节 植物组织培养操作技术（3）一、授课章节第三节 植物组织培养操作技术（3）。二、学时安排2学时。三、教学目标1掌握培养基母液的配制技术。2掌握培养基的配制、分装包扎技术。3掌握培养基高压灭菌技术。4掌握无菌操作技术。四、教学重点、难点分析重点：1培养基母液配制。2培养基的制备技术。3培养基的高压蒸汽灭菌。4无菌操作技术。难点：1培养基母液、培养基配制的计算。2无菌操作技术步骤的剖析。五、教具电化教学设备、试管苗、接种工具、培养基。六、教学方法讲授法，模拟实验法。七、教学过程.导入提问：培养基的作用。复习：培养基的基本成分。II.新课（四）培养基的配制1.培养基母液的配制：所谓母液是欲配制培养液的浓缩液，也称贮备液。母液配制的目的一是方便快速配制培养基，二是保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取。（1）母液配制方法单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般mg/mL表示。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后各类混合在一起定容到一定体积配成混合母液。（2）母液配制流程确定培养基配方确定母液种类计算称量溶解混合定容分装贴标签冰箱保存记录（3）母液配制要求母液浓缩倍数：大量元素1020倍；微量元素100200倍；铁盐100倍；有机物100200倍。选用蒸馏水，分析纯或化学纯试剂，防止沉淀。激素母液浓度：0.51mg/mL，1次配成50mL或100mL（4）药品用量的计算：配制母液时药品用量(mg)=配方用量(mg)浓缩倍数制备容量（L）（5）母液配制技术 以MS培养基为例，配制过程如下：表1 MS培养基母液配制（单位：mg/L）母液种类成分规定量扩大倍数称取量母液体积(mL)配1L培养基吸取量(mL)大量元素KNO3NH4N03MgSO47H20KH2P04CaCl22H2O190016503701704401019000165003700170044001000100微量元素MnS044H20ZnS047H20H3B03KINa2Mo042H20CuS045H20CoCl26H2022.38.66.20.830.250.0250.025100223086062083252.52.5l00010铁盐Na2EDTAFeS044H2037.327.810037302780100010有机物甘氨酸盐酸硫胺素盐酸吡哆醇烟酸肌醇2.00.10.50.510010020010505010000100010大量元素母液 配成浓缩10倍的母液。用感量0.01g托盘天平按表2-4称取药品，分别加入100mL左右蒸馏水中，再用磁力搅拌器搅拌促进溶解，然后倒入1000mL容量瓶中，再加水定容至刻度，成为10倍母液。注意Ca2+和SO42、PO43易发生沉淀，因此CaCl22H2O充分溶解后最后加入。微量元素母液 配成浓缩100倍的母液。用感量0.0001g分析天平按表2-4准确称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000mL。铁盐母液 配成浓缩100倍的母液，用感量0.01g托盘天平按表2-4称取药品，分别溶解，混合后加水定容至1000mL。有机物母液 配成浓缩100倍的母液。用感量0.001g分析天平按表2-4分别称取药品，溶解，混合后加水定容至1000mL。每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成0.51mgmL，用时根据需要取用。多数激素难溶于水，要先溶于特定溶剂，然后才能加水定容。具体方法为：IAA、IBA、GA、NAA等先溶于少量95的酒精中，再加水定容到一定体积；2，4-D可用少量0.1mol/L的NaOH溶解后，再加水定容到一定体积；Kt和BA先溶于少量0.1mol/L的HCl中再加水定容。（6）母液的保存 将配制好的母液分别倒入试剂瓶中，贴好标签，在标签上注明母液名称，配制倍数与日期。然后放入冰箱内4低温保存，用时再按比例稀释。2.培养基的配制（1）培养基配制工艺流程确定培养基配方及用量计算母液用量移取母液定容玻璃器皿洗涤调节pH分装培养基熬制高压灭菌干燥称取琼脂、蔗糖封口标识、记录（2）培养基制备的操作步骤确定培养基配方及用量：根据培养对象、培养目的等，通过查阅资料及咨询等确定培养基配方，然后据外植体的数量和试验处理的多少确定培养基的用量。称取琼脂、蔗糖：用托盘天平分别称取0.6%1%的琼脂、2%3%的蔗糖。培养基熬制：量取纯净水放入加热容器，纯净水的体积应少于所配制培养基体积，约占终体积的2/33/4，加入称量好的琼脂和糖，接通电源加热。边加热边搅拌，防止糊底和溢出，至完全溶化。母液取用量的计算：基本培养基配方成分母液取用量（mL）=1000浓缩倍数制备培养基的体积（L）；生长调节物质母液取用量（mL）=配方中的浓度（mg/L)母液浓度（mg/mL) 制备培养基体积（L）移取母液：根据计算出的母液用量，按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、植物激素的顺序将母液取出，混合。定容：将母液混合液加入到琼脂完全溶化的培养基中，搅拌混匀，并加水定容到所需体积。调节pH：用酸度计或精密pH试纸测试培养基溶液的pH(5.56.8)，偏碱滴加0.1mol/L的HCl调整，偏酸滴加0.1mol/L的NaOH调整，直到达到配方要求值。分装：用乳胶管把配制好的培养基趁热分装到培养瓶中，100150mL的培养瓶每瓶装入3035mL左右的培养基，分装时数量要均匀、合适，培养基不沾附瓶口和瓶壁。封口：用合适的封口材料和线绳包扎。标识与记录：封装好的培养基做好标记放到高压灭菌锅中准备灭菌。3.培养基的高压灭菌加水：灭菌锅加水至淹没电热丝（或高低水位线之间）。装锅：将培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。密封：封闭高压灭菌锅各出气口。加压：接通电源加压至0.05MPa。排气：断开电源，打开排气阀，排冷气至压力为0MPa。稳压：接通电源，继续加压至0.1MPa开始计时，保压在0.10.15Mpa维持2030min，此时温度在121125。降压：稳压时间到，关闭电源自然冷却至压力为0MPa。出锅：开锅后取出培养基冷却，贮存于37培养箱中培养，经24h无杂菌生长，可保存备用。4.培养基配制、分装和灭菌时注意的问题（1）培养基熬制时边煮边搅拌，防止糊底。用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。（2）配制培养基一定按母液顺序依次加入。（3）熬制培养基过程中，先放入难溶解的琼脂及有机附加物（马铃薯、香蕉等），最后加入药剂混合液，因混合液中的有机物遇热时间长易分解失效。（4）多数植物适宜的pH在5.66.5，而培养基经高压灭菌pH一般会降低0.20.3个单位，故调节pH时应比选定pH提高0.20.3个单位。（5）分装培养基时，注意不能将培养基溶液喷洒到瓶壁口处，容易落菌污染。（6）灭菌过程中须完全排除锅内冷水汽，使锅内全部是热水蒸汽，灭菌才能彻底。（7）培养基灭菌严格按要求时间进行，如超过时间，培养基成分发生变化易失效。（8）培养基灭菌后，立即取出摆平冷却。取出过晚凝固差，影响接种转苗质量。四、无菌操作（接种）技术接种是指把无菌的植物材料切割，经无菌操作手序，放到培养基上的全部操作过程。它是组织培养过程中易于污染的一个环节，接种操作必须在无菌条件下进行。在接种前30min打开无菌操作间和超净工作台的紫外灯进行环境灭菌。照射20min后关闭紫外灯，打开风机使超净工作台处于工作状态。接种人员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等。接种人员上工作台后，用70%75%酒精擦拭双手，然后擦拭工作台面。用70%75%酒精擦拭接种工具并反复灼烧。进行外植体表面灭菌与接种：将外植体35个为一组放入70%75%的酒精溶液浸润1060S取出后再放入2%的次氯酸钠溶液浸泡1015min用无菌水反复冲洗35次（1min/次）放入无菌吸水纸上吸干水分，进行适当切割打开已准备好的培养基瓶盖或封口膜，在酒精灯无菌圈内接入外植体封口。如此反复操作，直到全部外植体接种完成。注意工具用后及时灭菌，避免交叉污染。接种完毕，清理干净工作台。标识接种材料并放入培养间培养。III.作业1.欲配制500毫升MS培养基大量元素母液，需硝酸钾多少克？2.如何制备MS培养基？3.如何进行无菌操作？第四节 植物组织培养快速繁殖技术一、授课章节第四节 植物组织培养快速繁殖技术。二、学时安排2学时。三、教学目标1掌握植物组培快繁的流程。2掌握植物组培快繁的程序。四、教学重点、难点分析重点：植物组培快繁的程序。难点：初代培养中诱导外植体生长与分化途径。五、教具电化教学设备, 各培养阶段的试管苗。六、教学方法讲授法，演示法。七、教学过程.导入本次课主要介绍的是植物组织培养快速繁殖技术。II.新课一、植物组培快繁的流程母体材料 外植体的选择 外植体的处理 外植体的表面消毒 外植体的接种 初代培养 继代培养（多次循环） 壮苗与生根培养 试管苗驯化与移栽二、植物组培快繁的程序（一）外植体的选择1.外植体选择的原则选择优良的种质 外植体一定要选择具有该品种典型特征、遗传性稳定、生长健壮、无病虫害的优良植株。选择生理状态良好的材料 尽量选择幼嫩的、生理状态良好的材料。选择生长旺盛、再生能力强的材料 在生长季节选择年幼的材料，这样的材料生长旺盛、再生力强，接种成功率高。选择来源丰富的材料 为了建立一个高效而稳定的组培快繁体系，需反复试验，所以一定要选用来源丰富的材料。选择合适的外植体大小 适宜的外植体大小：茎尖分生组织0.20.5mm，茎段长带12个节，叶片0.5cm0.5cm。2.外植体的选择就无菌短枝扦插、丛生芽培养来说，木本植物、能形成茎段的草本植物以采取茎尖和茎段比较适宜；有些草本植物植株短小或没有显著的茎，可用叶片、叶柄、花萼、花瓣作外植体。（二）外植体的处理将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗涤结束后，进入无菌操作室进行消毒接种。（三）外植体的表面灭菌按照无菌操作技术中介绍的方法，打开电源使超净工作台处于工作状态，将接种工具、消毒的玻璃器皿、无菌水、配制好的灭菌剂等放入超净工作台，接种员做好准备进入无菌操作室，点燃酒精灯，对接种工具进行灼烧灭菌。外植体每35个为一组放入7075的酒精中浸泡1060S取出后放入2的次氯酸钠溶液浸泡1015min用无菌水反复冲洗35次用已灭菌的剪刀或解剖刀将外植体切割到适当大小，准备接种。（四）外植体的接种先打开已准备好的培养基瓶盖或封口膜，将三角瓶倾斜拿在手中，使瓶口靠近酒精灯火焰，并将瓶口在火焰上方转动灼烧数秒钟。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入瓶内，轻轻插在培养基上。将叶片背面接触培养基，茎尖、茎段要按其生长极性的上下端，正放在培养基上。外植体接种以每瓶放一枚组块为宜。接完种后，将瓶口在火焰上再灼烧数秒钟，盖上瓶盖或封口膜。然后再接下一瓶，直到全部接种完毕。最后做好记录，注明处理材料的物种名称、处理方法、接种日期等。（五）培养1.培养条件（1）温度 温度是植物组织培养中的重要因素，大多数植物组织培养都在2327之间进行，一般采用25土2。（2）光照 主要表现在光强和光照时间方面。组织培养中多采用20003000Lx的光强，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。（3）湿度 影响组织培养的湿度包括以下两个方面：培养容器内的湿度和培养室内环境的湿度。一般要求培养室内要保持7080的相对湿度。（4）培养基的pH 不同的植物对培养基最适pH的要求是不同的。大多数植物适宜的pH在5.66.5之间，一般培养基皆要求5.8。（5）渗透压 培养基中由于有无机盐类、蔗糖等化合物，因此，会影响渗透压的变化。通常12个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上对植物生长有阻碍作用。（6）气体 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。接种时应避免把外植体全部埋入培养基中，以免造成缺氧。2.培养程序初代培养初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。（1）顶芽和腋芽的发育顶芽和腋芽在离体培养中都可被诱导而生长发育。从芽萌发变为幼枝，幼枝继续生长，形成新的顶芽和侧芽。再将新形成的芽切割下来继续培养，反复萌生新的枝条，在很短的时间内重复芽枝苗的再生过程，就能生产出许多再生小植株。（2）不定芽的发育由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后经再分化形成器官原基。