人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的成立

人突变型P53和EB病毒LMP1转基因小鼠的成立何迎春，田道法，卢芳国，毛积芳【关键词】鼻咽癌前病变Construction of transgenic mice containing human mutant p53 and EB virus latent membrane protein 1Abstract AIM: To establish bitransgenic mice models containing mutation p53 gene and EpsteinBarr (EB) virus latent membrane protein 1 gene (LMP1) and to provide reliable tools for studying the reciprocity of mutant p53 with LMP1 in the tumorogenesis process of nasopharyngeal precancerosis. METHODS: Molecular cloning techniques were used to construct the recombinant plasmid pLMPlp53mt containing mutant p53 gene and EB virus LMP1 gene. Linear recombinant plasmid pLMPlp53mt was transfected into mouse androgenesis of germ cells by microinjection and then survival germ cells treated were planted into fallopian tubes of artificial pregnant female mice.Threeweek filial generation mice were screened by PCR and further identified by southern blot, and the histopathological characteristics of different tissues in 4month transgenic mice were observed by HE staining. RESULTS: Seven hundred and seven mouse zygotes were treated with transgenic vectors DNA by microinjection and then transplanted into 30 artificial pregnant female mice. Twentysix of these mice were gravid. The transplantation rate was %. A total of 179 F0 mice were obtained, of which 9 were carried p53mt gene and LMP1 gene screened by PCR. The positive rate of transgenic mice was % (9/179). The 9 positive F0 mice carrying foreign genes were further confirmed by southern blot. The rhinal mucosa, nasopharyngeal tissues and oesophagus of one founder had inflammation and its nasopharynx mucosa had focal hyperplasia. CONCLUSION: Transgenic mouse models integrating human mutant p53 gene and LMP1 and with focal hyperplasia of nasopharynx mucosa have been established by microinjection, which provides an effective model in studying the mechanism of nasopharyngeal precancerous lesions.Keywords mutation p53 gene; latent membrane protein 1 gene; nasopharyngeal precarcinoma; transgenic mice【摘要】目的：成立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双 转基因小鼠模型，为研究突变型P53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前 病变中的交互作用提供有力的工具.方式：通过度子克隆技术构建含 突变型P53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMPlp53mt；采 纳显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中， 然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管；取其产3 wk龄子代 鼠进行PCR初选，再通过Southern杂交进一步确证；利用HE染色法 观看4m。龄转基因小鼠不同组织病理转变.结果：将转基因载体进行 了 707枚小鼠受精卵的显微注射，然后植入30只假孕母鼠的输卵管中, 其中26只母鼠怀孕，移植成功率为初共诞生子代鼠179只;PCR检测 显示179只子代小鼠中有9只整合了 p53mt和LMP1基因，转基因阳性 小鼠比例为% (9/ 179), Southern杂交结果进一步证明了 9只基因组 整合了外源基因的首建者小鼠；随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠 鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症，鼻咽黏膜上皮灶性增生.结论：成 功成立整合人突变型P53和LMP1的转基因小鼠，且表现鼻咽黏膜上皮 灶性增生，可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手腕.【关键词】突变型p53基因；LMP1基因；鼻咽癌前病变； 转基因小鼠0引言鼻咽癌(NPC)是我国南方常见的一种恶性肿瘤，在我国南方 如广东、广西、福建、湖南等省，发病率居世界首位.在病理学上鼻 咽癌表现为低分化，而临床上那么表现为高转移性，其病因、发病机 制尚不十分明了.目前对鼻咽癌的预防成效不太理想，故将鼻咽组织 癌变的初期诊断医治作为鼻咽癌二级预防的要紧内容具有重大意义. 缺少适合的动物模型是鼻咽癌前病变研究的要紧障碍，利用基因工程 技术复制鼻咽癌前病变更物可为探讨鼻咽癌前病变的机制和寻觅鼻咽 癌前病变的防治方式提供较理想的模型.1材料和方式材料双基因真核表达质粒pLMPlp53mt由本研究组在前期工作中 构建1,包括载体 pLXSX, 受 human cytomegalovirus 启动子（PCMV） 操纵的p53mt基因和受EDL2启动子（PEDL2）操纵的LMP1基因（图1）. 小鼠供体、受体皆为F1杂交鼠（C57BL/6J雌XCBA雄），假孕雌鼠3 mo 龄，结扎雄鼠6mo龄，上海南方模式生物研究中心繁衍，饲养于SPF 级动物房.限制性内切酶Spel （大连宝生物工程）；孕马血清促性腺激 素（PMSG）（天津实验动物中心）；人绒毛膜促性腺激素（HCG）（上海生 化制药厂）；M2, 口6胚胎培育液、透明质酸酶及矿物油（Sigma公司）;PCR试剂盒（Promega公司）；小量质粒DNA抽提试剂盒（Plasmid Mini Kit tip 20）、凝胶纯化QIAGEN试剂盒（德国QIAGEN公司）；地高辛 标记试剂盒、p53mt多克隆抗体和免疫组化检测试剂盒（博士德公司）; LMP1 mAb （美国Vector公司）；其他常规试剂均为国产分析纯试剂.用 Olympus倒置显微镜和体视显微镜，显微注射系统及制针设备（日本 Narishige）、胚胎培育器皿（Falcon 3037, 3003）、显微注射用针自 制、紫外凝胶成像系统（美国BioRad公司）、紫外分光光度计（岛津, 日本）、PCR扩增仪（PE公司）、高速冷冻离心机（Sigma公司）、C02 孵箱（BINDER）、超净工作台（苏净集团安乐公司）.应用PCGENE软件包依照注射线性载体序列资料自行设计，共 选取2对引物用于转基因阳性鼠鉴定，由上海生工生物工程技术公司 和上海申友生物技术公司合成.引物1用于PCR检测转基因动物体内 的 p53mt 基因，上游序列为：5' CAAGATGTTTTACCAACTGGCC3',含 p53 基因的突变位点，下游序列为：5' CAGCTCGTGGTGAGGCTCC3",产物为 504 bp.引物2检测LMP1基因的整合，上游序列为：5' CGGAATTCATGGCGGCGGTGATCCACA3 ',下游序列为：5 7 GATAGGATCCCTCGAGAGTGAGGCACA3z ,扩增目的条带为 782 bp.方式注射用双基因真核表达质粒DNA的制备转基因质粒经Spe I酶切成线性，用凝胶纯化QIAGEN试剂盒回收目的片段.DA溶解在显 微注射缓冲液，其终浓度为mg/L.转基因小鼠的制备雄鼠输精管的结扎、供体鼠的超排卵及交 配、假孕母鼠的预备、受精卵的搜集、显微注射及移植等均参考文献2.转基因被注射入C57BL/6J（雌）与CBA （雄）的杂交一代受精卵 雄性原核，然后，移植入假孕母鼠输卵管.受体鼠怀孕产出仔小鼠. 转基因首建鼠的挑选鼠尾基因组DXA的提取：剪掏诞生3 wk的小 鼠尾尖 cm,加入矶的消化裂解液和35 UL （10g/L）的蛋白酶，充 分混匀，于55c摇荡留宿；加入mL苯酚溶液，用等体积氯仿：异戊 醇（24： 1）抽提1次.室温蒸发乙醇，加入mLTE4°C留宿，溶解DNA. PCR检测：取ULDNA为模板，PCR检测基因的整合.反映体系： 10X反映缓冲液n L, MgC12 UL,模板DNA uL,上游引物1 uL, 下游引物1 UL, dNTPs 1 UL, Taq酶uL,双蒸水uL,总量30 U L.利用引物1检测p53mt基因时，参考文献3,反映条件：94 4 min, 97 40 s, 60 30 s, 72 30 s； 94 30 s, 60 30 s, 72 30 s, 35个循环；72 8 min,扩增目的条带为504 bp；引物 2检测LMP1基因整合时，反映条件：94 4 min, 94 30 s, 72 50 s, 35个循环，72 8 min,扩增目的条带为782 bp, 10 g/L琼脂糖 凝胶电泳观看结果.小鼠基因组DNA的Southern blot检测：取 PCR阳性的小鼠基因组DNA 20 ug,以同种一般小鼠基因组DA及注 射用外源基因作为阴性对照和阳性对照，之内切酶BamH I充分消化,8 g/L琼脂糖凝胶电泳后转移至尼龙膜.DNA杂交：以EDL2为探针， 依照“DNA随机引物标记试剂盒”所述方式以地高辛标记探针.信号 检测：参照地高辛检测试剂盒的方式进行.病理组织学Southern杂交阳性的转基因小鼠注射250 g/L 乌拉坦麻醉后，取鼻腔黏膜、鼻咽组织、肺、食管、胃、大肠、肝、 肾、脾组织于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上，进行脱水，透明， 石蜡包埋，切片，切片厚4 Um, HE染色，光学显微镜下阅片，观看 病理转变.2结果显微注射注射片段回收后，用注射用TE稀释至mg/L,在显 微注射仪下将该片段导入小鼠受精卵的雄性原核中.共注射了 707枚 受精卵，将其移植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕, 移植成功率为;共诞生子代鼠179只.检测利用PCR从中挑选出9只携带p53mt基因（图2）的小 鼠（3只雌性，6只雄性），别离为19号，44号，63号，73号，74 号，99号，103号，131号，133号，同时用LMP1基因引物扩增也为 阳性（图3）,阳性率为%.这些转基因小鼠不是同一批检测.杂交检测将PCR阳性的LMPlp53mt首建鼠尾DNA进行 Southern blot检测,确证9只小鼠均为阳性（图4）.病理学转基因小鼠鼻腔黏膜、鼻咽组织、肺、食管、胃、大 肠、肝、肾、脾组织HE染色观看，鼻腔黏膜、鼻咽、食管等显现炎症, 鼻腔黏膜有中性粒细胞浸润；鼻咽组织也有中性粒细胞浸润，而且表 现出黏膜上皮灶性增生;食管显现中性粒细胞浸润及淋巴细胞浸润（图 5）.其他部位未显现明显病变.3讨论野生型P53基因参与细胞周期的调控，阻止细胞从G1期进入 S期；对细胞割裂和增殖起负调剂作用，同时还能够诱导细胞显现凋 亡，被以为似“分子警察”那样监视着细胞DNA的完整性.突变型p53 基因不但丧失了抑癌活性，反而具有增进恶性转化的功能，导入突变 型P53基因小鼠为高度肿瘤易感性，约有20%小鼠诱发肿瘤.LMP1是EBV基因组编码并在鼻咽癌组织中表达的与细胞转化 有关的少数几个蛋白质之一，在EBV致癌进程中起重要作用.现己成 立的EBV相关转基因动物模型要紧以LMP1为研究对象.LMP1转基因 小鼠可诱发B淋巴细胞瘤4,但未见鼻咽癌发生的报导，转基因鼠 的鼻咽组织中亦未检测到LMP1的表达，于是学者们把目光投向鼻咽组织特异性启动子的研究上.EDL2启动子存在于EBVBNLF1基因的下游,Nakagawa等5-6 用该启动子与周期蛋白DI cDA的融合基因成立转基因小鼠，在转基 因小鼠的舌、食道、前胃及皮肤等组织中检测到周期蛋白D1的表达, 且多位于基底层或基底上层复鳞上皮.体外研究也显示在鳞状上皮细 胞系TE11 （食道鳞癌细胞系）、SCC13 （人皮肤鳞癌细胞系）、SCC25 （舌 鳞癌细胞系）中EDL2有很高的活性，证明其为鳞状上皮特异性启动子 7.杨玉芳等8将该启动子导入了小鼠.张玲等9采纳受 EDL2, PLUNCp双启动子调控鼻咽癌来源的LMP1的表达载体，构建转 基因小鼠，在转基因小鼠的鼻咽、前胃、舌根等部位检测到了外源基 因的表达，可是未观看到鼻咽组织明显的病理改变，推测可能由于转 基因表达时刻较短（4 mo）.本研究利用可调控基因在鼻咽组织表达的相对特异性启动子 构建人突变型P53基因和LMP1基因的鼻咽癌前病变小鼠模型.转基因 小鼠检测结果说明在所取得的179只首建转基因小鼠中，9只PCR阳 性，再经Southern杂交鉴定,未发觉有假阳性.初期的转基因研究中, 一直将Southern杂交作为阳性鼠的最终结论.实践证明，通过严谨、 合理的设计，PCR鉴定完全能够作为最终结论.对其中一只雄性首建鼠（4 mo龄）进行病理组织学检查，其鼻腔 黏膜、鼻咽、食管等表现出炎症，鼻腔黏膜有中性粒细胞浸润；鼻咽 组织也有中性粒细胞浸润，而且表现出黏膜上皮灶性增生；食管显现 中性粒细胞浸润及淋巴细胞浸润.其他部位未显现明显病变.说明 EDL2相对特异性启动子操纵LMP1基因的表达和p53mt基因的一起作 用，能取得鼻咽癌前病变的动物模型.【参考文献】1何迎春，田道法,刘书静，等.质粒pLMPlp53mt的构建 与表达J .中国医学工程，2005, 13 (3)： 243-246.2孙哈笑.转基因技术理论与应用M.郑州：河南医 科大学出版社，2000:146-209.3何迎春，田道法，唐发清.PCR挑选转基因小鼠实验体 系的优化J.中华中西医临床杂志，2005, 5 (2)： 162-164.4 Kulwichit W, Edwards RH, Davenport EM, et al.Expression of the EpsteinBarr virus latent membrane protein 1 induces B cell lymphoma in transgenic mice j . 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