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第十三单元生物技术实践第十三单元生物技术实践第第41讲讲微生物的培养和应用微生物的培养和应用2015高考导航高考导航考纲点击考纲点击考情示例考情示例微生物的分离和培养微生物的分离和培养培养基对微生物的选择作用培养基对微生物的选择作用2013江苏江苏18、新课标全国、新课标全国39、四川、四川102012山东基山东基本能力本能力552011新课标全国新课标全国391将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上分离分解尿素的将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上分离分解尿素的细菌，是否无菌操作影响较小细菌，是否无菌操作影响较小(2012北京，北京，5D)()2培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分()3筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的惟一氮源筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的惟一氮源()4土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培养选择培养”是必不是必不可少的可少的()5统计样品中的活菌一般使用平板划线法统计样品中的活菌一般使用平板划线法()一、微生物培养基的配制一、微生物培养基的配制1概念：概念：为人工培养微生物而制备的，提供适合微生物生为人工培养微生物而制备的，提供适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的长、繁殖或积累代谢产物的_称为培养基。称为培养基。2种类种类(1)按化学成分可分为按化学成分可分为_、合成培养基和、合成培养基和半合成培养基。半合成培养基。(2)按物理状态可分为液体培养基、半固体培养基和按物理状态可分为液体培养基、半固体培养基和_培养基。培养基。_是最理想的凝固是最理想的凝固剂。剂。营养基质营养基质天然培养基天然培养基固体固体琼脂琼脂(3)按功能可分为基础培养基、加富培养基、按功能可分为基础培养基、加富培养基、_和和鉴别培养基。培养基中加入链霉素，即可抑制鉴别培养基。培养基中加入链霉素，即可抑制_的生长，将的生长，将_分离出来；培养基分离出来；培养基中添加中添加_，能区分大肠杆菌和产气肠杆菌。，能区分大肠杆菌和产气肠杆菌。3营养构成：营养构成：一般都含有水、碳源一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质提供碳元素的物质)、氮、氮源源(提供氮元素的物质提供氮元素的物质)和和_等。等。选择培养基选择培养基细菌和放线菌细菌和放线菌真菌真菌伊红伊红美蓝美蓝无机盐无机盐解惑解惑几种天然有机营养物质的主要成分几种天然有机营养物质的主要成分营养物质营养物质主要成分主要成分牛肉浸膏牛肉浸膏蛋白胨蛋白胨酵母浸膏酵母浸膏富含水溶性糖类、有机氮化合物、维生素、盐等富含水溶性糖类、有机氮化合物、维生素、盐等富含有机氮化合物、一些维生素和糖类富含有机氮化合物、一些维生素和糖类富含维生素富含维生素B类、有机氮化合物和糖类类、有机氮化合物和糖类4.培养基的配制培养基的配制(以细菌基础培养基配制为例以细菌基础培养基配制为例)(1)步骤步骤配制培养液配制培养液_分装分装包扎包扎_搁置斜面。搁置斜面。(2)配制原则配制原则_(根据微生物的种类、培养目的等根据微生物的种类、培养目的等)，如，如培养基可由简单的无机物组成，生产用培养基内可加入化学培养基可由简单的无机物组成，生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类、鉴定用培养基内必须加入成分不明确的天然物质，而分类、鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。已知化学成分的物质。调节调节pH灭菌灭菌目的要明确目的要明确营养要协调：注意各种营养物质的营养要协调：注意各种营养物质的_。pH要适宜：各种微生物适宜生长的要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌、范围不同，如细菌、放线菌和真菌的最适放线菌和真菌的最适pH分别为：分别为：6.57.5、_、和、和5.06.0。浓度和比例浓度和比例7.58.5二、无菌操作和接种技术二、无菌操作和接种技术1灭菌和消毒灭菌和消毒(1)灭菌指采用强烈的物理或化学方法使物体内外所有的微生灭菌指采用强烈的物理或化学方法使物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。常用方法有物永远丧失其生长繁殖能力的措施。常用方法有_灭灭菌和湿热灭菌。菌和湿热灭菌。(2)消毒是用较消毒是用较_的物理或化学方法杀死物体上绝大多的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物，如煮沸消毒法、巴氏消毒法等。数微生物，如煮沸消毒法、巴氏消毒法等。干热干热温和温和2接种接种(1)概念概念:在在_条件下将微生物接入培养基的操作过程。条件下将微生物接入培养基的操作过程。(2)工具：工具：_、接种针和接种环。、接种针和接种环。(3)方法：穿刺接种，斜面划线接种和方法：穿刺接种，斜面划线接种和_接种，涂接种，涂抹平板等。抹平板等。无菌无菌玻璃刮铲玻璃刮铲平板划线平板划线3无菌操作无菌操作微生物接种技术的关键微生物接种技术的关键(1)培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种之前都需要之前都需要_。(2)通常接种操作要在通常接种操作要在_的附近进行。的附近进行。4纯化大肠杆菌的方法纯化大肠杆菌的方法常用的微生物接种方法有常用的微生物接种方法有_和涂抹平板法。和涂抹平板法。(1)平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面_的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。的表面。灭菌灭菌酒精灯火焰酒精灯火焰平板划线法平板划线法连续划线连续划线(2)涂抹平板法：是将菌液进行一系列的涂抹平板法：是将菌液进行一系列的_，然，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面。后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面。5微生物的接种过程微生物的接种过程准备接种准备接种_灭菌灭菌试管灭菌试管灭菌挑取少量菌体挑取少量菌体划线接种划线接种培养。培养。梯度稀释梯度稀释接种环接种环三、微生物的分离、培养与数量测定三、微生物的分离、培养与数量测定1微生物的分离微生物的分离(1)原理原理根据微生物对营养成分、氧气、根据微生物对营养成分、氧气、pH等要求的不同，通过只等要求的不同，通过只提供提供_生长的必需条件，或加入某种抑制剂使非生长的必需条件，或加入某种抑制剂使非目的微生物不能生长，从而达到分离微生物的目的。目的微生物不能生长，从而达到分离微生物的目的。_或菌苔一般都具有稳定的特征，成为对微生物进或菌苔一般都具有稳定的特征，成为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。行分类、鉴定的重要依据。目的微生物目的微生物菌落菌落(2)常用方法常用方法平板分离法平板分离法平板划线法平板划线法目的：在培养基上得到目的微生物的目的：在培养基上得到目的微生物的_菌落。菌落。单个单个2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数(1)分离原理：土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能分离原理：土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能合成合成_，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起_作用。以尿素为惟一氮源的培养基能促进分解尿素作用。以尿素为惟一氮源的培养基能促进分解尿素的细菌的生长和繁殖，并抑制或阻止其他微生物的生长，从的细菌的生长和繁殖，并抑制或阻止其他微生物的生长，从而将目的菌分离。而将目的菌分离。(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用_法。法。(3)实验流程：土壤取样实验流程：土壤取样制备制备_微生物的培养与微生物的培养与观察观察细菌的计数。细菌的计数。脲酶脲酶催化催化涂抹平板涂抹平板培养基培养基3分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离(1)菌种筛选菌种筛选方法：方法：_。原理原理即：使用以纤维素为惟一碳源的选择培养基，根据即：使用以纤维素为惟一碳源的选择培养基，根据_来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。刚果红染色法刚果红染色法是否产生透明圈是否产生透明圈(2)筛选流程筛选流程土壤取样：富含土壤取样：富含_的环境的环境选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量梯度稀释梯度稀释涂布平板：将样品涂布于含微晶纤维素粉的鉴别纤维素分解涂布平板：将样品涂布于含微晶纤维素粉的鉴别纤维素分解菌的培养基上菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落：产生挑选产生透明圈的菌落：产生_的菌落周围出现的菌落周围出现透明圈透明圈纤维素纤维素纤维素酶纤维素酶C1用平板划线法或涂抹平板法纯化大肠杆菌时用平板划线法或涂抹平板法纯化大肠杆菌时()可以用相同的培养基可以用相同的培养基都需要使用接种环进行接种都需要使用接种环进行接种都需要在火焰旁进行接种都需要在火焰旁进行接种都可以用来计数活菌都可以用来计数活菌ABCD解析：平板划线法或涂抹平板法都使用固体培养基，故解析：平板划线法或涂抹平板法都使用固体培养基，故正正确；平板划线法采用接种环进行操作，而涂抹平板法采用玻确；平板划线法采用接种环进行操作，而涂抹平板法采用玻璃刮铲进行操作，故璃刮铲进行操作，故错误；纯化时，要进行无菌操作，需错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，故要在火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，故正正确；平板划线法一般用于分离而不是计数，故确；平板划线法一般用于分离而不是计数，故错误。错误。A2分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是()A经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上上B富集培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少富集培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少C经稀释培养后，用刚果红染色经稀释培养后，用刚果红染色D对照组可用等量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上对照组可用等量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上解析：经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤解析：经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经富集培养的确得到了要分用刚果红染色；设置对照能证明经富集培养的确得到了要分离的微生物。离的微生物。D3微生物微生物(除病毒外除病毒外)需要从外界吸收营养物质并通过代谢来需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是维持正常的繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是()A乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的B微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子子C培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利D生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子往往不足这些生长因子往往不足1微生物的营养微生物的营养微生物的营养与培养基类型微生物的营养与培养基类型营养营养要素要素含义含义作用作用主要来源主要来源碳源碳源凡能提供凡能提供所需碳元所需碳元素的物质素的物质构成生物体细胞构成生物体细胞的物质和一些代的物质和一些代谢产物，有些是谢产物，有些是异养生物的能源异养生物的能源物质物质无机化合物：无机化合物：CO2、NaHCO3；有机化合物：；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生饼糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等粉、石油等营养营养要素要素含义含义作用作用主要来源主要来源氮源氮源生长生长因子因子水和水和无无机盐机盐凡能提供所需凡能提供所需氮元素的物质氮元素的物质合成蛋白质、核合成蛋白质、核酸以及含氮的代酸以及含氮的代谢产物谢产物无机化合物：无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸、铵盐、硝酸盐；有机化合物：盐；有机化合物：尿素、蛋白胨等尿素、蛋白胨等生长必不可少生长必不可少的微量有机物的微量有机物酶和核酸的组成酶和核酸的组成成分成分维生素、氨基酸、维生素、氨基酸、碱基等碱基等水不仅是优良的溶剂，而且可维持水不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定；无机盐是生物大分子结构的稳定；无机盐是细胞内的成分和调节物质细胞内的成分和调节物质外界摄入外界摄入2.培养基的种类和用途培养基的种类和用途标标准准培养基培养基类型类型配制特点配制特点主要应用主要应用物物理理性性质质固体培固体培养基养基加入琼脂较多加入琼脂较多菌种分离、菌种分离、鉴定、计数鉴定、计数半固体半固体培养基培养基加入琼脂较少加入琼脂较少观察细菌的运动观察细菌的运动液体培液体培养基养基不加入琼脂不加入琼脂工业生产、连续工业生产、连续培养培养标标准准培养基培养基类型类型配制特点配制特点主要应用主要应用化化学学组组成成合成培合成培养基养基由已知成分配制而成，培由已知成分配制而成，培养基成分明确养基成分明确分类、鉴定分类、鉴定天然培天然培养基养基由天然成分配制而成，培由天然成分配制而成，培养基成分不明确养基成分不明确工业生产工业生产半合成半合成培养基培养基部分天然物质和部分化学部分天然物质和部分化学试剂配制而成试剂配制而成兼有天然培养基兼有天然培养基和合成培养基的和合成培养基的优点优点标标准准培养基培养基类型类型配制特点配制特点主要应用主要应用目目的的用用途途加富加富培养培养基基营养物质仅适合一种或一营养物质仅适合一种或一类微生物类微生物能使某种微生物的能使某种微生物的生长、繁殖比其他生长、繁殖比其他微生物更加迅速、微生物更加迅速、逐渐淘汰其他微生逐渐淘汰其他微生物物鉴别培鉴别培养基养基添加某种指示剂或化学药添加某种指示剂或化学药剂剂菌种的鉴别菌种的鉴别选择培选择培养基养基添加添加(或缺少或缺少)某种化学成某种化学成分分菌种的分离菌种的分离 (2014江苏盐城模拟江苏盐城模拟)一种广泛使用的除草剂一种广泛使用的除草剂(含氮含氮有机物有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明培养基不透明)。(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。现有一升土壤浸出液，用无菌吸管吸取行稀释处理。现有一升土壤浸出液，用无菌吸管吸取1 mL液液样至盛有样至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释无菌水的试管中，依次稀释103稀释度。各取稀释度。各取0.1 mL已稀释已稀释103倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为录的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液中菌体，则每升原土壤浸出液中菌体数为数为_。5.6108(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从用途方面要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从用途方面来看，上述培养皿中培养基的特点是来看，上述培养皿中培养基的特点是_。在无氮固体培养基中添加了该除草剂在无氮固体培养基中添加了该除草剂(3)接种技术的核心是接种技术的核心是_。在划线接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步在划线接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步_，培养时，只有很少菌落出现，大，培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是_或有氧条件抑制或有氧条件抑制了这些细菌的生长。了这些细菌的生长。防止杂菌污染防止杂菌污染,保证培养物的纯度保证培养物的纯度稀释获得单个菌落稀释获得单个菌落培养基中缺少这些细菌可利用的氮源培养基中缺少这些细菌可利用的氮源(4)在培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要在培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要是是_，有透明带菌落利用的氮源主要是，有透明带菌落利用的氮源主要是_，据此可筛选出目的菌。实验结果如，据此可筛选出目的菌。实验结果如图显示的图显示的AE五种菌株中，五种菌株中，_是最理想菌株。是最理想菌株。氮气氮气该除草剂该除草剂E(5)科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和和B，然，然后对突变株后对突变株A和和B进行实验，结果如下表所示：进行实验，结果如下表所示：接种的菌种接种的菌种一般培养基一般培养基实验处理及结果实验处理及结果A不生长不生长添加营养物质甲，能生长添加营养物质甲，能生长B不生长不生长添中营养物质乙，能生长添中营养物质乙，能生长AB能生长能生长不添加营养物质甲、乙就能生长不添加营养物质甲、乙就能生长突变株突变株A不能在一般培养基上生长的原因是不能在一般培养基上生长的原因是_。突变株突变株A和和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因是原因是_。突变株突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶缺乏合成营养物质甲所需要的酶突变株突变株A生长需要营养物质甲，突变株生长需要营养物质甲，突变株B可以提供；突变株可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株生长需要营养物质乙，突变株A可以提供可以提供解析解析因该除草剂为含氮有机物，故所用培养基应是以除草因该除草剂为含氮有机物，故所用培养基应是以除草剂为惟一氮源的选择培养基。接种要在酒精灯火焰旁进行，剂为惟一氮源的选择培养基。接种要在酒精灯火焰旁进行，以防止杂菌污染，保证培养物的纯度。在该种选择培养基上以防止杂菌污染，保证培养物的纯度。在该种选择培养基上固氮和能分解除草剂的微生物均能生长，但固氮微生物菌落固氮和能分解除草剂的微生物均能生长，但固氮微生物菌落周围无透明圈。周围无透明圈。E菌落周围的透明圈最大，说明该菌落中的微菌落周围的透明圈最大，说明该菌落中的微生物分解除草剂的能力强。生物分解除草剂的能力强。方法方法平板划线法平板划线法涂抹平板法涂抹平板法注意注意事项事项微生物的纯化培养微生物的纯化培养平板划线法与涂抹平板法平板划线法与涂抹平板法(1)接种环的灼烧接种环的灼烧第一次划线前：杀死接第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污种环上的微生物，避免污染培养物染培养物每次划线前：杀死残留每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端来自上次划线末端划线结束后：杀死残留划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感菌种，避免污染环境和感染操作者染操作者(1)稀释操作时：每支试管及稀释操作时：每支试管及其中的其中的9 mL水、移液管等水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰和移液管应在离火焰12 cm处处(2)涂抹平板时涂抹平板时玻璃刮铲用体积分数为玻璃刮铲用体积分数为70%的酒精消毒的酒精消毒,取出时取出时,让让多余酒精在烧杯中滴尽多余酒精在烧杯中滴尽,然然后将沾有少量酒精的玻璃刮后将沾有少量酒精的玻璃刮铲在酒精灯火焰上引燃铲在酒精灯火焰上引燃方法方法平板划线法平板划线法涂抹平板法涂抹平板法注意注意事项事项目的目的培养培养(2)灼烧接种环之后，要冷灼烧接种环之后，要冷却后再进行取种，以免温却后再进行取种，以免温度太高杀死菌种度太高杀死菌种(3)划线时最后一区域不要划线时最后一区域不要与第一区域相连与第一区域相连(4)划线用力要大小适当，划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划防止用力过大将培养基划破破不要将过热的玻璃刮铲放不要将过热的玻璃刮铲放在盛放酒精的烧杯中，以免在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精引燃其中的酒精酒精灯与培养皿距离要合酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任适，移液管管头不要接触任何物体何物体在培养基上形成由单个菌种繁殖而来的子细胞群体在培养基上形成由单个菌种繁殖而来的子细胞群体菌菌落落平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发，平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基造成污染防止皿盖上水珠落入培养基造成污染【高考警示高考警示】(1)两种接种方法作用不完全相同：平板划线法和涂抹平板法两种接种方法作用不完全相同：平板划线法和涂抹平板法都能使细菌纯化，但平板划线法不易分离出单个菌落，不能都能使细菌纯化，但平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；涂抹平板法能使单菌落分离，便于计数。计数；涂抹平板法能使单菌落分离，便于计数。(2)涂抹平板法的缺点：涂抹平板法统计样品中菌落的数目往涂抹平板法的缺点：涂抹平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，往比实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。平板上观察到的只是一个菌落。划线划线涂抹平板涂抹平板 (2013高考新课标全国卷高考新课标全国卷)临床使用抗生素前，临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：回答下列问题：(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用为了从样本中获取致病菌单菌落，可用_法或法或_法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。养、鉴别等步骤获得。(2)取该单菌落适当稀释，用取该单菌落适当稀释，用_法接种于固体法接种于固体培养基表面，在培养基表面，在37 培养箱中培养培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布，使其均匀生长，布满平板。满平板。(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素病菌对抗生素A_；涂抹平板涂抹平板敏感敏感含含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B_；含；含C的滤纸片周围的透明圈比含的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明的小，说明_；含；含D的滤纸片周围的透的滤纸片周围的透明圈也比含明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的的_。(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素_。不敏感不敏感该致病菌对该致病菌对C的敏感性比对的敏感性比对A的弱的弱耐药菌耐药菌A解析解析(1)实验室中对微生物纯化培养时，常用的接种方法有实验室中对微生物纯化培养时，常用的接种方法有划线法和涂抹平板法。划线法和涂抹平板法。(2)若让已经获得的单个菌落在固体培若让已经获得的单个菌落在固体培养基上大量且均匀繁殖，常用玻璃刮铲把稀释的菌液均匀涂养基上大量且均匀繁殖，常用玻璃刮铲把稀释的菌液均匀涂满整个平板。满整个平板。(3)对某种抗生素越敏感的致病菌，在该抗生素对某种抗生素越敏感的致病菌，在该抗生素存在的范围内，越不易生存，形成的透明圈就越大。但是，存在的范围内，越不易生存，形成的透明圈就越大。但是，如果在透明圈中还有菌落生存，则说明这个菌落的细菌耐药如果在透明圈中还有菌落生存，则说明这个菌落的细菌耐药性很强。性很强。(4)通过通过(3)可知，在应用时，要想杀死某致病菌，可知，在应用时，要想杀死某致病菌，就得选择能使该致病菌大量死亡，即产生的透明圈大的那种就得选择能使该致病菌大量死亡，即产生的透明圈大的那种抗生素。抗生素。1分离微生物的方法分离微生物的方法从混合样品中获得某种微生物的方法通常有两种：从混合样品中获得某种微生物的方法通常有两种：(1)利用该分离对象对某一营养物质有利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好嗜好”的原理，专门的原理，专门在培养基中加入该营养物质在培养基中加入该营养物质,从而使它成为一种加富培养基。从而使它成为一种加富培养基。(2)利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物，经培养后，原来占优势的微生物生长受抑制加入该抑制物，经培养后，原来占优势的微生物生长受抑制,而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。微生物的分离与计数微生物的分离与计数2选择培养基及应用实例选择培养基及应用实例(1)选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，目的是从众要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，目的是从众多微生物中分离所需要的生物。多微生物中分离所需要的生物。(2)选择培养基应用实例选择培养基应用实例培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是惟一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生效果。如石油是惟一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的成长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除物的成长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。石油污染的微生物的目的。改变微生物的培养条件，可以达到分离微生物的目的，如改变微生物的培养条件，可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物。将培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物。3菌株筛选原理的比较菌株筛选原理的比较土壤中分解尿土壤中分解尿素的细菌素的细菌分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物选择选择培养培养基的基的成分成分鉴定鉴定方法方法尿素作为惟一的氮源尿素作为惟一的氮源纤维素作为惟一的碳源纤维素作为惟一的碳源在培养基中加入酚红指在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能升高，说明细菌能分解尿素分解尿素刚果红染色法，即刚果红与刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的现以纤维素分解菌为中心的透明圈透明圈4.统计菌落数目的方法统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。计算一定容积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法间接计数法(活菌计数法活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中，其中，C代代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时代表涂布平板时所用的稀释液的体积所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。代表稀释倍数。操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。的平板进行计数。 (2014河南信阳模拟河南信阳模拟)土壤是土壤是“微生物的天然培微生物的天然培养基养基”，下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实，下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请根据图回答相关问题：验过程，请根据图回答相关问题：(1)能分解尿素的细菌代谢类型为能分解尿素的细菌代谢类型为_，应从富，应从富含有机质的土壤表层取土样。含有机质的土壤表层取土样。(2)为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用_的培养基进行分离，并加入的培养基进行分离，并加入_指指示剂进行鉴别。示剂进行鉴别。异养需氧型异养需氧型尿素为惟一氮源尿素为惟一氮源酚红酚红(3)若取土样若取土样5 g，应加入，应加入_mL的无菌水配制成稀的无菌水配制成稀释释10倍的土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以倍的土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释稀释,配制成如图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前，配制成如图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前，一定要一定要_以减少误差。将以减少误差。将103107倍的稀释液分别吸取倍的稀释液分别吸取0.1 mL加入到固体培养基上，用加入到固体培养基上，用_将菌液铺平。这种接种方法称为将菌液铺平。这种接种方法称为_。45摇匀摇匀(振荡、混匀振荡、混匀)玻璃刮铲玻璃刮铲涂抹平板法涂抹平板法(4)将接种的培养皿放置在将接种的培养皿放置在37 恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养2448 h，观察并统计具有观察并统计具有_(现象现象)的菌落数的菌落数,结果如下表结果如下表,其其中中_倍的稀释比较合适。倍的稀释比较合适。稀释倍数稀释倍数103104105106107菌落数菌落数(个个)5003672483618红色环带红色环带106或或105解析解析(1)分解尿素的细菌代谢类型为异养需氧型。分解尿素的细菌代谢类型为异养需氧型。(2)分解尿分解尿素的细菌可以尿素为氮源进行生存，所以分离该细菌应该使素的细菌可以尿素为氮源进行生存，所以分离该细菌应该使用以尿素为惟一氮源的选择培养基进行分离，该微生物能将用以尿素为惟一氮源的选择培养基进行分离，该微生物能将尿素分解成氨，氨会使培养基的尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，使酚红变红，所以升高，使酚红变红，所以可加入酚红作为指示剂。可加入酚红作为指示剂。(3)因为土样为因为土样为5 g，所以需加入，所以需加入45 mL的无菌水配制成的无菌水配制成10倍土壤溶液，样品稀释时一定要摇匀倍土壤溶液，样品稀释时一定要摇匀后再吸取样液，以减少误差。接种方法有平板划线法和涂抹后再吸取样液，以减少误差。接种方法有平板划线法和涂抹平板法两种，其中用玻璃刮铲将菌液铺平的接种方法是涂抹平板法两种，其中用玻璃刮铲将菌液铺平的接种方法是涂抹平板法。平板法。(4)观察时出现红色环带的菌落能分解尿素，其中菌观察时出现红色环带的菌落能分解尿素，其中菌落数在落数在30300之间进行计数比较合适。之间进行计数比较合适。误区辨析误区辨析易错点易错点1误认为不同生物需要的营养物质不同误认为不同生物需要的营养物质不同点拨点拨(1)微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。(2)在人在人和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。维生素六类。(3)在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳三类。氧化碳三类。易错点易错点2消毒与灭菌混为一谈消毒与灭菌混为一谈点拨点拨条件条件结果结果常用方法常用方法应用范围应用范围消消毒毒较为温较为温和的物和的物理或化理或化学方法学方法仅杀死物体仅杀死物体表面或内部表面或内部的部分对人的部分对人体有害的微体有害的微生物生物煮沸消毒法煮沸消毒法日常用品日常用品巴氏消毒法巴氏消毒法不耐高温的液体不耐高温的液体化学药剂消毒化学药剂消毒法法用酒精擦拭双手用酒精擦拭双手,用氯用氯气消毒水源气消毒水源灭灭菌菌强烈的强烈的理化因理化因素素杀死物体内杀死物体内外所有的微外所有的微生物，包括生物，包括芽孢和孢子芽孢和孢子灼烧灭菌法灼烧灭菌法接种工具接种工具干热灭菌法干热灭菌法玻璃器皿、金属工具玻璃器皿、金属工具高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌法法培养基及容器培养基及容器易错点易错点3进行恒温培养时，要将培养皿倒置进行恒温培养时，要将培养皿倒置点拨点拨如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落入培养如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的细菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达细菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此恒温培养时，培养皿必须倒置。不到分离的目的。因此恒温培养时，培养皿必须倒置。1微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是下列操作，错误的是()煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢接种操作要在酒精灯火焰附近进行接种操作要在酒精灯火焰附近进行无菌繁殖脱毒苗时无菌繁殖脱毒苗时,要对植物的外植体进行消毒要对植物的外植体进行消毒家庭制作葡萄酒时要将容器家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌和葡萄进行灭菌培养基要进行高压蒸汽灭菌培养基要进行高压蒸汽灭菌加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌ABCDD解析：无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物解析：无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂基、添加剂(指示剂或染色剂指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故高压蒸汽灭菌。故操作错误。操作错误。2请回答下列有关微生物的一些问题。请回答下列有关微生物的一些问题。(1)微生物的分布：微生物主要分布在富含微生物的分布：微生物主要分布在富含_的土壤表的土壤表层；不同微生物对层；不同微生物对pH的要求不同，细菌常生活在酸碱度的要求不同，细菌常生活在酸碱度_的潮湿土壤中。的潮湿土壤中。(2)微生物的消毒和灭菌：在菊花组织培养中，对外植体常用微生物的消毒和灭菌：在菊花组织培养中，对外植体常用酒精和酒精和_进行消毒。在微生物培养中，对培养基常用进行消毒。在微生物培养中，对培养基常用_方法进行灭菌。静止在空气中的细菌可用方法进行灭菌。静止在空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。有机质有机质接近中性接近中性氯化汞氯化汞高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌损伤损伤DNA的结构的结构如果要检测培养基灭菌是否彻底，可以采用的方法是：如果要检测培养基灭菌是否彻底，可以采用的方法是：_。(3)微生物的应用：在葡萄酒的自然发酵过程中，运用吸附在微生物的应用：在葡萄酒的自然发酵过程中，运用吸附在葡萄皮上的野生酵母菌发酵产生酒精，请写出该过程的化学葡萄皮上的野生酵母菌发酵产生酒精，请写出该过程的化学反应式：反应式：_。在果醋制作时，运用醋酸菌在在果醋制作时，运用醋酸菌在_和糖源充足时，将糖和糖源充足时，将糖分解成醋酸。分解成醋酸。将灭菌过的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培将灭菌过的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生养基上是否有菌落产生有氧有氧(4)微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是_和和_。(5)微生物的计数：根据培养基上出现的菌落数目和稀释倍数微生物的计数：根据培养基上出现的菌落数目和稀释倍数计算得出细菌数目往往比实际的数目低，原因是计算得出细菌数目往往比实际的数目低，原因是_。平板划线法平板划线法涂抹平板法涂抹平板法当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的菌落当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的菌落只有一个只有一个(6)微生物的鉴定：为检测尿素分解菌的存在与否，在以尿素微生物的鉴定：为检测尿素分解菌的存在与否，在以尿素为惟一氮源的为惟一氮源的_(选择、鉴别选择、鉴别)培养基中加入培养基中加入_指示剂，如果存在尿素分解菌指示剂，如果存在尿素分解菌,则指示剂将变则指示剂将变_色。色。选择选择酚红酚红红红解析：解析：(1)微生物主要分布在有机质丰富的土壤表层，细菌常微生物主要分布在有机质丰富的土壤表层，细菌常生活在酸碱度接近中性的潮湿土壤中。生活在酸碱度接近中性的潮湿土壤中。(2)植物组织培养时，植物组织培养时，对外植体常用酒精和氯化汞消毒，对培养基常用高压蒸汽灭对外植体常用酒精和氯化汞消毒，对培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌；紫外线能使蛋白质变性，还能损伤菌法灭菌；紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构；的结构；可通过在适宜的温度下放置灭菌过的培养基看其是否有菌落可通过在适宜的温度下放置灭菌过的培养基看其是否有菌落产生来确定培养基灭菌是否彻底。产生来确定培养基灭菌是否彻底。(3)醋酸菌为需氧型生物。醋酸菌为需氧型生物。(4)最常用的微生物接种方法有平板划线法和涂抹平板法。最常用的微生物接种方法有平板划线法和涂抹平板法。(5)因一个菌落可由多个连在一起的细菌形成，所以计算得出的因一个菌落可由多个连在一起的细菌形成，所以计算得出的细菌数一般低于实际数目。细菌数一般低于实际数目。(6)用选择培养基筛选目的菌用选择培养基筛选目的菌尿素分解菌，加入酚红指示剂，若存在尿素分解菌，指示剂尿素分解菌，加入酚红指示剂，若存在尿素分解菌，指示剂变红色。变红色。本部分内容讲解结束本部分内容讲解结束按按ESC键退出全屏播放键退出全屏播放
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