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1 DNA1 DNA、蛋白质的分离和提取的原理是什么？、蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异根据蛋白质各种特性的差异如：分子的形状和如：分子的形状和大小大小、所带、所带电荷的性质电荷的性质和和多少多少、溶解度溶解度、吸附的性质和对其他分子的、吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质思考思考: :2 2人们用来提取人们用来提取DNADNA和蛋白质的材料是什么？和蛋白质的材料是什么？ 为什么选择这样的材料？为什么选择这样的材料？ 鸡的红细胞鸡的红细胞有细胞核，含有有细胞核，含有DNA高高，便，便于进行于进行DNA的提取。的提取。 人人的的红细胞红细胞无细胞核，结构简单，含无细胞核，结构简单，含血红血红蛋白丰富蛋白丰富，便于提取血红蛋白。有，便于提取血红蛋白。有颜色颜色（红（红色）便于实验的色）便于实验的观察观察。3 3、如何保证分离得到的血红蛋白具有正常、如何保证分离得到的血红蛋白具有正常的结构和功能，以便于研究？的结构和功能，以便于研究？ 利用利用缓冲液缓冲液准确模拟生物体内的准确模拟生物体内的PHPH环境环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于科学保证血红蛋白的正常结构和功能，便于科学研究研究（活性活性）4 4、说出人体血液中的缓冲对？、说出人体血液中的缓冲对？ 他们的作用是？他们的作用是？ NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO35、分离蛋白质的方法：、分离蛋白质的方法： 凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：2 2、凝胶：、凝胶：由多糖类化合物构成的，由多糖类化合物构成的， 如：如：葡聚糖或琼脂糖葡聚糖或琼脂糖内含许多贯穿的通道。内含许多贯穿的通道。 是根据是根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋白质分离蛋白质的有效方法的有效方法 1 1、概念：、概念：一些微小多孔的球体一些微小多孔的球体3 3、具具体体过过程：程：4 4、原理：、原理： 相对分子质量较小相对分子质量较小的蛋白质的蛋白质容易进入容易进入凝胶凝胶内部通道，路程内部通道，路程较长较长，移动，移动速度较慢速度较慢 相对分子质量较大相对分子质量较大的蛋白质的蛋白质无法进入无法进入凝胶凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短较短，移动移动较快较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离（二）电泳：（二）电泳： 指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程1 1、概念：、概念：2 2、原理：、原理： 利用待分离样品中各种分子利用待分离样品中各种分子带电性质的差带电性质的差异异、分子本身的大小分子本身的大小、形状的不同形状的不同，使带电，使带电分子产生不同的迁移速度分子产生不同的迁移速度从而实现样品中各种分子的分离从而实现样品中各种分子的分离 许多重要的生物大分子，许多重要的生物大分子，如多肽、如多肽、核酸等核酸等都具有都具有可解离的基团可解离的基团，在一定的在一定的PH下下，这些基团会带上，这些基团会带上正电或负电正电或负电。在电场。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷电荷相反的方向相反的方向移动移动3 3、举例：、举例：4 4、常用电泳方法：、常用电泳方法：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质相对分子量测定蛋白质相对分子量常用常用:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳的迁移率完全取决于电泳的迁移率完全取决于 分子量的大小分子量的大小6、 实验操作：实验操作：蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1 1）样品处理：）样品处理：（2 2）粗分离：）粗分离：（3 3）纯化：）纯化：（4 4）纯度鉴定：）纯度鉴定：样品处理包含的步骤样品处理包含的步骤1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白用生理盐水洗涤用生理盐水洗涤,低速（低速（500r/min)短时间短时间(2min)离心离心,用胶头吸管吸出黄色血浆。用胶头吸管吸出黄色血浆。2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：高速（高速（2000r/min)长时间长时间(10min)离心分离心分层层,滤纸过滤去除脂溶性沉淀层滤纸过滤去除脂溶性沉淀层,分液漏斗分出红色透明液体。分液漏斗分出红色透明液体。重复重复3次次思考：思考：1、能用蒸馏水洗涤吗？为什么？、能用蒸馏水洗涤吗？为什么？2、假如洗涤次数少、离心速度高、假如洗涤次数少、离心速度高、 时间过长会有什么影响？时间过长会有什么影响？3、离心后的上清液是什么？含有蛋白质吗？、离心后的上清液是什么？含有蛋白质吗？无法除去血浆蛋白、无法除去血浆蛋白、白细胞等一同沉淀达不到分离效果白细胞等一同沉淀达不到分离效果(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：40%40%体积的甲苯：体积的甲苯：置于磁力搅拌器充分搅拌置于磁力搅拌器充分搅拌蒸馏水：蒸馏水：向向红细胞红细胞中中溶解细胞膜溶解细胞膜吸水胀破吸水胀破加速细胞破裂加速细胞破裂加入加入分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂溶性物质沉淀白色脂溶性物质沉淀层层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀暗红色沉淀物物2粗分离采用的方法？目的？原理是？粗分离采用的方法？目的？原理是？ 透析：透析： 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中装入透析袋并置于磷酸缓冲液中 （PH为为7.0）透析。）透析。 目的：目的：除去小分子杂质除去小分子杂质 透析原理：透析原理： 小分子杂蛋白可以通过透析袋小分子杂蛋白可以通过透析袋 大分子蛋白质留在透析袋内大分子蛋白质留在透析袋内3.3.纯化：纯化： 是利用是利用凝胶色谱法凝胶色谱法将将相对分子质相对分子质量大量大的杂质蛋白除去的杂质蛋白除去1 1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作凝胶色谱法的实验操作凝胶色谱法的实验操作: :2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填注：注： 装填时不能装填时不能有气泡存在：有气泡存在： 会搅乱洗脱液会搅乱洗脱液中蛋白质的洗中蛋白质的洗脱次序，降低脱次序，降低分离效果分离效果3 3）样品的加入和洗脱）样品的加入和洗脱: :调整缓冲液面：调整缓冲液面：与凝胶面平齐与凝胶面平齐 操作操作: : 打开下端出口，使柱内打开下端出口，使柱内凝胶面上凝胶面上的缓冲液的缓冲液缓慢下缓慢下降降到与到与凝胶面平齐凝胶面平齐，关闭，关闭出口出口滴加透析后的样品：滴加透析后的样品：贴壁环绕加样，加到色谱柱的顶端贴壁环绕加样，加到色谱柱的顶端同时不要破坏凝胶面同时不要破坏凝胶面洗脱：磷酸缓冲液洗脱：磷酸缓冲液样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：如果红色带均匀一致地移动，如果红色带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。4 4、纯度鉴定的方法：、纯度鉴定的方法：常用常用: 1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳、醋酸纤维薄膜电泳凝胶色谱法分离蛋白质的依据是凝胶色谱法分离蛋白质的依据是A. 对其他分子的亲和力对其他分子的亲和力 B. 溶解度溶解度 C. 所带电荷多少所带电荷多少 D. 相对分子质量的大小相对分子质量的大小 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是 A. 糖类化合物糖类化合物 B. 脂质脂质 C. 蛋白质蛋白质 D. 核酸核酸DA将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是液时，第二层是 A. 甲苯甲苯 B. 血红蛋白水溶液血红蛋白水溶液 C. 脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀其他杂质的沉淀C下列操作正确的是下列操作正确的是A. 分离红细胞时采用低速长时间离心分离红细胞时采用低速长时间离心 B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可水就可C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. 透析时要用透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，的磷酸缓冲液，透析透析12hD下列有关提取和分离血红蛋白的程序叙述下列有关提取和分离血红蛋白的程序叙述错误的是错误的是A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取的杂质，此为样品的粗提取C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化杂质蛋白除去，即样品的纯化D. 可通过可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度血红蛋白的纯度B下列说法不正确的是下列说法不正确的是A. 血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加液的体积，再加40体积的甲苯，充分搅体积的甲苯，充分搅拌拌B. 血红蛋白溶液离心后分为血红蛋白溶液离心后分为4层，第层，第1层为层为白色薄层固体白色薄层固体C. 血红蛋白溶液离心后分为血红蛋白溶液离心后分为4层，第层，第4层层为暗红色沉淀物为暗红色沉淀物D. 血红蛋白溶液离心后分为血红蛋白溶液离心后分为4层，第层，第3层层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液B样品的加入和洗脱的叙述正确的是样品的加入和洗脱的叙述正确的是A. 先加入先加入1ml透析后的样品透析后的样品 B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出C. 如果红色带均匀一致的移动，说明色如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功谱柱制作成功 D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水洗脱时可以用缓冲液也可以用清水C样品的加入和洗脱的操作不正确的是样品的加入和洗脱的操作不正确的是A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上缓冲液缓慢下降到凝使柱内凝胶面上缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面胶面的下面B. 加样后，打开下端出口，使样品渗加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内入凝胶床内C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口下端出口D. 用吸管小心的将用吸管小心的将1ml透析后的样品透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是理过程中，分析无误的是A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过低，时间过短，白洗涤时离心速度过低，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果细胞等会沉淀，达不到分离的效果C洗涤过程选用洗涤过程选用0.1的生理盐水的生理盐水D透析的目的是去除样品中相对分子质透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质量较小的杂质D红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，回答下列有关问题：分离血红蛋白，回答下列有关问题： （1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是加入柠檬酸钠的目的是_。以上所述的过程即是样品处理，它包括以上所述的过程即是样品处理，它包括_ _、_、分离血红蛋白溶液。、分离血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是透析的目的是_。透析的原理是透析的原理是_。（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是？定。样品纯化的目的是？血红蛋白有什么特点？这一特点对进行蛋白血红蛋白有什么特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？质的分离有什么意义？血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作验操作 1 1、在上个世纪、在上个世纪5050年代，酶已经大规模地应年代，酶已经大规模地应用于各个生产领域，到了用于各个生产领域，到了7070年代又发明了年代又发明了固定化酶与固定化细胞技术。在实际生产固定化酶与固定化细胞技术。在实际生产中，固定化酶技术的优点是中，固定化酶技术的优点是 与固定化酶与固定化酶技术相比，固定化细胞固定的是技术相比，固定化细胞固定的是 酶。酶。在制备固定化酵母细胞的实验中，常用的在制备固定化酵母细胞的实验中，常用的包埋材料是包埋材料是 。 另一同学运用另一同学运用PCRPCR技术，准备对分离得到的大肠杆菌一个技术，准备对分离得到的大肠杆菌一个DNADNA分子进行体外扩增。他往扩增仪中加分子进行体外扩增。他往扩增仪中加入模板入模板DNADNA、四种脱氧核苷酸，此外还应、四种脱氧核苷酸，此外还应加入加入 和和 。DNADNA体外扩增过程包括了体外扩增过程包括了三个连续的步骤分别是变性、三个连续的步骤分别是变性、 和和 。 还有同学将大肠杆菌破碎并提取得到大肠杆菌蛋白质，还有同学将大肠杆菌破碎并提取得到大肠杆菌蛋白质，一同学利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分一同学利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子的白质分子的 、 以及分子的形状等。而另一位以及分子的形状等。而另一位同学则利用凝胶过滤法分离蛋白质（下图），他在操作同学则利用凝胶过滤法分离蛋白质（下图），他在操作中加样的正确顺序是中加样的正确顺序是 。待蛋白质接近色柱底端时，。待蛋白质接近色柱底端时，用试管连续收集流出液。先收集到的蛋白质与后收集到用试管连续收集流出液。先收集到的蛋白质与后收集到的蛋白质的区别是的蛋白质的区别是 。缓缓冲冲液液样样品品样样品品样样品品
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