盐霉素高产菌的推理选育

盐霉素高产菌的推理选育【摘要】依照盐霉素生物合成途径对其产生菌进行了推理选育。在常规诱变基础上选用丁酸作为挑选剂检出所需要的突变株，成功取得三株高产菌株3233#、3244樨口3250#,其效价比动身菌株F21#别离提高了34%嗨口39%【关键词】盐霉素；诱变剂；挑选剂；推理选育RationalscreeningforhighsalinomycinproducingstrainChuXiaohe1,2,WangPu1andSongYouli2(1CollegeofPharmaceuticalScience,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032;2ZhejiangShenghuaBiokBiologyCo.,Ltd.,Huzhou313220)ABSTRACTAsalinomycinproducingstrain,namely#F21,wastreatedandmutatedusingphysicalfactorofUVandchemicalfactorofethylmethanesulfonate(EMS)respectivelywithreferencetotheinferentialscreeningtheory.Thepositivemutantswereobtainedfromtheplateswithbutyricacidforscreening.Threemoststableandproductivestrainsof#3233,#3244and#3250werevalidatedin30m3fermentor.Theresultsshowedthatthetitresofmutant#3233,#3244and#3250were34%,%and39%respectively,andhigherthanthatoftheoriginalstrain#F21.KEYWORDSSalinomycin;Mutagen;Screeningreagent;Rationalscreening盐霉素(salinomycin)是由白色链霉菌(Streptomycesalbus)发酵产生1。日本早已证明盐霉素有很广的抗球虫谱，对鸡的柔嫩、迫害、堆型、脆弱、巨型和哈氏球虫均有效，50mg/kg就有明显抑制作用2,3。另外，盐霉素对大多数革兰阳性菌有抑制作用，对梭菌等革兰阳性厌氧菌也有较强的抑制作用4。盐霉素以其高效、低残留、低耐药性活着界几十个国家取得许可利用5。目前关于盐霉素的研究要紧集中在其应用研究方面，对其菌种及工艺研究的报导较少。盐霉素为典型的含聚醍链(polyetherchain)结构的抗生素，通过乙酸和丙二酸的缩合进行生物合成6,7。盐霉素为组成聚醍链的丙二酸被甲基和乙基高度取代的线性脂族分子，沿着分子链有一系列的四氢咄喃环和四氢味喃环8。研究说明，盐霉素生物合成进程和其他聚醍系抗生物质相同，即C2C4的脂肪酸直接进入盐霉素合成，为6mol乙酸、6mol丙酸和3mol丁酸缩合而成(图1),其中丁酸为合成启动子9。本文依照盐霉素分子结构和生物合成途径，运用推理选育理论，通过选用丁酸R=CH3甲基盐霉素；R=H,盐霉素作为挑选剂进行高产菌选育，为进一步工业化生产水平奠定基础。1材料与方式动身菌株盐霉素产生菌F21#由浙江升华拜克生物股分科研中心提供。培育基斜面培育基（g/L）甘油18,酵母浸粉，氯化钠，硝酸钠，琼脂22;pH自然。摇瓶种子培育基（g/L）蔗糖，玉米浆25,磷酸二氢钾，豆油，轻质碳酸钙，酵母膏粉；。摇瓶发酵培育基（g/L）葡萄糖，棉籽饼粉，黄豆粉，酒石酸镂，轻质碳酸钙，氯化钾，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钠，豆油140;。种子罐培育基（g/L）蔗糖，棉籽饼粉，黄豆粉，酒石酸镂，轻质碳酸钙，氯化钾，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钠，豆油210;。发酵培育基(g/L)葡萄糖，棉籽饼粉，黄豆粉，酒石酸铵，轻质碳酸钙，氯化钾，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钠，豆油240；。实验方式(1)紫外线(UV)诱变刮取适量白色链霉菌的抱子于生理盐水中，振荡、打散抱子，通过滤制成单胞子悬液，取68ml单抱子悬浮液放入灭菌的9cm培育皿内，紫外灯下边搅拌边照射。紫外灯功率15W照射时刻别离为0、10、20、30和40s,照射距离为30cm(2)甲基磺酸乙酯(EMS)诱变用磷酸缓冲液制成抱子悬浮液，吸取8ml孢子悬浮液放入带盖易密封小瓶中待用。用吸球及移液管吸取的10mol/LEMS原液放入10ml的磷酸缓冲液中制成LEMS溶液，再从LEMS容液中吸取2ml放入盛放8ml抱子悬浮液带盖小瓶中，密封,置30培育箱中，每隔3min振荡1次。别离取不同时刻的处置液，稀释，涂布双碟，计算死亡率、变异率(甲基磺酸乙酯的诱变成效与溶液质量有关，而甲基磺酸乙酯不稳固，易发生水解作用而生成有毒而无诱变作用的化学物质，因此，其溶液需现配现用)。(3)挑选方式经紫外或EMS诱变处置后的抱子悬液经稀释后涂布于含必然浓度丁酸的平板中进行分离，再挑取单菌落制作小斜面，摇瓶培育验证效价。(4)效价测定采纳化学法10和高效液相色谱法。在本实验范围内，经数据分析，高效液相色谱法(Y)与化学测定法(X)大致量的关系为：Y=(R2=(5)发酵及分析采纳两级发酵。种子培育条件33c,230r/min,培育28h左右，30吨大罐放大三罐批，接种量10%在33c,230r/min发酵113116h。实验结果取3个重复的平均值。发酵液分析采纳高效液相色谱分析11。2结果与讨论盐霉素产生菌选育系谱以F21#为动身菌株，经2轮紫外诱变加丁酸挑选取得221#菌株，221#再经EM潴变和丁酸挑选取得3株高产菌株3233#、3244樨口3250#。经此进程处置后挑选取得的突变菌株221#、3233#、3244樨口3250#即可进行发酵产量实验紫外线与EMS寸盐霉素菌株的诱变效应在采纳丁酸作为挑选剂进行推理选育前，第一考察常规诱变即紫外线EMS寸菌株的效应。实验结果说明，盐霉素菌株经紫外照射时刻20s后存活率在10姒下，照射40s致死率为EM弹独处置盐霉素菌株18s致死率达98%在同一剂量的情形下，EMS寸盐霉素产生菌的诱变发生正变率大大高于负变率，但随着EMSJ量提高，盐霉素产生菌正变率也呈下降趋势，故本实验中EMSJ用的剂量为1%丁酸作为盐霉素挑选剂的推理选育12(1)UV诱变后丁酸挑选剂用量确信实验在分析盐霉素菌株代谢途径的基础上，以推理选育为大体理论，利用自然选育为对照，别离选取UV+T酸%UV-+T酸%UV+T酸%寸动身菌株进行选育，各挑取10个菌落进行摇瓶实验(表1),结果显示，以丁酸作为挑选剂能够显著提高盐霉素效价，较自然选育结果别离提高了17%34%口23%故UV+丁酸渤最正确剂量。咱们在此剂量上选育出突变菌株221#进行下一步实验。(2)EMS+丁酸挑选剂实验在选育出菌株221#后，一样以自然选育为对照，在诱变剂EMSJ量豚件下，别离采纳含丁酸附口表1UV+T酸挑选剂用量实验进行选育，结果见表2。从结果能够看出，以EMS+酸%H介为最高45600区g/ml,而丁酸剂量大于%寸发酵效价有下降的趋势，但丁酸剂量为%寸效价不超过40000Wg/ml,推测EMS和丁酸有必然的协同效应，具体协同结果还需要进一步研究。经此轮选育后，以自然选育为对照，一样取平均值，结果显示别离提高了%和经实验证明，选用EMS+酸%最正确诱变剂量，在此基础上选育出了高产菌株3233#、3244樨口3250#。(3) 丁酸作为盐霉素挑选剂的推理选育要选育高产菌株，除诱变剂作用外，还与挑选剂有关。本文依照盐霉素的生物合成途径的特点，选用丁酸作为挑选剂进行实验。丁酸既是盐霉素分子结构组成单元，也是其生物合成途径中的小分子前体物质，同时又可作为盐霉素发酵的有效碳源，可提高盐霉素菌株发酵效价。丁酸作为启动子仍是盐霉素合成不可缺少的组分，实验结果说明，在含有丁酸作为挑选剂的平板上生长的菌株比在不含任何挑选剂的平板上生长的菌株，其发酵效价普遍有较大提高，因此选用丁酸作为盐霉素高表2EMS于酸挑选剂用量实验产菌株的挑选剂是合理的。发酵及其产物分析通过推理选育的菌株进行发酵产量实验，咱们采纳221#菌株在30吨大罐上试产(三批)，221#菌株比动身菌株F21有较大的提高，与同期生产罐平均效价相较，效价提高了10姒上。同时，通过动身菌株F21与最终挑选的菌株3233#、3244琳口3250#发酵产量进行大量量生产比较实验，F21菌株产量为32000以g/ml,而挑选后的菌株3233#效价为42940区g/ml,3244#为46360g/ml,3250#为44460区g/ml,推理挑选的高产菌株别离比动身菌株F21#别离提高了34%听口39%进一步对发酵液进行高效液相色谱分析（图略），结果显示菌株3233#、3244琳口3250#动身菌株F21#发酵液相同，且峰面积比例均在%迄间，成份比例超级接近，说明盐霉素组分未发生转变，进一步证明了咱们挑选的高产菌株代谢途径未发生转变。3结论通过实验，咱们要紧得出以下结论：（1）所获三株高产菌（3233#、3244樨口3250#）的效价比动身菌株F21#别离提高了34%咐口39%为进一步工业生产奠定了基础。（2）推理选育证明，适合的挑选剂（丁酸）和诱变剂在高产菌株选育中有着一样重要的作用。3233#、3244樨口3250#三株高产菌株选育是诱变剂和挑选剂丁酸协同作用的结果(3)对高产菌株发酵产物分析证明组分未发生转变，但产物的表达量有较大幅度的提高，菌株的生物代谢途径与动身菌株相同。(4) 本实验所用挑选剂丁酸为盐霉素生物合成的前体，其适合用量及适当添加时刻有待进一步实验。【参考文献】 1 MiyazakiY,ShibuyaM,SugawaraH,etal.Salinomycin,anewpolyethertypeantibioticJ.JAntibiot,1974,27(11):814821. 2 MiyazakiY,ShibataA,YahagiT,etal.MethodofproducingpolyethertypeantibioticsaswellassalinomycinantibioticsM.1978. 3 徐奇友，许红.盐霉素及其在饲料中的应用J.饲料博览，2002,(6):3132.4佟建民，沈建忠.饲用抗生素研究与应用M.北京：中国农业大学出版社，2000:117.5刘秀全.高效多功能饲料添加剂盐霉素J.饲料工业，1997,18(4):911.6储炬，李友荣.现代工业发酵调控学M.北京：化学工业出版社，2002:187199.7顾觉奋，祝兴伟.组合生物合成聚酮类药物研究进展J.中国新药杂志，2006,15(19):16201625.8 LynenF.BiosyntheticpathwaysfromacetatetonaturalproductsJ.PureApplChem,1967,14(1):137.9 JohnW,Westley.PolyetherAntibiotics.NeWYork:MarcelDecker,1982:43102.10贾晓静.吸收系数法测定盐霉素钠含量J.中国兽药杂志，2004,38(8):1920. 11 TheUnitedStatesPharmacopeialConvention,Inc.TheUnitedStatesPharmacopeial(26Ed)S.RochvitlleMD:theUnitedStatedPharmacopeialConvention,Inc.,2003:12481250. 12 12金志华，吴亚铭，岑沛霖.普那霉素产生菌的推理选育J.中国抗生素杂志，2004,29(5):275278.