高考一轮课程生物 全国通用版 基因工程教案

2019年高考一轮复习 基因工程教材版本全国通用课时说明2课时知识点基因工程的原理和技术，基因工程的应用和发展复习目标1. 基因工程的诞生2. 基因工程的原理及技术（含PCR技术）3.基因工程的应用4. 蛋白质工程5. DNA的粗提取与鉴定复习重点1. DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。2. 基因工程基本操作程序的四个步骤。3.基因工程在农业和医疗等方面的应用。4. 蛋白质工程的原理。复习难点1. 基因工程载体需要具备的条件。2. 从基因文库中获取目的基因。3.利用PCR技术扩增目的基因。4. 基因治疗。5. 蛋白质工程的原理。一、自我诊断 知己知彼1.下图表示通过cDNA过程获得目的基因并利用PCR扩增过程的示意图。据图分析，下列有关叙述错误的是()A. 催化过程的酶是RNA聚合酶B. 过程不需要DNA解旋酶C. 过程需要两个相同的引物D. 催化过程的酶都是DNA聚合酶，均须耐高温2.将经过扩增的DNA和质粒用相同的限制酶进行如右图所示的切割，电泳得到纯净的B片段和D片段，将两种片段置于适宜的缓冲液中用DNA连接酶处理。如果只考虑两个片段的环状连接，则能形成不同核苷酸序列的环状DNA的种类是()A. 6种 B. 3种 C. 2种 D. 1种3.我国科学家屠呦呦因青蒿素的研究荣获2019年诺贝尔生理学和医学奖。青蒿素是目前世界上最有效的治疗疟疾药物，为青蒿植株的次级代谢产物，其化学本质一种萜类化合物，其生物合成途径如图1所示。正常青蒿植株的青蒿素产量很低，难以满足临床需求，科学家为了提高青蒿素产量，将棉花中的FPP合成酶基因导入了青蒿植株并让其成功表达，获得了高产青蒿植株，过程如图2所示。图1图2(1) 研究人员从棉花基因文库中获取FPP合成酶基因后，可以采用_技术对该目的基因进行大量扩增，该技术除了需要提供模板和游离的脱氧核苷酸外，还需要提供_、_等条件。(2) 图2中的为_，形成过程中需要_等酶；棉花FPP合成酶基因能够和质粒连接成的主要原因是_。(3) 若不能在含有抗生素Kan的培养基上生存，则原因是_。(4) 由题意可知，除了通过提高FPP的含量来提高青蒿素的产量外，还可以通过哪些途径来提高青蒿素的产量？(试举一例)_。4.p53基因是人体内一种抑癌基因。该基因编码的p53蛋白可对癌变前的DNA损伤进行修复，使其恢复正常，或诱导其进入休眠状态或细胞凋亡，阻止细胞癌变。“今又生”是我国首创的基因治疗药物之一，是世界首个获准上市的基因治疗药物，其核心成分是利用腺病毒和人p53基因拼装得到的重组病毒。“今又生”药物中的腺病毒经基因工程改造后，在宿主细胞内不能复制，不能整合到染色体上。请回答下列问题：(1) 将p53基因与腺病毒拼装成重组病毒，需要用到的工具酶有_。常用的基因工程载体除动植物病毒外，还有_。(2) 限制酶能将特定序列的核苷酸之间的_键切开，形成_末端。(3) 在“今又生”的生产中，科学家选择性地放弃了一般载体都应该具有的_，以获得更高的安全性能。p53基因应插入载体的_之间，以便于基因的表达。(4) p53基因的大量扩增可以采用PCR技术，该技术中需使用的一种特殊的酶是_。下图是需要扩增的p53基因在DNA中的位置示意图，扩增过程需要_种引物。n次循环之后，只含目的基因的片段占所有扩增产物的比例为_。5.白僵菌可感染农业害虫，常作为防治害虫的菌剂。由于白僵菌对除草剂草丁膦敏感且杀死害虫的能力较弱，科研人员对其进行基因工程改造，流程如下图所示，请回答有关问题：(1) 苏云金芽孢杆菌产生的毒蛋白，能有效杀死害虫。已知该基因的全部序列，科研人员可通过_法和PCR技术获得大量毒蛋白基因片段。据图分析，将毒蛋白基因和质粒连接获得重组质粒1的过程需要用到的工具酶是_。(2) 重组质粒1和Bar基因(草丁膦抗性基因)各自用Xba酶处理，得到酶切片段。重组质粒1的酶切片段再用去磷酸化酶处理，使末端游离的磷酸基团脱离，目的是防止_。将未用去磷酸化酶处理的Bar基因与重组质粒1连接，获得重组质粒2。获得的重组质粒2是下图中的_。(3) 将重组质粒2与感受态的白僵菌菌液混合进行转化，重组质粒2在白僵菌细胞内被修复。一段时间后用含有_的平板培养基进行筛选，获得含有Bar基因的重组白僵菌。(4) 提取上述重组白僵菌全部mRNA，加入_酶，获得cDNA，再加入毒蛋白基因引物进行PCR反应，根据是否有相应产物生成判断毒蛋白基因在白僵菌体内是否完成_。(5) 科研人员将重组白僵菌喷涂于植物叶片上，以此饲喂饥饿处理的害虫，记录单位时间内的_，以判断重组白僵菌的杀虫效果。【答案】1.ACD 2.A 3.(1) PCR引物热稳定的DNA聚合酶(2) 基因表达载体(重组质粒)限制酶和DNA连接酶切割后具有相同的黏性末端(3) 重组质粒没有导入农杆菌(4) 抑制SQS基因的表达(或增强ADS基因的表达)4.(1) 限制酶和DNA连接酶质粒和噬菌体衍生物等 (2) 磷酸二酯黏性末端或平(3) 复制原点启动子和终止子(4) Taq酶2(2n2n)/2n5.(1) 人工合成(或“化学合成”)Nco、BamH和DNA连接酶(限制酶和DNA连接酶)(2) 重组质粒1酶切片段自身连接(或“相互连接”)C(3) 草丁膦(4) 逆转录转录(5) 死亡害虫数二、温故知新 夯实基础知识点1基因工程的工具与操作程序1.分析基因工程的概念(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：体外。(3)操作水平：分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体体内表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。2.巧辨基因工程操作工具(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。3.比较与DNA有关的酶(1)五种相关酶的比较作用底物作用部位形成产物限制酶DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA连接酶DNA片段磷酸二酯键重组DNA分子DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNADNA解旋酶DNA分子碱基对间的氢键形成脱氧核苷酸单链DNA(水解)酶DNA分子磷酸二酯键游离的脱氧核苷酸(2)限制酶和DNA连接酶之间的关系图示4.对载体的分析条件目的稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择5.观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序（1）获取目的基因 从基因文库中获取：即用限制酶进行切割、分离（a）直接分离 从cDNA文库中获取：即利用mRNA反转录形成 利用PCR扩增技术：获取大量目的基因（b）人工化学合成：适用于分子较小的基因。（2）基因表达载体的构建基因工程的核心(a)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(b) 基因表达载体组成 目的基因 启动子：为RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录mRNA 终止子：使转录终止的一段有特殊结构的DNA短片段 标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因(c)构建过程（3）将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子（4）目的基因的检测与鉴定【提醒】(1)目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。(3)原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。(4)一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。(5)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。(6)不熟悉标记基因的种类和作用：标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。(7)对受体细胞模糊不清：受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。(8)还应注意的问题有：基因表达载体中，启动子(DNA片段)起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)终止密码子(RNA)。基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。知识点2基因工程的应用与蛋白质工程1.有关基因工程应用的易错点动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。DNA分子作探针进行检测时应检测单链，即将待测双链DNA分子打开。Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。基因治疗后，缺陷基因没有改变。基因治疗是把正常基因导入受体细胞中，以表达正常产物从而治疗疾病，对原来细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变。2.蛋白质工程(1)概念理解基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。操作：基因修饰或基因合成。结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。目的：满足人类的生产和生活的需求。(2)操作过程：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)基因表达产生需要的蛋白质。【提醒】(1)对蛋白质分子进行改造，其本质是改变其基因组成。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质分子还是无法遗传。(2)蛋白质工程的实质是根据蛋白质的结构，创造新基因或者改造老基因，是基因工程的发展与延续。(3)蛋白质工程与DNA分子重组技术是分不开的，常用到基因工程工具酶，如限制酶和DNA连接酶。3.乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较比较项目乳腺生物反应器工程菌基因结构动物基因的结构与人类基因的结构基本相同细菌或酵母菌等生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异基因表达合成的药物蛋白与天然蛋白质相同细菌细胞内没有内质网、高尔基体等，产生的药物蛋白可能没有活性受体细胞哺乳动物的受精卵微生物细胞生产条件不需严格灭菌，温度等条件对其影响不大需严格灭菌，需严格控制工程菌所需的外界条件药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞中提取4.基因治疗与基因诊断原理操作过程进展基因治疗基因表达把正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用5.基因工程与蛋白质工程的比较项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质的功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列推测相对应的脱氧核苷酸序列合成DNA表达出蛋白质获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果生产自然界中没有的蛋白质一般是生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过基因修饰或基因合成实现三、典例剖析 思维拓展考点一 基因工程的工具与操作程序例1为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（ ）A用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒B用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞C在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上【答案】C【解析】用限制性核酸内切酶EcoRI处理目的基因和质粒，可以使目的基因两侧和质粒产生相同的黏性末端，再用连接酶把切口连起来就构建成重组质粒，A正确；农杆菌转化法适用于双子叶植物或裸子植物，菊花属于双子叶植物，故可用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B正确；质粒中含有潮霉素抗性基因，被转化的菊花细胞只对潮霉素具有抗性，在培养基中添加卡那霉素，不能筛选被转化的菊花细胞，C错误；检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上，可采用DNA分子杂交技术，D正确。【易错点】基因工程操作流程。【方法点拨】本题考查基因工程的相关知识，掌握基因工程操作流程及各个操作依据的原理是正确解答该题的关键。例2在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（ ）A.用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞B.用选择培养基筛法导入目的基因的细胞C.用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合D.用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽【答案】C【解析】农杆菌侵染细菌是基因工程中常常用到的把目的基因导入植物细胞的方法，A正确；目的基因是否导入了细胞，需要在选择培养基上进行筛选，B正确；在植物细胞组织培养的过程中，需要调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，来达到对其脱分化和再分化的控制，D正确；在农杆菌侵染植物细胞的过程中并没有涉及到原生质体的融合，所以C错误。【易错点】基因工程操作程序和植物细胞工程【方法点拨】解决本题必须明确土壤农杆菌转化法培育转基因植株的程序有：获取目的基因 目的基因与Ti质粒结合形成重组质粒 将重组质粒导入土壤农杆菌 用土壤农杆菌感染植物细胞 检测是否导入目的基因并鉴定是否成功表达 通过植物组织培养技术培养 获得转基因植株。例3真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题：（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_。（2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_（答出两点即可）等优点。（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是_（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。【答案】（1）基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A （2）噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 （3）繁殖快、容易培养 （4）蛋白A的抗体 （5）DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体【解析】（1）基因A的编码区中有内含子，在真核生物细胞内把内含子转录来的RNA切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后直接表达，所以翻译形成的蛋白质不是蛋白A。（2）由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。（3）大肠杆菌作为受体菌具有繁殖周期短、易培养。（4）检测目的基因是否表达通常用抗原抗体杂交技术。（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物转移到另一种生物个体。【易错点】基因结构、原核生物与真核生物基因转录的不同、目的基因的检测等知识。【方法点拨】本题考查基因结构、原核生物与真核生物基因转录的不同、目的基因的检测等知识，要求考生能正确分析原核生物与真核生物基因转录的不同，掌握基因的结构、目的基因的检测方法。考点二 基因工程的应用与蛋白质工程例1某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_（答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是_的固体培养基。（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_【答案】（1）能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点即可）（2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 （3）受体细胞【解析】（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。（2）由于未被转化的和仅含有环状目的基因的大肠杆菌中不含有氨苄青霉素抗性基因，因此如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，未被转化的和仅含有环状目的基因的大肠杆菌均不能存活，因此两者是不能区分的；含有质粒的大肠杆菌和 含重组质粒的大肠杆菌的细胞由于均含有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，因此两者也是不能区分的在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基，即含有重组质粒的大肠杆菌在其中不能生长，而含有普通质粒的大肠杆菌能生长。（3）噬菌体是专门寄生在细菌细胞中的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞只能够，而蛋白质外壳仍留在细胞外，在噬菌体的DNA指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的模板来自于噬菌体，原料来自于受体细胞。【易错点】基因工程。【方法点拨】本题以图文结合的形式，综合考查学生对基因工程技术的熟记和理解能力。解决此类问题的关键是，熟记并理解相关的基础知识、形成知识网络，从题图中挖掘出隐含的信息，据此结合每个问题情境进行图文转换、实现对知识的整合和迁移。例2几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_。（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_。（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_（答出两点即可）。（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_。（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_。【答案】（1）嫩叶组织细胞易破碎防止RNA降解（2）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA（3）目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子（4）磷酸二酯键（5）目的基因的转录或翻译异常【解析】（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。【易错点】基因工程。【方法点拨】本题主要考查了基因工程等有关知识，旨在考查学生对基因工程操作步骤及细节的深层理解，综合性强，有一定的难度。易错点为第一问，衰老叶片基因表达水平低，叶片不易研磨破碎，组织细胞不能充分裂解，RNA提取不充分，而且老叶富含多酚物质，当其氧化后，会使得RNA沉淀变成褐色，干扰了后续实验。第二问填写反转录的原理注意三点：酶、模板、碱基互补配对的原则。第三问考查不能直接将目的基因直接导入受体细胞的原因（目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子），学生需要注意对教材知识的深入理解，教师注意深挖教材。例3（9分）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：限制酶BamHBclSau3AHind识别序列及切割位点（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。（3）若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶（填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。（4）若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得种大小不同的DNA片段。【答案】（1）BclI和Hind 连接 感受 （2）四环素 引物甲和引物丙（3） 都不能 （4）7【解析】（1）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamH I可能使质粒中启动子丢失，因此只能选BclI和Hind。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于感受态的大肠杆菌。（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，根据质粒上的抗性基因，应在筛选平板培养基中添加四环素PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙。（3）根据BamH和BclI的酶切位点，若BamHI酶切的DNA末端与BclI酶切的DNA末端连接，则连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，由于与两种酶的酶切位点均不同，故这两种酶都不能切开。（4）根据BamH、BclI和Sau3AI的酶切位点，Sau3AI在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3AI切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。【易错点】基因工程，限制酶，连接酶，重组质粒【方法点拨】此题是对基因工程的考查，解答本题的关键在于理解重组质粒中标记基因的作用，在插入目的基因时不能破坏标记基因，故选择限制酶须注意；PCR扩增基因时，两种引物结合的部位相反，延伸的方向相反；限制酶具有特异性，不同的限制酶识别不同的序列，判断某种限制酶能否切割某片段，应根据该片段中是否含有限制酶的识别序列。四、举一反三 成果巩固 考点一 基因工程的工具与操作程序1.下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（）A表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得B表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点C借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用【答案】C【解析】由于基因的选择性表达，在人的肝细胞中，没有胰岛素基因转录的mRNA，A错误；表达载体的复制启动于复制原（起）点，胰岛素基因的表达启动于启动子，B错误；标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，C正确；启动子在胰岛素基因的转录中起作用，终止密码子在胰岛素基因的翻译中起作用，D错误。2.图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR I、Sau3A I的切点是唯一的）。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）经BamH I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。【答案】（1）Sau3A 两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2） 甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录 （3）EcoliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶【解析】（1）分析图解可知，限制酶Sau3AI和BamHI酶切割后形成的黏性末端相同，因此经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AI酶切后的产物连接。（2）在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样的基因才能表达。图中甲和丙均不符合，所以不能在宿主细胞中表达目的基因产物。（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶3.基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即_和从_中分离。（2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是_。（3）在基因表达载体中，启动子是_聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是_。（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_和_颗粒。【答案】（1）人工合成 生物材料（2）cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因（3）RNA 大肠杆菌（或答细菌）（4）金粉 钨粉【解析】（1）获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。（2）植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有RNA逆转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。（3）在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌（或细菌）。（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉 和钨粉颗粒。考点二 基因工程的应用与蛋白质工程1.金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过_获得_用于PCR扩增。（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的_位点。设计引物时需要避免引物之间形成_，而造成引物自连。（3）图中步骤1代表_，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破_的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_（填序号：升高退火温度降低退火温度重新设计引物）。【答案】（1）逆转录cDNA （2）限制性核酸内切酶碱基互补配对（3）变性 （4）引物与模板GC含量高 （5）【解析】（1）PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，从而用于PCR扩增。（2）构建重组质粒，首先用限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒，所以位于目的基因两端的引物中需要增加适量的限制酶位点。设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，不能与模板相连。（3）图中步骤1、2、3分别表示变性、退火、延伸，这三个步骤组成一轮循环。（4）退火表示引物与模板链相连，若温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。由于G-C间三个氢键，A-T间两个键，所以G-C含量越高的引物，退火温度越高。（5）PCR反应得不到任何扩增产物，可能是退火温度过高，导致引物与模板不能相连，或引物间相互配对，引物自连，不能与模板相连，可通过降低退火温度或重新设计引物进行改进。2.编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。回答下列问题：（1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCTCAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_。（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为_，加入了_作为合成DNA的原料。（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是_。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是_。仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少_（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。【答案】（1）编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子（2）模板 dNTP（3）进行细胞传代培养 维持培养液是的pH C【解析】（1）题干信息基因序列（TTCG)，结合转录过程中的碱基配对原则，可知其转录出的mRNA上没有起始密码子AUG。（2）PCR需要的条件包括引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、四种脱氧核糖核苷酸。（3）动物细胞培养中，细胞具有贴壁生长以及接触抑制的特点，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，在培养中需要用胰蛋白酶处理贴壁的细胞并进行分瓶培养，分瓶后的培养称为传代培养；动物细胞培养过程中加入CO2，作用是维持培养液的pH。据图分析，丙与对照接近，甲和乙都有较大影响，在甲、乙中存在但在丙中不存在的片段是C，所以缺少C片段会降低效果。3.人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。（1）获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出标出另一条引物的位置及扩增方向。（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_（填写字母，单选）。A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子 C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子 （3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是_。（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径II相比，选择途径I获取rHSA的优势是_。（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_的生物学功能一致。【答案】总RNA （或mRNA）（2）B （3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工 （5）HAS【解析】（1）合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，然后通过逆转录过程。采用PCR技术扩增HSA基因时，两条引物分别与模板链的5端结合，扩增方向相反。（2）根据启动子通常具有物种及组织特异性，在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA，需选择水稻胚乳细胞启动子。（3）农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，酚类物质可以吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因的转移。（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工，而大肠杆菌是原核生物，细胞中不具有膜结构的细胞器。（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与天然的HSA生物学功能一致。五、分层训练 能力进阶 【基础达标】1.已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的进行改造。（2）以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰基因或合成基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：。（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过和，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，在经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物进行鉴定。【答案】（1）氨基酸序列（或结构）（1分） （2）P P1 DNA和RNADNARNA、RNADNA、RNA蛋白质（或转录、逆转录、翻译）（3） 设计蛋白质结构 推测氨基酸序列 功能【解析】（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列进行改造。（2）以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有二：修饰P基因；合成P1基因所获得的基因表达时遵循中心法则，中心法则的全部内容包括DNA和RNA复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质。（3）蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有氨基酸序列找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。2.HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：（1）用基因工程方法制备HIV的某蛋白（目的蛋白）时，可先提取HIV中的，以其作为模板，在的作用下合成。获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。（2）从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是。该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是。（3）已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。（4）人的免疫系统有癌细胞的功能，艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。【答案】（1）RNA 逆转录酶 DNA (2)抗体 抗原抗体特异性结合（4） T（或T淋巴） （4）监控和清除【解析】（1）HIV是一种逆转录RNA病毒，若要获取HIV的某种蛋白质，需将HIV的遗传物质RNA提取出来，在逆转录酶的作用下合成cDNA分子即获取该目的基因。（2）抗原注入机体后，会诱导机体的免疫系统产生抗体，抗体会和抗原发生特异性结合。HIV和抗体能特异性结合，因此可以用于检测受试者血清中的HIV。（3）HIV主要感染和破坏了患者的部分免疫细胞，主要是T细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。（4）人的免疫系统有监控和清除癌细胞的功能。3.回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。如图A所示，质粒pZHZ9上含有X抗生素抗性基因（XR）和Y抗生素抗性基因（YR）。其中XR内部含有限制酶KasI识别序列，YR内部含有限制酶FseI、HpaII、NaeI、NgoMIV识别序列，五种酶的识别序列如图B（表示切割位点），且这些识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。（1）若要将结构如图28C所示的目的基因直接插入到YR内形成重组质粒pZHZ10，则pZHZ9需用限制酶_切开。（2）将上述切开的质粒溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作。之后，受体细胞的类型（对两种抗生素表现出抗性R或敏感性S）包含_（多选）。AXR、YR BXR、YS CXS、YRDXS、YS（3）若用KasI和FseI联合酶切重组质粒pZHZ 10（只含单个目的基因），则可能产生的酶切片段数为_（多选）。A 1 B2C 3D 4（4）动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是_。A受精卵能使目的基因高效表达B受精卵可发育成动物个体C受精卵基因组更易接受DNA的插入D受精卵尺寸较大，便于DNA导入操作【答案】（1）NgoMIV （2）ABD （3）ABC （4）B【解析】（1）比较五种限制酶的识别位点和露出的黏性末端，可以看出只有限制酶NgoMIV切割DNA分子后露出的黏性末端与目的基因两端的黏性末端相同。因此，要将结构如图C所示的目的基因直接插入到YR内形成重组质粒pZHZ10，则pZHZ9需用限制酶NgoMIV切开。（2）将图中切开的质粒溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，有的质粒可能没有导入目的基因，这种普通质粒导入受体细胞后，由于XR、YR基因都没有被破坏，因此两种抗性都存在，故A正确；目的基因插入质粒后，由于YR基因被破坏，因此重组质粒导入受体细胞后，只具有XR抗性，表现XR、YS，故B正确；若是没有导入质粒，表现为XS、YS，没有其他情况，故C错误，D正确。（3）根据题意，XR内部含有限制酶Kas识别序列，YR内部含有限制酶Fse、Hpa、Nae、NgoM识别序列，五种酶的识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。如果插入目的基因后，NgoM识别序列有两处，根据题意，能够被NgoM识别的序列都能被Fse识别，因此用Kas和Fse联合酶切重组质粒pZHZ10，最少可以切开一个位点，得到一种DNA片段，最多切开3个位点，得到三种DNA片段。故选ABC。（5）动物体细胞的全能性受到限制，不能表现出来，而受精卵的全能性最高，因此转基因动物一般用受精卵作为受体细胞。故选：B。【能力提升】1.回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。在图27所示的质粒PZHZ11（总长为3.6kb，1kb=1000对碱基因）中，lacZ基因编码-半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能将白色的大肠杆菌染成蓝色。（1）若先用限制酶BamHI切开pZHZ11，然后灭活BamHI酶，再加DNA连接酶进行连接，最后将连接物导入足够数量的大肠杆菌细胞中，则含3.1kb质粒的细胞颜色为_；含3.6kb质粒的细胞颜色为_。（2）若将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段，形成4.9kb的重组质粒，则目的基因长度为_kb。（3）上述4.9kb的重组质粒有两种形式，若用BamHI和EcoRI联合酶切其中一种，只能获得1.7kb和3.2kb两种DNA片段；那么联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得_kb和_kb两种DNA片段。（4）若将人的染色体DNA片段先导入大肠杆菌细胞中克隆并鉴定目的基因，然后再将获得的目的基因转入植物细胞中表达，最后将产物的药物蛋白注入小鼠体内观察其生物功能是否发挥，那么上述过程属于（ ）。A.人类基因工程 B.动物基因工程 C.植物基因工程 D.微生物基因工程【答案】（1）白色 白色和蓝色/白色或蓝色 （2）1.8 （3）1.43.5 （4）C【解析】（1）若先用限制酶BamH切开pZHZ11，然后灭活BamHI酶，则破坏了lacZ基因，导致-半乳糖苷酶不能合成。而-半乳糖苷酶催化生成的化合物能将变色的大肠杆菌染成蓝色，所以含3.1