临床免疫学沉淀反应

第六章沉淀反应I.、*P-Z_-本章考点1. 概念2. 液相内沉淀反应3. 凝胶内沉淀反应4. 免疫浊度法概念：沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象。第一节沉淀反应的特点1. 沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。2. 沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成。如沉淀线、沉淀环。图19两种抗血清形成的沉淀带第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此产生最适比例的测定方法，常见有：1. 抗原稀释法：抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。2. 抗体稀释法：抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。3. 为了保证抗原抗体在最适比例条件下进行反应，达到最大沉淀反应的效果，就必须对抗原和抗体最佳工作浓度做出选择。将上述我们讲过的抗原稀释法和抗体稀释法结合起来就是方阵滴定法，又称为棋盘格法。从上表中可以看出，Ab用1:40稀释时，Ag则应按1:320稀释；反之，Ag按1:160稀释，则Ab应按1：20稀释。又如在进行ELISA试验时，反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原（抗体）和酶标抗体（抗原）进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件，同样需要采用方阵滴定法进行实验找出抗原和抗体最佳稀释度。二、免疫浊度法免疫浊度法本质上属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器、自动化检测系统和免疫沉淀反应相结合，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。（一）免疫浊度法原理当可溶性抗原与相应抗体在两者比例合适时，抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，如形成的复合物增加，反应液的浊度随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。按照仪器设计的不同分为透射比浊仪测定法和散射比浊仪测定法。测定方法又可分为速率法和终点法。1. 免疫透射比浊法：根据郎伯-比尔(Lambert-Beer)定律，当光线通过抗原抗体反应系统时，由于溶液中存在抗原抗体复合物，光线被吸收。吸收的量和复合物的量成正比。利用透射比浊仪测量出由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其7电度以吸光度A表示，A值反映了入射光与透射光的比率。C:溶液浓度K：常数或cdc：分子吸光系数d:光路长通常根据免疫比浊原理取多点(39点)，按Y=a+bx+cx2+dx3的3次方取回归曲线进行定标，制定剂量-反应曲线。免疫透射比浊法快速，测量可进行自动化，常用于临床体液蛋白的检测。2. 免疫速率散射比浊法：图20-2散射免疫浊度法及透射免疫浊度法示意图其原理是指一定波长的光通过溶液遇到抗原抗体复合物时，光线被折射，发生偏转。偏转角度可以从0-90，这种偏转的角度可因光线的波长和复合物大小不同而有所区别。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。同时也和散射夹角成正比，和波长呈反比。测定方法有终点法和速率法两种。终点法是在抗原-抗体反应达到平衡时，即复合物形成后作用一定时间，通常是30-60min，复合物浊度不再受时间的影响，但又必须在聚合产生絮状沉淀之前进行浊度测定。速率法是在抗原抗体结合反应的过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测最大反应的速度，即反应达到顶峰时的峰值。抗原抗体结合反应在几十秒内得出结果，峰值的高低与抗原的量成正比，峰值出现的时间和抗体浓度、抗原抗体的亲和力直接相关。速率法的灵敏度和特异性都比终点法好。但是，必须指出的是对免疫浊度法存在难以克服的钩状效应。即在定量抗体中加入抗原量达到最佳比例时，形成的IC量最大，反应速度最快。如继续加入抗原，形成IC的量不但不再增加，反而减少；反之，在定量抗原中加入抗体，在抗体过量时也会产生同样的现象。这种后带（抗原过量）和前带（抗体过量），统称为钩状效应（hookeffect）。钩状效应可以产生假象的弱阳性或假阴性结果。（二）与免疫浊度法测定密切相关的因素有：1 .抗原与抗体的比例：理想状态是抗原与抗体比例合适全部结合，事实上有困难，根据Heidelberger曲线理论，反应液中保持抗体过量时，复合物随抗原量的增加递增至抗原与抗体两者比例最合适时达高峰，因此免疫浊度法中保持抗体过量；2 .抗体的质量：应是特异性强、效价高、亲和力强、并使用R型抗血清；3 .抗原抗体反应的溶液：关键是pH及离子种类，通常用磷酸盐缓冲液作反应液；4 .增浊剂的应用：通常用非离子型亲水剂，如聚乙二醇（PEG、吐温-20等。第三节凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。凝胶支持物的种类：凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。不同分子量的物质在凝胶中扩散速度不同，藉此可用以识别不同待测物分子量的差别。1. 单向扩散试验：琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。（1）试管法：将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。（2）平板法：是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37c让其自由扩散，2448h后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。有两种计算方法：1） Mancini曲线：适用大分子抗原的和长时间扩散（48h）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系c/d2=k。（其中c为抗原浓度，d为沉淀环直径，k为常数）上排为5个不同的参考：中、下排为病人标本，下排右2为一个异常标本（出现明显扩散环）2） Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理，用半对数纸划线，浓度对数与扩散环直径呈线性关系logcd=k。（其中c为抗原浓度，d为沉淀环直径，k为常数）单向扩散试验检测时的注意点：1）抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。2）每次测定都必须作标准曲线。3）每次测定时必须用质控血清作质控。4）注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。5）应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。2. 双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，根据沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体作出定性分析。双向扩散试验也分为试管法和平板法。（1）试管法：在含有抗原的溶液和含有抗体琼脂中间，加一层普通琼脂，让下层抗体和上层抗原向中间自由扩散，在抗原、抗体浓度最适时形成沉淀线。（2）平板法：是在琼脂板上相距35mm丁一对孔，或者梅花孔、双排孔、三角孔等。在相应孔中加入抗原或抗体，待其自由扩散后，抗原、抗体形成可见的沉淀线。根据沉淀线的位置可作如下分析：抗原、抗体是否存在及其相对含量。一般沉淀线靠近抗原孔，提示抗体量大，沉淀线靠近抗体孔，提示抗原量大。抗原、抗体相对分子量的分析；抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量影响。分子量小者，扩散快，反之较慢。由于慢者扩散圈小，局部浓度较大，形成沉淀线弯向分子量大的一方。如若两者分子量相等，则形成直线。见图22。左侧沉淀线抗原分子量大于抗体，右侧沉淀线则抗体分子量大于抗原，而中间沉淀线则两者分子量相等。抗原性质的分析，受检的抗原性质可能完全相同、部分相同、完全不同，沉淀弧可分别出现完全融合、部分融合、不融合三种情况；见图23。左图：两种受检抗原（Ag-a）完全相同，形成一条完全融合沉淀线中图：左侧抗原Ag-ab,右侧抗原Ag-ac,两者都有a决定簇，抗体为双价，形成部分融合沉淀线，说明两种抗原有相关成分。右图：抗体为双价，抗原Ag-a和Ag-c完全不同。抗体效价的滴定。抗体效价是抗原、抗体经过自由扩散形成沉淀线，出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。第四节临床应用免疫沉淀法主要用于血液及各种体液中蛋白质测定，其中目前应用最广、定量比较准确的是免疫比浊法，其最大优点是简便快速、易于自动化、无放射性污染，适合大批量标本的检测。习题35单向琼脂扩散试验通常不用于检测A.IgMB.IgAC.IgGD.C3E.IgE答疑编号500734060201正确答案E（超出教材内容，见解析）答案解析现常用于单向琼脂扩散检测的项目有IgG、IgA、IgM、C3C4转铁蛋白、前白蛋白等。只要符合三个条件即可。（1）具备检测抗原的单价特异性抗血清，（2）有标准品，（3）待测物含两在1.25wg/L以上（单扩散技术的敏感度）。而IgE检测不适用单向琼脂扩散法。习题36抗原抗体反应形成明显沉淀线条件是A. 抗原显著多于抗体B. 抗体略多于抗原C. 抗原抗体比例合适D. 抗体显著多于抗原E. 抗原略多于抗体 答疑编号 500734060202正确答案C第七章免疫电泳技术本章考点1. 概述2. 免疫电泳技术3. 应用免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。第一节基本原理一、原理免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。影响因素有：电场强度；溶液pH;离子强度；电渗等。二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。影响因素有：电场强度；溶液pH;离子强度；电渗。三、常用载体有琼脂和琼脂糖凝胶。其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。第二节常用技术免疫电泳常用技术有：1. 对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。本法敏感度比双向扩散试验高816倍。图23对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性2. 火箭免疫电泳：火箭免疫电泳原理是将单向扩散试验与电泳相结合的免疫扩散技术。实质上是加速度的单向扩散。当待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动时，在抗原与抗体达到适当比例时。形成大的不溶性免疫复合物而沉淀，此沉淀物不再移动，未与抗体结合的抗原可穿过此沉淀，继续向前迁移并形成新的沉淀，随着抗原的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭状沉淀，峰形高度与抗原量成正相关。当琼脂中抗体量固定时，以不同浓度的抗原泳动的沉淀峰高度绘制标准曲线。图24火箭电泳（1）（2）（3）为标本（4）（5）（6）为标准抗原3. 免疫电泳：是区带电泳和免疫双扩散相结合的一种免疫化学技术。检测原理是在普通琼脂中央纵向挖一2.0mm宽的小槽，两侧各打一孔，将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳，各蛋白质抗原成分因分子量及电泳迁移率不同，分离成若干肉眼不可见的区带，然后将抗体放入槽内进行自由扩散，根据抗原电泳位置、含量及与抗体比例不同，而出现不同位置、不同形状和不同大小的沉淀线。待测样品与已知抗原相比较，可对待测样品的成分及性质进行分析。此技术为定性试验，目前主要用在纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定。图25免疫电泳示意图4. 免疫固定电泳：这是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。检测原理是将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上电泳后，再将抗血清直接加入电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上。参考泳道则加蛋白固定剂，作区带参考。孵育后，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。经固定后的电泳凝胶在洗脱液中漂洗，将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定的某种蛋白，氨基黑染色后观察结果。第三节免疫电泳技术临床应用免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别等方面；火箭免疫电泳作为抗原定量只能测定wg/ml以上的含量，目前较多应用于放射自显影技术；免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定，此外免疫固定电泳也用于尿液中本周蛋白的检测及入分型、脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。5. 38在对流免疫电泳中，抗体向阴性移动的原因是A. 抗体带正电B. 抗体带负电C. 扩散作用D. 电泳作用E. 电渗作用答疑编号500734070101正确答案EpH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。习题39对流免疫电泳沉淀线出现在抗体阳极一侧，说明A. 抗原强阳性B. 抗原阳性C. 抗原弱阳性D. 抗原阴性E. 与抗原抗体无关答疑编号500734070102正确答案A（见解析）答案解析对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性