人羊膜上皮细胞来源、生物学特性及应用前景

人羊膜上皮细胞来源、生物学特性及应用 前景人羊膜上皮细胞来源、生物学特性及应用前景本文关键词：羊膜, 生物学，性及，前景，上皮细胞人羊膜上皮细胞来源、遗传学特性及应用前景本文简介：羊膜作 为一种一种生物材料用于描述外科已有100多年的历史，1910年首次 报道了羊膜成功应用于皮肤移植1.近年研究发现，人羊膜上皮细胞 (humanamnioticepithelialcells, hAECs)具有部分干细胞特性，表 达干细胞的标记物，可分化为三个胚层不同类型的细胞2.由于hAECs 取材方便人羊膜上皮细胞第一手、生物学特性及应用前景本文内容：己近羊膜作为一种生物材料用以外科已有100多年的历史， 1910年首次了羊膜成功应用于皮肤移植1.近年研究发现，人羊膜 上皮细胞(human amniotic epithelial cells, hAECs)具有部 分干细胞特性，表达小鼠的标记物，可分化为三个胚层不同类型的细 胞2.由于hAECs取材方便、易于分离，成为细胞治疗转变成和再生 医学的有利工具。2021年国际胎盘干细胞协会(International Placenta Stem Cell Society, IPLASS)成立，推动胎盘来源干细胞的 基础研究和临床应用，也标志着胎盘提供者来源干细胞已得到越来越 多研究者的关注。本文就hAECs的来源、生物学特性等方面，对其临 床应用前景进行论述论述。1 hAECs的来源羊膜(amniotic membrane, AM)属于胎儿附属物，是羊水和 胎盘的部分组织。羊膜组成羊膜和胎盘的最内层，并覆盖脐带表面， 与胎儿皮肤相连。羊膜为半透明聚合物，结实、坚韧而柔软，光滑， 无血管、神经及淋巴。正常羊膜厚0. 02 0.05mm,由羊膜上皮 (amniotic epithelium, AE)和结缔组织构成2.羊膜上皮由单层 的羊膜上皮细胞构成。羊膜是高变异性的组织，位于胎盘表面的羊膜 上皮上皮层为柱状上皮细胞，周围部分的上皮层是扁平上皮细胞。羊 膜与羊水直接接触，电镜下所可见羊膜上皮细胞表面有微绒毛，使羊 水与羊膜子宫间进行物质交换。通常可将羊膜与绒毛膜电子零件分离，并通过胰酶等进行一 1 growth factor, EGF)存在的培养基中，hAECs通常可生长2 6代。 低密度的状态下生长较缓慢。体外培养的hAECs呈中等大小的弧形细 胞，核居中或偏于西侧，可有一个或四个细胞核，胞质丰富。hAECs 的增殖呈典型的鹅卵石样上皮细胞形体形态。hAECs在自分泌的转化 生长因子(transforming growthfactor- P , TGF P )的作用下，可 自发经历上皮-间充质转化(ep-ithelial-mesenchymal transition, EMT) 3.2 hAECs的生物学特性2. 1 hAECs阐释干细胞标记物hAECs在体外培养条件下， 可表达彼此之间充质表达干细胞标记物；此外，hAECs还可表达胚胎 器官移植标记物、多能干细胞标记物等4 - 5.间充质干细胞标记物: CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、HLA-A, B, C CD13、CD10、CD166、 CD49e、CD117 (表达量极低)，并且不表达CD14、CD34、CD45、 HLA-DR.胚胎器官移植标记物：发展阶段特异性胚胎抗原SSEA-3. SSEA-4,肿瘤排斥抗原TRA 1-60. TRAb81.多能干细胞标记物： octamer-4 ( 0CT-4 ) 、 NAN0G sexdetermining region Y-box 2 (SOX-2 )、Lefty-A FGF-4、REX-1, and teratocarcinoma- derived growth factor 1 (TDGF-1)(cripto-l)。 其 他：CD324 ( E-cadherin ) 、 CFC1、 DPPA3、 PR0M1 PAX6、 CD140b GCTM2. ATP 结合盒转运蛋白 G2 ( ABCG2 /BCRP)、CD9、CD24、整 合蛋白a 6、Bl、c-met (肝细胞激酶受体)。原代hAECs中，SSEA3、SSEA4和TRA阳性的细胞核分别为 15%、50%和5%显着大于成体干细胞的比率(0. 1% 0. 01%) o Miki等6认为，原肠胚形成暴发是器官发生的开始，由于 hAECs发生于原肠胚己经形成前，加之羊膜福州话的阻隔，原肠胚的 短程器官形成信号分子可能不能完全指导作用作用于成羊膜细胞，因 此沿用保留有较多的干细胞特性。2. 2 hAECs的免疫特性外科羊膜应用于多种外科医治已有 100多年，包括皮肤烧伤、皮肤创伤后修复、手部溃疡等不同阴部部 位的创伤7,泌尿生殖道及颌面部等部位重建手术，以及多种坏死表 面的重建8,均呼吸系统未出现免疫抑制或全身性排斥反应。胚胎细 胞的免疫特性表现在其特殊的免疫分子表达谱。hAECs 低表达 MHC I 类分子(HLA-A, B, C,G ),不表达 MHCII 类分子(HLA-DR),还表达 HLA-G CD80 ( B7-1)、CD86 (B7- 2)、CD40和CD40L9. hAECs持续性表达非典型MHC I类分子HLA- G.通常持续性表达HLA-G的组织为免疫豁免组织，如睾丸、卵巢、胎 儿细胞。HLA-G有非常重要的免疫调节功能。主要由ILTR识别，表 达于T、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞表面，结合后才消除活性 信号。hAECs是一类免疫豁免细胞，能在免疫不相容的异体移植受者 体内存活。在无免疫抑制剂的作用下，异体移植的羊膜或hAECs仍不 发生急性免疫排斥反应。体外实验中，从羊膜中分离的细胞不怎么表 现出同种中曾和异种的免疫反应，并且能较强地抑制淋巴细胞弯果。体内实验证实，人羊膜和hAECs可移植到同种和异种的具有 免疫功能的动物体内，未表现出免疫排斥。人羊膜和hAECs能在有免 疫力的动物，如兔、鼠、豚鼠、帽猴体细胞长期存活，提示这类细胞 不具有免疫原性。此外，在自体无免疫抑制治疗的情况下，将人羊膜 和hAECs应用于外科治疗，也均未见全身性排斥反应。3 hAECs的临床应用前景hAECs可阐明干细胞标记物，详细信息其可能具有干细胞特 性。与人胚胎干细胞一样，hAECs不具有形成这类单个细胞克隆的技 能，并且由于其基因稳定性，在移植入异种动物体内也不畸胎瘤4. 因此，只能通过构建嵌合体小鼠验证其干细胞特性。在体外条件下， 利用小鼠的胚胎干细胞和人羊膜细胞诱导成嵌合体小鼠。在嵌合体小 鼠胚胎中，三个胚层中均有人细胞的分布10.尽管该细胞系为人 hAECs和哺乳类间充质细胞的混合，仍成功揭示了羊膜细胞的多能性。 进一步的研究否认，hAECs在体外诱导条件下可分化为三个的细胞， 包括外胚层的神经元和神经胶质细胞核11,中胚层的心肌细胞肌细胞、 骨细胞、脂肪细胞12,内胚层的肝脏13和胰腺细胞14等。3. 1 hAECs在小脑神经系统疾病治疗中的应用前景hAECs 在商业价值治疗中枢神经系统疾病方面有着巨大的潜力。2021年 Sakuragawa等15发现，体外培养的hAECs表达突触和神经胶质细 胞特异性蛋白，自此hAECs就开始被用作研究细胞治疗的研究。随后 有研究证实，hAECs还可合成分泌乙酰胆碱、儿茶酚胺、多巴胺。进 一步实验也证实，hAECs可表达神经标记基因，如神经特异性烯醇化 酶、神经丝蛋白、髓鞘碱性蛋白、微管相关蛋白-2、胶质原纤维酸性 蛋白等4.利用腺病毒标记系统证实，约20%的hAECs表达少突胶 质细胞表达出来标志基因，如髓鞘碱性蛋白、蛋白质脂蛋白(PLP)和 2, 3-环腺昔酸-3-磷酸二酯酶(CNPase) o帕金森病(Parkinsons disease, PD)是由脑黑质的多巴胺 (dopamine, DA)神经元的进行性死亡可能引发。将hAECs移植入组 织胺的PD大鼠模型，可改善其DA神经元退化作用，并且其功能大 幅度恢复16.这可能通过分泌DA和其他原子可溶性分子发挥作用。 活体在非免疫抑制的大鼠中的进一步实验证实，hAECs移植的大鼠脑 黑质中DA和D0PAC (3, 4-二羟基苯乙酸)分泌明显增加，脑脊液中 DA含量明显增加17.此外，hAECs对于脑卒中、脊髓拥有损伤等神 经系统疾病有着潜在的治疗前景。hAECs植入入大脑中闭锁动脉闭锁 的模型中，可迁移到缺血区域，减少梗死面积，提高行为功能 18. hAECs移植入脊柱横断的猴子中，可促进微管迅速增长，并且抑 制了脊柱到微神经元的死亡死亡19.通过行为评估，移植后的hAECs 创伤能在损伤的急性期起到神经保护的作用，并且在长期恢复过程中 过程促进长纤维束的再生，而改善脑部损伤系统动物的功能。各种各 样体内体外实验证明，hAECs可能通过分化为神经元，或分泌神经营 养因子而起到改善疾病的作用。3. 2 hAECs在心脏疾病治疗中的应用前景 由于成熟心肌细 胞的不可再生性，干细胞移植重建病损心脏丧失的心肌细胞、改善缺 血心肌的功能，被视为有临床应用前景的、治疗冠心病尤其是急性心 肌梗死的新途径。Miki等最早对hAECs可分化为心肌细胞做出做出了 所研究，在hAECs培养基中会添加抗坏血酸培养14天后，通过RT- PCR可检测到心房型肌球蛋白轻链(MLC-2A)、心室型肌球蛋白轻链 (MLC-2V) . GA-TA-4及心肌细胞特异性转录脂质Nkx 2. 5的表达 4.体内实验证实，心肌缺血将人羊膜块移植入大鼠心肌缺血仿真， 明显改善了系统栓塞后心脏功能；实验组动物心理素质为心脏收缩功 能提高、左室短轴缩短率年率提高和室壁增厚；但在健康人心肌组织 机构组织中未检测到人细胞。提示这些功能的改善应是羊膜细胞分泌 的调节因子的作用，起到了保护和促进宿主组织再生20.然而，不同 于组织块的重制，hAECs注射入心肌梗死的大鼠模型的心肌梗死区域 4周后，存活的hAECs中3%可表达心肌专一性蛋白肌球蛋白重链。 实验组动物的心脏射血变低分数升高，PET及地区组织学可见梗死区 域减少，梗死区域心肌基因和蛋白表达增高。证实了 hAECs在体内条 件下可分化为心肌样细胞，减少梗死区域，改善心肌功能21.因此， 羊膜和hAECs改善心肌缺血其中的监督机制有两种管理制度可能：一 是移植细胞分化为心肌细胞或者内皮细胞血管和平滑肌细胞；移植细 胞刺激了血管生成和预防了心肌细胞的死亡。3. 3 hAECs在疾病肝脏病症治疗中的应用前景 近年肝脏移 植成为晚期肝脏疾病的新方法，但却受到肝脏来源短缺问题的限制。 hAECs具有自主性结构分化为消化系统细胞的能力，成为潜在的移植 来源。Sakuragawa等22报道，体外培养的hAECs可分泌白蛋白 (Alb)和甲胎蛋白(AFP)。进一步研究发现，未分化的hAECs表达 白蛋白、a-抗胰蛋白酶、a 1-AT CKT8、CPS-1, PEPCK等肝细胞基 因，而诱导后的 hAECs 表达 a 1-AT. CK-18、CPS-1、CYP3A4、PEPCK 等肝脏相关基因量增加，并且可类似物分泌白蛋白、贮积糖原23.通 过外源性生长因子刺激方案诱导hAECs分化为肝脏细胞，能分泌许多 种徽标成熟肝脏特异性标志蛋白，其中包括关键重要的药物代谢相关 的细胞色素P450基因。羊膜块移植入SCID生长激素腹腔后可苟延残 喘并的血清和腹水中可检测到人白蛋白的分泌23. hAECs移植入SCID 小鼠的肝脏后，表现为Alb和AFP阳性，并且融合为肝脏实质组织 22. hAECs移植入免疫缺陷小鼠后,在小鼠血清中检测到人al-抗 胰蛋白酶，可进一步证实移植入的hAECs可发挥肝脏细胞的功能。最 近研究发现，小鼠肝脏细胞、基质胶基质或猪肝脏细胞来源的胞外基 质，可增加hAECs分化为消化系统细胞的能力。其中猪肝细胞来源的 胞外基质培养的hAECs,其白蛋白和多种CYP基因表达不断增加最明 显。三明治培养等3D培养法可明显增加这类机能细胞的功能和活性。倒千里光碱处理的消化道60%切除小鼠，经脾移植入hAECs 6个月后，可在肝脏组织中会检测到人源细胞24.在诱导分化为肝脏 细胞的hAECs中，目前可检测到至少30个在商业化肝脏细胞表达的 基因，提示hAECs可成为潜在的移植来源。hAECs也为A1AT缺陷的肝脏和肺疾病等提供了新的治疗思 路。4结论人羊膜上皮细胞由于特殊胚胎发育来源，仍继续保持着部分 干细胞特性。大量体内、体外实验己经都已证实了其潜在的治疗效果。 但hAECs不具有长期自我更新和形成单个细胞克隆的能力，其究竟是 一种可分化为一种三个胚层的多能干细胞还是多种各系祖细胞的混合 物，仍需进一步的研究课题。但在临床应用各方面，hAECs具有独特 的优势：首先，hAECs可分化为三个胚层各不相同类型的细胞，多种 模型实验也证实其潜在的治疗效果。其次，由于hAECs基因的稳定性, 嫁接入免疫缺陷的动物后无致瘤性。人胚胎干细胞和诱导性多能干细 胞具有确切的干细胞特性和分化线粒体能力，而与之伴随的是其致瘤 性。加之hAECs特殊的免疫特性，在治疗的安全性现阶段，hAECs具 有明显的优势。再次，由于hAECs取自于人胎盘羊膜，易于分离培养。 胎盘通常作为医疗废弃物，hAECs的实验和研究可在一定程度上避免 道德道德教育等问题。总之，hAECs在临床应用方面具有广阔的前景, 未来的研究将无论是在其基本生物学特性方面继续深入，还是就其诱 导分化能力方面进一步展开，都将有利于其临床应用积极探索的推进。 hAECs无疑将成为细胞治疗和再生医学的有利工具。