《DNA的粗提取与鉴定》教案

优选精品文档共享共进共赢DNA勺粗提取与鉴定【考试说明要求】1 .制备和应用固定化酶（A）2 .酵母细胞的固定化（B）【课堂活动】基础回顾一、实验原理1. DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点，选择适当的盐浓度（如2mol/L）就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反（DNA在浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解应最小），以达到分离目的。此外，DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜,但对DNA没有影响。3. DNA的鉴定在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色,因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验材料的选取凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大，如皿（原因：DNA含量丰富，材料易得，鸡血细胞吸水易胀破）。若用动物组织如猪肝，则需研磨。三、过程1 .破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸储水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。注息：为什么加入蒸储水能使鸡血细胞破裂？蒸储水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl,有利于DNA的溶解。如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。2 .去除滤液中的杂质方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。注息：为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA能除去在高盐中不能溶解白杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA就能够除去与DN够解度不同的多种杂质。方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DN府口蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA离（6075C的恒温水浴保温1015min）。3 .DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积出皂、冷却的酒精溶液，静置23min,溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管前加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于其生中加热5min,待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变避。四、五浦项一1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。2,加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3 .二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。4 .DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。5 .盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。诊断检测1 .下列图示中能反映DNA溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是：NNCI 侬凿 md/L) A、OJ* NC1 戢心2 .在DNAg提取的实验过程中，得到白丝状物主要成分就是DNA依据是A.丝状物易溶于2mol/L的氯化钠溶液中B.丝状物溶解后，遇二苯胺（沸水浴）变蓝色C.丝状物能在约为O.14mol/L氯化钠溶液中析出D.加酒精可使溶解的丝状物再被析出3 .在“DNA勺粗提取与鉴定”实验中，向5mL血细胞液中加入20mL蒸储水的目的是A.使血细胞破裂B.防止血液凝固C.析出DNAD.使蛋白质与DN的离4 .在NaCl溶液中反复溶解、析出并过滤，就能除去DNA容液中的杂质的理由不包括（）A.用高浓度盐溶液溶解DNA能除去在高盐中不能溶解的杂质B.用低浓度盐溶液使DNAW出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质C.反复操作就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质D.反复操作就能够使各种杂质变性而沉淀析出典例引路在采用鸡血为材料对DNA进行粗提取的实验中，如果需要进一步提取杂质较少的DNA可以依据的原理是（）A.在物质的量浓度为0.14mol/L的氯化钠溶液中DNA的溶解度最小B.DNA遇二苯胺在沸水浴的条件下会变成蓝色C.DNA不溶于酒精而细胞中的一些物质易溶于酒精D.质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用有关DNA粗提取的操作，错误的是A.向溶解DNA的烧杯中加蒸储水的目的是漂洗DNA8. DNA和杂质分子在95%的冷酒精中溶解度存在差异C.提取植物细胞DNA时需在研钵中加入洗涤剂和氯化钠等试剂步骤具体措施分析选材、制备鸡血细胞液鸡血+拧檬酸钠 用离心机离心，再放 冰箱内静置鸡血红细胞,白细胞都具 行细胞核.含大垃DNA 柠檬酸钠f抗凝剂）使血 液分层，血细胞处于底部提取血细胞核物质鸡血细胞液+蒸 摘水,快速沿一个方 向搅拌Emm纱布过滤血细胞吸水涨破.快速 搅抻加速血细胞破裂过滤得到佟染色质的 谑液.送出细胞膜、细胞 器等破碎结构溶解BNA注液+ ZhmWL的 Nj心溶液10ml j（搅拌） 纱布过滤不溶杂质高盐溶液溶解DNA,去 除不溶于高盐溶液的杂 质折出含DNA的 黏稠物溶液十蒸储水.轻轻 揽抨,析出丝状物（直. 至小内增加为止）NCI溶液相当于被稀稀到 Ql lrmLL,这一浓度 F IJNA的溶解度最低而析出过滤多层纱布过滤得到含DNA的茹稠物DNA黏稠物再溶解2 tn ol/L NaCl 溶 液20mL+上述黏稠物f溶解高盐溶液溶解DNA.再 次去除不溶于高盐溶液 的杂质过渡用2层纱布过滤滤液中含DNA,去除不 溶杂质提取含杂质 较少的IJNA上述滤液+冷却的95 %酒精 50mL析出DNA.去除溶于95%冷酒精的杂质DNA鉴定丝状物十。.015mol/LNaCl 溶液 5mL + ML二聚胺,沸水浴 5mm对照组不加此 状物试管1和试管2的自 变量是有无丝状物,因变 量为有无浅蓝色出现0, 015 mol/L NaCl 溶 液溶解DNAD.提取动物细胞 DNA时可用鸡血与蒸储水混合后用玻璃棒搅拌归纳总结1.鸡血细胞的DNA提取2 .实验关键取材不用哺乳动物的血细胞（由于成熟红细胞无细胞核）。（2）获取DNA时要向鸡血细胞液加入足量的蒸储水，以便使细胞膜和核膜破裂，把核内物质释放出来。（3）实验中的搅拌，除最后一次搅拌外，其余搅拌均要朝一个方向。并且，在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步骤搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。3 .此实验过程中有几次使用蒸储水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？答：整个实验共“两次蒸储水，三次过滤，两次析出”两次蒸储水第一次：细胞吸水胀破第二次：使DNA黏稠物析出三次过滤第一次：DNA存在于滤液里第二次：DNA被留在纱布上第三次：DNA存在于滤液里过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层两次析出第一次：用0.14mol/L的NaCl溶液,含杂质多第二次：用冷却的95%的酒精4 .预冷的酒精溶液具有的优点抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解。降低分子运动易于形成沉淀析出。低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。5 .评价：观察彳提取的DNA1色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质6 .酒精的使用观察花生种子子叶细胞脂肪颗粒时，用体积分数为50%的酒精洗去浮色叶绿体色素的提取和分离实验中，用无水酒精作有机溶剂提取色素制作洋葱根尖细胞装片时，用盐酸和酒精的混和液对根尖进行解离DNA粗提取过程中，用体积分数为95%的冷却酒精可以进一步纯化DNA70%勺酒精用于消毒，如果酒的制作变式训练（多选）下列DNA粗提取的实验操作中，经离心或过滤后取上清液或滤液的有A.在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心B.在盛有血细胞的塑料烧杯中加蒸储水，快速搅拌后过滤C.在2mol/L的氯化钠溶液中放入丝状物，轻轻搅拌后过滤D.在溶有DNA的氯化钠溶液中缓缓加入蒸储水，轻轻搅拌后过滤当堂反馈1 .下列关于DNA粗提取与鉴定的说法中，正确的是A.析出DNA时要缓慢地加蒸储水，当析出黏稠物时即不再加水B.在探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，自变量是洗涤剂和食盐C.提取的DNA溶解后加入二苯胺试剂即可染成蓝色D.将含有DNA的滤液放在60c75c的恒温水浴箱中保温后过滤，能去除蛋白质杂质2 .（多）DNA粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2mL的四种溶液中，经搅拌后过滤，获得4种滤液，含DNA$少的是1蒸储水中搅拌后过滤滤?夜E22mol/L的NaCl溶液搅拌后过滤滤?夜F3O.14mol/L的NaCl溶液中搅拌后过滤滤?夜G4冷却的95%的酒精溶液中搅拌后过滤滤?夜HA.滤液EB.滤液FC.滤液GD.滤液H3 .在DNA勺粗提取与鉴定试验中，有两次DNA勺沉淀析出，其依据的原理是DNABNaCl的物质的量的浓度为O.14mol/L时，溶解度最低DNAB冷却的体积分数为95%的酒精中能沉淀析出A.两次都是B.两次都是C.第一次是，第二次是D.第一次是，第二次是4 .（多选）有关DNA提取的操作，正确的是A.盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料容器B.将鸡血细胞液与蒸储水混合，用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，释放DNAC.向溶解DNA勺烧杯中加蒸储水的目的是漂洗DNAD.用漏斗和滤纸过滤析出的DNA得到DNA占稠物5.在DNA粗提取实验中，为得到含DNA的黏稠物，某同学进行了如下操作：在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，经离心后，除去血浆留下血细胞备用。取510mL血细胞放入50mL的塑料烧杯中，并立即注入20mid.015mol/L的氯化钠溶液，快速搅拌5min后经滤纸过滤，取得其滤液。滤液中加人40mL2mol/L的氯化钠溶液，并用玻璃棒一个方向快速搅拌lmin。上述溶液中缓缓加人蒸储水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，同时加蒸储水，直到溶液中出现丝状物为止，再进行过滤而得到含DNA的黏稠物。实验结果是：所得含DNA的黏稠物极少，导致下一步实验无法进行。请指出并改正该同学的实验操作上的三个错误：（3分）（标明浓度）；提取含杂质较少的 DNA的（2分）DNA ,而用动物的肝脏组织作为（2）按正确操作提取和过滤黏稠物后，再溶解黏稠物所用的溶剂为方法是。（3）鉴定DNA的试剂是试剂，DNA鉴定时对照实验的设置方法为。（4）采用牛或羊的血液做实验，取材方便，但即使正确操作也无法提取到实验材料，实验结果良好，原因是，实验中最好增加一步骤为。（10分）（1）0.015mol/L的氯化钠溶液应改为蒸储水；滤纸应改为纱布；直到溶液中出现丝状物为止应改为直到溶液中丝状物不再增加为止（每项1分）（2）2mol/L的NaCl溶液加入冷却的、体积分数为95%的酒精（3）二苯胺向试管中只加0.015mol/L的NaCl溶液和二苯胺试剂，不加DNA,沸水浴（4）哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核研磨提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5mL10mL注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸储水20mL,同时用玻璃棒充分搅拌5min,使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500ml.取其滤液。溶解细胞核内的DNA各氯化钠的物质的量浓度为2mol/L40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min,使其混合均匀，这时DNA溶液中呈溶解状态析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸储水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸储水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸储水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol/L）滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液20mL用钝头镣子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNADNA的鉴定6 / 5