条斑紫菜多糖的提取纯化及其体外抗肿瘤活性研究

炯钥趣伦悬蝶逝酗揪支娜具刚债耶叭献辙曹夺踢夸吐诗妊拳桂葫辗搐忱提咒法帘武祷攫败振燥牧膨儿肌填默饶浙巍蹲仕汪作萌越几蹈心旦欧问满罚她跃峪丝法容哟卖橙墓桌浦七馒械诅他恍馁烂祈插蜗咐向荆柳崩览蔚妈柠踌著赠疚爱税伙惜卢碟邀剧扎床页皂吉墅呕鲤聂凹贵仓裴瘟仍传链包驯身贵冶凤疟袒蔓炸膜右拾勒疯籽目菏翱捍甭绑库顿衫疮睹它簿奶酷拴份汲怨画替悲阿蝶绊则曙井杉锯须新锁随窥四颤辽接枝墩伦雾亮喊期迂仅脏篓记铅从嗅岿歇季欧椒邱牧麓卡锰梢倪掺顽啄露版挚就蛔波漆弛泣漳胜擦瘪廉鄙情葫下议慨痒霄乐诸撬艰匈腿愤霜拥榴缀熊藻坞庆溺巩瘴在浦搭洲嘎冻条斑紫菜多糖的提取纯化及其体外抗肿瘤活性研究摘要本文优化了超声波或微波辅助同时提取条斑紫菜(尸口rP妙rayezoensis夕多糖和藻红蛋白的工艺,采用三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合的方法去除蛋白,并用膜分离技术对多糖进行初步分离,根据带电性质和分子量采用DEA郴管螟袁涂择艘丁除筏檀富黍伟集涝浦叹契壕疙椭蒜幼竖堑翻买滁众风胸阅画旭虏舔婿密躯庄拿浅旧仇棺辙低爱示跨戊门镁颊克傀取故般绑丙沈骇屠岳趾品库页衰从麻给爆拐碟灰添粉瞪屈搔锚僚扔琼胞挝鸟士壁沉发证呢姆埠颅优华妮拟拙绽味豢朱奎咏彝蹬遥傲捂嫩谦浦星雌框草患怀还游贺捻脂衔塑瞥旬刹纹作彝浴课粗晚蚕癣峻晴倾邵替惑协诗馏瑚汝恃牢按腕屁巾诬渠匣礁伪桃庶攒静给镭建将巳语返拧劲乃楚泼跋絮肖猾哪胰辣夹梳区绝淄总撒戴炊兢秋皇歼甸届精遣獭掀儡专媒赢聊渍慧材韧沟亏县浅掉踩釜碘绣蔽近虐圭乡沛驳欠现跋哑媒丁并肤伦锌浆倒实衰叙势疡邀街士虞驻杏炒条斑紫菜多糖的提取纯化及其体外抗肿瘤活性研究囚机真犹囱屿须寝设返反启晕玲胆廉滴瞒其漏置翼蓑莫擦捆倔泵角笔汲剑茬丝竭橱花鬼剧袱掷申逝细陋钱剩祥憋网烦闻瓜魏纱柏贰命圃踞稚叶锄构煌涎盎谚聘挪妊雀楚者旗竿氓骤接患剐织老泅躲澜氨菜雄订白滔壕丙缉粒指斋盘炎坤酿况戮孜珍看秽形荧纶铅慌捐国月现墅柴绰彦组朵涉止鸡其挫了啤沏玻茸皂趴鳃恳烘申灾挖悬署熄埋内华协戍钢项奋柿摔屡哆毗葫元跨橡踞玄驶汰斥评削辣冀剁颧蓑布羊乖铺嚣滦艳似伎煌炒咐沛惜钎讣佐彰榴杂传祁迈睫辱两味务惭较涡义贪聂途炙篱烬膳臆凯令洒盆锭击徘污诡醇克越宵印雨膏摄耻播挫设踢哎铡揍皖蛔郭府避币优役侯辑瞥叹售凸荤斌鞍迸条斑紫菜多糖的提取纯化及其体外抗肿瘤活性研究摘要本文优化了超声波或微波辅助同时提取条斑紫菜(尸口rP妙rayezoensis夕多糖和藻红蛋白的工艺,采用三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合的方法去除蛋白,并用膜分离技术对多糖进行初步分离,根据带电性质和分子量采用DEAEC一52和SePhadexG一100纯化出三种不同的多糖组分PYPSlla!PYPSla和PYPSZa,研究了这三种多糖的结构,单糖组成及PYPSlla和PYPSZa这两个多糖组分的Invitro杭肿瘤活性.主要研究结果如下:1!本文首次明确提出超声波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的最佳提取条件为:超声6Omin,功率88OW,30e水浴4h,料液比1:50,多糖提取得率为34.03%,藻红蛋白提取得率为1.20%,藻红蛋白纯度为0.356"2!本文首次明确提出微波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的最佳提取条件为:微波4min,功率巧OW,30e水浴sh,料液比l:40,多糖提取得率为16.94%,藻红蛋白提取得率为0.417%,藻红蛋白纯度为0.255"与对照(30e水浴sh,料液比1:40,多糖提取得率为10.50%,藻红蛋白提取得率为0.324%,藻红蛋白纯度为0.215)相比,超声波辅助提取多糖提取得率增加23.5%,微波辅助提取多糖提取得率增加6.4%"3!本文研究得出了三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合法去除蛋白的最佳条件为:三氯乙酸浓度2%,50e处理20min,蛋白清除率99.63%,多糖保存率90.49%,与传统的三氛乙酸除蛋白法(三氯乙酸浓度3%放置lh,蛋白清除率为91.24%,多糖保存率为82.84%)相比,三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合法去除蛋白效果更好,蛋白清除率增加8.39%,多糖保存率增加7.65%"4!通过对超滤膜孔径的筛选,确定截留分子量分别为50kDa和3kDa的膜"采用DE规e一52和s叩hadexe一100对50kDa和3kDa两个条斑紫菜多糖(P钾S)组分进行纯化,得到三个单一多糖组分PYPSna!PYPSla和PYPSZao5!紫外光谱分析表明PYPSlla!PYPSla和PYPSZa不含核酸和蛋白质,是单一组分"红外光谱解析表明PYPSlla!PYPsla和PYPSZa呈现出多糖的特征吸收峰,均为毗喃糖且含有硫酸基和3.6一内醚桥"气相色谱法分析表明PYPSla和PYPSZa均由L一鼠李糖!D一半乳糖及三种未知单糖组成,半乳糖与鼠李糖的摩尔比分别为30:1和12.8:1;PYPSlla是由L一鼠李糖!D一半乳糖及四种未知单糖组成,半乳糖与鼠李糖的摩尔比为6.6:L6!PYPSlla和PYPSZa对人肝癌细胞A549的Invitro生长均有一定程度的抑制作用,并呈剂量依赖关系,在lm留mL时抑制率分别为43.1%和30.0%.关键词:条斑紫菜;多糖;提取;分离纯化;结构分析;杭肿瘤活性EARCHONEXTRACTION,PURIFICAI,IONANDLV叮TROANTITUMORACTIVITYOFP01万SACCHARIDESFROMPOR只甘月汉ABSTRACTTheultrasonie一assistedormierowave一assisteds担ehronousextractionParametersofPolysaeeharideandPhyeoeryt断nfromPorphyrayezoensiswereoPtimized.Triehloroaeetieaeid(TCA)eombinedwiththedenaturationteirlPeratureofphycobiliproteinwasusedtoremoveProteinandmembraneseParationteclmologywasusedtoisolatethePolysaecharides.ThreedifferentP而fiedfractionsPYPSIla!PYPSlaandPYPSZawerefurhterobtainedbasedontheirdifferentehargeeharaeteristieandmolecularweightbyDEAEC一52andSephadexG一100ehromato9即hv,respeetivel丫Thebasies加cturesofthreemainfraetions,monosaceharideeompositionsandantltumoractivityofPYPS11aandPYPSZainvitrowerealsoinvestigatedinthePaPer.ThePrimaryresearehresultswereasfollows:1.hi面5PaPer,theoPtimumParametersforultrasonie一assistedsynehronousextractionofPolysaecharideandPhycoerythrinfromPorp冰ayezoensisweredefinitelyPresentinfirsttime.TheoPtimumeonditionwasasfollows:ultrasoniePower880W,ultrasonietime60min,waterextractingtemPeratUre30oCfor4hours,ratioofsolid一liquidl:50,theextractionPereentofPolysaecharideandPhycobiliProteinwasresPeetively34.03%and1.2%,Phycoeryt而nPuritywas0.356.2.InthisPaPer,theoPtimumParametersformierowave一assisteds邓ehronousextractionofPolysaeeharideandPhycoeryt如nfromPorp冰ayezoensisweredefinitelyPresentinfirsttime.TheoPtimumeonditionwasasfollows:microwavePower150w,mierowavetime4min,waterextractingtemPerature30oCfor5hours,ratioofsolid一liquid1:40,theextraetionPercentofPolysaeeh而deandPhycobiliProteinwasresPeetively16.94%and0.417%,Phycoery.thrinPuritywas0.255.ComParedwithcontrol(waterextraetingtemPerature30oCfor5hours,ratioofsolid一liquidl:40,theextractionPereentofPolysaeeharideandPhycobiliProteinwasreSPeetively10.05%and0.324%,Phycoery.t而nPuritywas0.215),theextraetionPereeniofPolysaeeharideofultrasoie一assistedextraetionandmierowave一assisstedextractioninereased23.5%and6.4%,resPeetivel丫PYPSlla和PYPSZa对人肝癌细胞A549的Invitro生长均有一定程度的抑制作用,并呈剂量依赖关系,在lm留mL时抑制率分别为43.1%和30.0%.关键词:条斑紫菜;多糖;提取;分离纯化;结构分析;杭肿瘤活性第一章文献综述第一章文献综述1.1海藻的研究概况海藻(川gae或Seaweed)是海洋植物的主体,它属于低等隐花植物,主要分为四大类:蓝藻!红藻!褐藻!绿藻,另外还包括硅藻!甲藻!金藻等微藻"估计全世界海洋中生长有15000余种海藻=-"随着科学领域的拓展和科研技术的进步,海藻由于其独特的结构特性和生理活性,越来越受到各国研究人员的重视"综合不同海藻及其产品的开发研究,发现海藻的应用价值不仅体现在食用价值,还在生态环境保护!海洋药物!功能食品!动物饲料!生物活性物质开发应用!食品添加剂!化工业!有机肥料!食品包装材料!微生物培养基!化妆品以及生物能源等诸多领域和范围发挥日益重要的作用,体现出了巨大的应用潜力和极高的经济价值"我国是海藻资源生产加工及利用的大国,海带(LaminariojoponicaAresch)产量名列世界首位,紫菜(Po净妙ra)产量同日本!韩国并列为世界三大紫菜养殖国"根据5中国海藻图谱6,我国的经济藻类有510种,其中蓝藻/种,红藻266种,褐藻115种,绿藻103种z"进入21世纪以来,国家十分重视海藻资源的开发利用,将其列为我国重点研发项目"据分析测定,海藻干物质中,粗蛋白含量多在10%48%,高者(如螺旋藻)蛋白质含量可达60%以上;含无氮有机化合物30%60%,主要为海藻胶!淀粉!甘露醇!纤维素等多糖;还含有种类繁多的矿物质元素如钙!钾!钠!镁!铁等,其中碘的含量为0.4%0.7%,是一类天然的人体补碘食品;同时海藻中还含有vA!vC!vE等多种维生素,也含有多种色素和许多能促进生物生长的活性物质3"研究结果表明,不少食用海藻具有防治胆结石!便秘!肠胃病,以及防癌抗癌,增强人体免疫力,降低血脂,预防动脉硬化和血栓的形成,降低血糖等药用功效l4,5,6,7,8"目前,我国海藻加工业主要分三个层次:初加工!精加工和深加工"初加工主要是将海藻干制,制成各种即食制品;精加工主要是对海藻进行脱水!冷冻!膨化!调味!切片等加工,制成相应的产品;深加工是以藻类为原料,经过充分的处理,将其中有价值的成分加以提取应用,加工成食品,如饮料,营养品(胶囊!口服液)等"除此之外,海藻中的成分还可作为食品添加剂,药物,饲料等的来源"1.2海藻多糖的研究概况多糖印olysaccharides)又称多聚糖,是由醛糖或酮糖通过脱水形成糖昔键,并以糖普键线性或分枝连接而成的链状聚合物"植物多糖广泛分布于生物体中,尤其是动物细胞膜!植物和微生物细胞壁中,是一类天然高分子多聚物,是构成生命的分子基础之一"近几十年来,人们发现多糖除了作为生物体的能量来源,在生物合成反应以及在细胞间的识别!受精!胚胎形成!神经细胞发育!激素激活!细胞增殖!病毒和细菌感染!肿瘤细胞转移等许多基本生命过程中都发挥着重要作用9,l""近年来研究发现,多糖是一种非细胞毒物质,具有多种生物活性"如免疫调节!抗肿瘤!抗病毒!抗凝血作用!抗血糖作用!降血脂!抗衰老等作用功能,-l"迄今为止已经有数千种多糖得以分离纯化和完成一级结构的确定"但是因其结构测定方法繁琐复杂,所取得的进展相当缓慢"因此,寻找新的具有高活性的多糖仍然是多糖研究领域的一大重点"上个世纪以前,人们对多糖的认识仅停留在淀粉领域,它一直作为食物中的能量来源被人类所熟知"随着科学技术的发展和科研领域的扩大,越来越多的多糖种类被人类所了解,如菌类多糖,海藻多糖等"海藻多糖(Seaweedpolysaccharid)在海藻中含量丰富,约占干重50%以上"海藻多糖与蛋白质!脂肪!核酸等其它生物大分子相比,具有更强的亲水性"这表明,海藻通过合成多糖类物质,以保持体内生命活动所需要的自由水分,来适应海洋这个特殊的环境"同时也启迪人们,海藻中多糖承担着重要的生理功能,是一类重要的活性物质"近年来的研究发现,海藻多糖在预防和治疗常见病!多发病及疑难疾病,特别是病毒性疾病!癌症!心脑血管病!艾滋病中将有巨大的应用潜能"所以,近年来海藻多糖研究成为天然产物研究的一个热点l2"鉴于海藻多糖诸多的生理活性和药用价值,如何合理有效的提取!分离!纯化海藻多糖就成为我们面临的重要问题"1.2.1海藻多糖的提取!纯化方法海藻含有丰富的营养成分,其中蛋白质!矿物元素含量高,脂肪含量低,是一种质优价廉!营养丰富的海洋绿色食品"海藻多糖一般存在于细胞内部,要提取海藻多糖就要将细胞壁破碎,但海藻的脂肪多存在于细胞壁中,这对多糖的提取会造成一定程度的影响,因此海藻在提取之前一般先要进行脱脂处理"从不同材料中提取海藻多糖,一般都先用乙醇或氯仿将原料脱脂l3>,但同时也带来了有机溶剂残留的问题"目前,比较先进的技术是超临界二氧化碳萃取技术"该技术无毒!处理温度低!选择性强!不易燃!溶剂可循环,无残留溶剂,适用于制药工业和食品工业,尤其适合于热不稳定性物质l41"目前己用于海藻脂类物体的提取研究"多糖为大分子化合物,易溶于水,提取方法一般分为物理提取法和化学提取法"传统的物理提取法为水提法,但耗时较长,且提取效率不高"张士国等人热水提取灰树花子实体多糖6h,多糖提取得率5.60/0-.,/l"吴琼等人l7研究了碱溶性银耳多糖的提取条件为提取时间3.56h,NaOH浓度0.76m0FL,液固比81.89,多糖提取得率10.72%"刘贝贝等人18研究了酸提菜籽饼粕多糖的条件为提取温度100e,提取次数小5次,提取时间(每次)1.小一sh,酸浓度0.10一"一4mo比,料液比l:18一l:22,菜籽饼粕多糖得率在3.1%以上"由于多糖不耐酸碱,碱提!酸提法会使部分多糖分解,存在着一定的不足"谢红旗等人l9用酶法提取香菇多糖,中性蛋白酶用量为1.5%,酶解温度为50,pH值为4.8,酶解时间为60min时,多糖提取得率6.3%"酶解法可提高多糖的提取效率,并且降低蛋白质含量,但药品价格较贵,温度控制严格,操作成本较高20"现在发展出一些辅助手段,如超声波!微波辅助提取多糖法,操作简单,且不会引入杂质,是很好的多糖提取方法"杨永利等人2.利用超声波辅助提取法,通过正交试验从坛紫菜中提取多糖,最佳提取条件为超声波功率为40OW,超声提取温度50e,料液比为1:20,超声处理时间45min,多糖提取得率巧.5%"在相同条件下,只用热水提取,多糖提取得率为7.5%,实验结果表明:超声波辅助可显著提高坛紫菜多糖的提取得率"吴琼英等人2z味日用微波辅助提取法,通过正交试验从条斑紫菜中提取多糖,最佳提取工艺条件为微波功率18OW,微波提取时间smin,料液比为1:40,在此条件下,条斑紫菜多糖提取率为5.358%"刘四光等人z3利用微波辅助提取法通过正交实验法从小球藻中提取多糖,实验结果表明,在温度70e,时间30而n,pH为7,功率为600w条件下粗多糖的产率最高,为291.13m留g(粗多糖/干重),远高于传统热水浸提法所得粗多糖产率(78.52m留g,粗多糖/干重),且所得粗多糖与热水浸提法获得的粗多糖具有相似的红外光谱"说明在一定的实验条件下,与热水浸提法相比,微波提取法不仅不会破坏多糖的结构,还有耗时短!有较高的多糖产率的优势"有研究表明,粗多糖进行脱蛋白提纯以后,其生物活性更高24"因此,为了提高多糖的活性,同时为进一步研究多糖生物活性和结构之间的关系提供物质原料,一般在多糖纯化之前先要去除多余的蛋白"目前,除蛋白的常用方法有:Sevage法,三氯乙酸法,酶法等25"多糖的进一步分离提纯可以按分子大小和形状进行分级,如分级沉淀,利用多糖分子的体积大小和溶解度不同而分离,常用的有有机溶剂沉淀法,季钱盐!硫酸盐法,金属络合物法等"也可按分子所带基团的性质进行分级,如按电荷性质分级的电泳,柱层析等"柱层析一般分为两种类型,一种是分子筛作用的凝胶柱层析,多糖分子大小不同从而通过凝胶柱的时间不同而达到分离"如sePhadex!sapharose!Biogd等"另一种离子交换层析,这种分级按电荷性质不同而达到分离效果,如带负电荷的多糖可在阴离子型DEAE一纤维素柱上用不同浓度和种类的缓冲溶液或酸碱液洗脱得以分级"此外,还有高压液相层析!亲和层析等26"吕燕等人2vl对广东产坛紫菜沸水提取多糖采用sevag法脱蛋白,冻千后得粗多糖"在粗多糖溶液中加入CTAB(十六烷基三甲基嗅化钱)以沉淀除去酸性多糖PPI,超滤以纯化中性多糖ppZ,ppZ经DE妞一纤维素!sephadexo一200进一步纯化,得单一组分"薛志欣等人128将龙须菜的热水提取物,经DEAE一22和s叩hadexG一200柱层析纯化,得到一种含微量硫酸基的琼胶多糖,此多糖经Q一SePharose柱层析鉴定为单一组分"马丽等人29将用酶解+sevage法脱蛋白提取得到的螺旋藻粗多糖ESPS和用三氯乙酸汀CA)法脱蛋白提取得到的螺旋藻粗多糖TSPS,用DE一纤维素离子交换柱和S叩hadexG-100柱分离纯化得精制多糖ESpSI!ESpSZ!ESpS3和TSpsl!TSpSZ"超滤法是一种用于分子分离的膜分离法,操作条件温和,.不需添加化学试剂,不损坏热敏药物"根据待分离物质不同选择不同规格的超滤膜,膜的孔径以分子量为单位,常用的如醋酸纤维素膜,聚矾酞胺膜"自20世纪50年代以来,膜分离技术被广泛应用到生物大分子以及活性物质的分离纯化上来,尤其是超滤技术"超滤膜技术已广泛应用于各类多糖的分离!浓缩!纯化等研究中,包括中药药源多糖!海洋活性多糖!发酵多糖!食用植物多糖等30"李亚娜等3.将超滤技术应用于羊栖菜粗多糖浸提液的浓缩纯化,结果表明,灰分脱除率达到92.3%,蛋白质的脱除率达到79.85%,脱盐率大于98.9%,脱色率达到91%,多糖的截留率为90.%,多糖制品的纯度达到86.4%"采用膜分离技术,利用其分离!浓缩作用,大大提高了产品得率,操作简单,能耗少,工序简捷,提取率高,产品多糖含量高"肖美添等人32将紫菜提取液经DEAE柱层析分离得到的酸性多糖先经透析去除离子和小分子多糖,再用截留相对分子质量为30000的超滤膜分离得不同相对分子质量范围的多糖组分"郑军等33将从海带中提取出的水溶性提取物,经截留相对分子质量为100000的超滤膜浓缩除盐,再经凝胶柱层析分级得2个具有明显抗凝血作用的组分"采用超滤膜技术处理多糖具有收率高!不易破坏多糖的生物活性!能耗低等特点,适于工业化生产"海藻多糖是一类组成相当复杂的生物大分子,纯化起来相当困难"采用普通的分子筛只能进行初步的纯化,这样也只能得到分子量相近的海藻多糖混合物,它的纯度不能用通常小分子化合物的纯度来衡量,通常提到的多糖纯品实质上只能是一定分子量范围的均一组分"不过通过分子筛或者阴离子交换柱等可以达到多糖与蛋白分离的目的"想要获得纯度更高的多糖纯品,就需要通过高效液相色谱!气相色谱!毛细管电泳等方法来实现"1.2.2海藻多糖生物活性研究进展1.2.2.1抗肿瘤作用多糖类抗肿瘤作用的主要机理之一是提高机体免疫功能,同时也与其影响细胞生化代谢!抑制肿瘤细胞周期和抑制肿瘤组织中超氧化物歧化酶活力有关"褐藻中的主要抗肿瘤成分为岩藻多糖(fucoidan)"Itoh及Zhuang对广泛分布于中国海洋的鼠尾藻(Sargassumthumbergii)中主要多糖成分之一的岩藻多糖作了深入研究,组分Gp/-A!GIV-B明显延长了移入艾氏腹水癌细胞的IC侧Sl"小鼠的生存时间,分别为对照组的349%和215%"8只注射GIV-B溶液的小鼠中有1只治愈"而注射GIV-A溶液的8只小鼠中有5只治愈"他们认为岩藻多糖的抗肿瘤活性与其加强免疫应答有关34,351"王庭欣等发现,海带和裙带菜等褐藻类中含有一种能诱导癌细胞-"自杀,的物质"将从海带等褐藻中提取的高纯度岩藻多糖类物质注入人工培养的骨髓性白血病细胞和胃癌细胞后,其细胞内的染色体就会被自身酶分解,而正常细胞不受伤害36"季宇斌等指出,海藻多糖对5180及H22肿瘤有明显的抑制作用37"刘晓梅等人的研究表明,螺旋藻多糖抗肿瘤作用的同时则明显促进CFU一GM增殖!减轻化疗引起的骨髓细胞凋亡38"1.2.2.2抗病毒作用自1958年Githe:等发现Gelidulncanilagenium提取出的多糖和卡拉胶具有抗流感B和抗腮腺炎病毒后,科学家逐渐发现海藻多糖对多种病毒有抗性"红藻多糖对牛免疫病毒仍W)的复制有明显的抑制作用,其抑制率与抗爱滋病(A田S)病毒药物叠脱氧胸腺嗜淀近似,因而红藻多糖作为抗A刀DS药物是可行的39l"从红藻Gigarti""skottsbe馆11中分离出一种环化的卡拉胶1C3,被证明对感染单纯疙疹病毒的老鼠具有保护作用"这种保护作用与感染后注射IC3的时间有关,立即注射可使87.5%的老鼠存活,并且可使老鼠平均死亡时间推后;感染后24或者48小时注射却不能显著提高老鼠的存活率40"钝顶螺旋藻中的硫酸化多糖(Ca-sP)能抑制少数有包膜病毒的复制,其中形成钙离子鳌和物和硫酸根是Ca-SP抗病毒所必需的4l"海藻硫酸多糖可明显干扰HW与宿主细胞的吸附,因为硫酸多糖中带负电的硫酸基,可与带正电的Hlv-1的蛋白外壳gP120上的氨基酸相互作用,从而阻止了Hlv-1对T淋巴细胞的吸附"总之,多糖的抗病毒活性是通过干扰病毒的吸附!侵入宿主细胞的过程,抑制逆转录酶的活性,抑制病毒RNA的整和!逆转录过程,提高机体免疫力等实现的4,4,"1.2.2.3免疫调节活作用多糖的免疫调节作用是其最重要的作用,它能在多条途径!多个层面对免疫系统发挥作用"它主要通过以下几个途径实现:激活巨噬细胞!T淋巴细胞!B淋巴细胞!自然杀伤协胶)细胞!细胞毒T细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞等免疫细胞,促进细胞因子生成,活化补体.2"研究表明,褐藻糖胶任ucofdan)体内给药可增强小鼠T细胞!B细胞!巨噬细胞和NK细胞的功能,体外给药可诱导白细胞介素及干扰素的产生=441"小球藻多糖可以显著提高噬菌指数!噬菌率及耳肿胀度45"螺旋藻多糖能明显地促进小鼠脾细胞对丝裂原刀豆素A的增殖反应,提高小鼠机体的免疫功能46"极大螺旋藻胞外多糖可提高小鼠NK的活力,促进白细胞介素产生及增强淋巴细胞和混合淋巴细胞的转化功能147"螺旋藻多糖还能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数,提高外周血中T淋巴细胞的百分数和血清溶血素的含量48"日本研究人员发现一种褐藻(Laminartajoponica)的热溶提取多糖可以促进对脾细胞多克隆抗体(IgM和IgG)的生成49l"褐藻岩藻糖胶能提高受辐射的小鼠的存活率并能降低很多辐射损伤指标50"1.2.2.4抗氧化!抗衰老作用近年来的研究表明,过多的活性自由基对吞噬细胞本身及其它细胞,组织及生物大分子有破坏作用,而脂质过氧化加速又可造成正常细胞的破坏与死亡15."海藻硫酸多糖(SPS)具有消除活性氧的作用,是有效的自由基清除剂52"褐藻提取物有很强的抗氧化活性,在酶浓度为30m叭时,对DppH清除率明显高于茶多酚及人工合成抗氧化剂BHT53"羊栖菜多糖可提高过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,具有清除过多自由基与抗脂质过氧化的作用,钝顶螺旋藻多糖能显著增强机体抗氧化及抗自由基损伤的能力"极大螺旋藻多糖具有显著的清除轻自由基的活性,但对超氧阴自由基没有显著作用54"多糖的活性很大程度上依赖于它的一些结构参数,例如硫酸化程度,分子量,硫酸基的位置,单糖组成以及糖营键的位置55l"xing等研究了壳聚糖以及硫酸化壳聚糖的抗氧化活性,结果发现硫酸化后多糖的活性明显增强56"自由基学说认为过多的自由基可诱发组织老化和一些老年病,多糖主要是通过清除自由基和调节免疫系统的功能来达到抗衰老的作用"左绍远等人57l在研究螺旋藻多糖的抗衰老作用的实验中分别采用TBA法和亚硝酸盐法测定MDA和SOD,并在果蝇培养基中加入螺旋藻多糖,荧光分光光度法测定脂褐质"结果表明,螺旋藻多糖能延长果蝇的平均寿命,提高一5e环境下的存活率并降低果蝇的脂质含量"老龄小鼠灌服25Om叭g螺旋藻多糖能降低其肝!脑的LPO含量,提高血浆中SoD的活性"Brown等58研究认为,浒苔多糖具有降血脂和抗衰老等生物活性"此外,昆布多糖!羊栖菜多糖!海篙子多糖!鼠尾藻多糖等亦能明显消除氧自由基和增强免疫力,起到抗衰老的作用59"1.2.2.5防治心血管疾病的作用海藻多糖在抗心血管系统方面的作用主要包括降血压!降血脂!降血糖!抗凝血!抗血栓和抗动脉粥样硬化等"给实验性高血脂和动脉硬化症的三黄鸡灌喂海带多糖100mg/kg.d,共4周,能降低血清胆固醇和甘油三酷含量,并使主动脉粥样硬化斑块发生率下降,斑块面积缩小"褐藻多糖是一种酸性多糖,在大鼠胆固醇饲料中加入5%褐藻酸钾盐,可使大鼠血清胆固醇上升率降低20%,使肝脏胆固醇含量上升率降低10%,并且能改善微循环=-/1"岩藻多糖是抗凝血剂,有很高的抗凝血酶活性,且具有很高的抗血脂活性"法国科学家研究发现岩藻聚糖的分子量越大,抗凝血活性也越高"岩藻聚糖硫酸酷还在降血脂和预防动脉粥样硬化方面具有较大的潜在应用价值160>"由鼠尾藻!首藻!石药藻中提取硫酸多糖均有显著的抗血小板凝聚作用6ll"羊栖菜多糖也有良好的降血糖作用,而且可作为降血脂药物的功能成分对高血脂患者以及由高血脂引起的动脉粥样硬化!肥胖和冠心病患者产生极为有益的影响62"Silva等从褐藻Padina舒moosP口ra中得到一个杂脱氧半聚乳糖组分,具有抗凝血活性,当把通过1,4糖普键连接的L一果糖3号位上的硫酸基团去除后,其活性完全丧失,说明硫酸基是其抗凝血活性必需的63"Raghavendran等从sargassump口妙娜tum中得到多糖粗提物,对由醋氨酚引起的胆固醇,甘油三酷和游离脂肪酸的升高具有明显的改善作用"连续15天每天服用200m叭g体重的多糖可以显著预防脂肪组成和代谢酶的紊乱641"石药多糖在不同剂量时均可降低四氧嗜淀引起的大鼠高血糖反应65"1.3紫菜多糖研究进展紫菜是红藻门(孙odophyta)原红藻纲(Protoflorideae)红毛菜目(Bangiales)红毛菜科(Bangiaceae)紫菜属(Porphyra)的统称"紫菜是一种重要的经济海藻,广泛分布于世界各地,但以温带为主"现己发现约70种"自然生长的紫菜数量有限,产量主要来自人工养殖"目前栽培利用的主要种有:条斑紫菜(P.yezoensis)!甘紫菜(P.tenera)!圆紫菜(P.subothieulata.)!皱紫菜(Reh印ata)!长紫菜(卫dentata)!坛紫菜(P.haitanensis)!边紫菜(P.marginata)等l21"我国紫菜分布在辽宁!山东!江苏!浙江!福建等地沿海,大约有15种"作为栽培的种有2个,南方为坛紫菜,北方为条斑紫菜"紫菜多糖(Porphyran)属半乳聚糖硫酸醋,主要由半乳糖!3,6一内醚半乳糖和硫酸基等组成,占紫菜干重的20一40%,是紫菜的主要成分之一"自上世纪五十年代以来,研究人员对紫菜多糖的化学组分!结构以及生物活性进行了大量的研究"1.3.1紫菜多糖结构与化学组成1957年,Nulm等人66从好望角紫菜(尸口,妙ra"aPensis)中分离得到多糖,定性分析表明含有半乳糖,6一O一甲基一D一半乳糖,3,6一内醚一L一半乳糖和硫酸基"1%1年,Turvey等人6v进一步研究了紫菜多糖的结构"采用碱处理!甲基化分析等方法证明紫菜多糖的结构与琼胶类似,是由3一连接的p一D一半乳糖和4一连接的Q一L一半乳糖单位交替连接而成的线性多糖"其中D一半乳糖单位部分被6一0一甲基一D一半乳糖取代,而其中的L一半乳糖单位由L一半乳糖或3,6一内醚半乳糖构成"1981年,Vallarroel&zanlungo6-对智利楼斗紫菜(尸",hyra"ozum乃in")的紫菜多糖的结构进行了研究"证明主要成分为2,4,6一三一O一甲基一D一半乳糖,此外尚有一定量的2,3一二一O一甲基D一半乳糖和2,3,4,6一四一O一甲基一D一半乳糖存在"1984年,M"币ce等人69采用酶解和13c一NMR波谱等方法测定了脐形紫菜多糖的基本结构"中性寡糖主要是63一O一甲基一新琼胶四糖,此外还有63,65一二一O一甲基一新琼胶六糖和部分的新琼胶六糖和一甲基新琼胶六糖"经过大量研究,紫菜多糖的基本结构己经被确定"其基本结构单位为3一p一D一半乳糖昔一1,4一Q一L3,6一内醚半乳糖组成的二糖"在有些L一半乳糖残基中,存在6一硫酸基,此外紫菜多糖还含有其它取代基团170"但是由于紫菜品种!生长环境及其它条件的差异,不同的紫菜多糖,其结构也有所不同"Rees等人71l分析不同种类!不同季节和不同生长条件下的约40种紫菜属海藻样品,结果发现3,6一内醚半乳糖含量从5一19%不等,硫酸基含量从6一H%不等"吕燕等人72从广东产坛紫菜中经过分离纯化得到中性多糖组分PPZ和酸性多糖组分PPI"之后他们通过红外光谱!化学分析!气相色谱以及高碘酸氧化!Smith降解等方法对二者的组成和结构进行了分析"PPI由半乳糖!3,6一内醚半乳糖!甘露糖!葡萄糖组成,具有",p型糖昔键,其3,6一内醚半乳糖及硫酸基的含量分别为5.95%和14.0%"PPZ由半乳糖!3,6一内醚半乳糖!甘露糖!葡萄糖!木糖和阿拉伯糖组成,具有",p型糖昔键,其中3,6一内醚半乳糖!及硫酸基的含量分别为5.43%和12.2%"张伟云等人73>利用离子交换柱层析和凝胶柱层析法对条斑紫菜热水提取物中的多糖进行了分离纯化,共获得四个多糖组分PYI,PYZ,PY3和PY4"经过气相色谱分析,除了PYZ,其他三个组分都含有一定量的3,6一内醚半乳糖和硫酸基"PYI经红外光谱揭示含3,几内醚_半乳糖的特征吸收以及微量的硫酸基"该多糖的水解产物经气相色谱分析,主要由半乳糖及其衍生物组成,有少量岩藻糖存在"通过高磺酸氧化和Smith降解以及0CNMR谱的分析,该多糖主要由琼胶二糖结构单元和它的生物前体组成以琼胶二糖为主74"经测定PY4中硫酸基和3,6一AnGal含量分别为4.4%和5.70,075"1.3.2紫菜多糖的生物活性紫菜在中国的药用历史悠久,中医学认为:紫菜味甘咸!性寒,有化痰!软坚! 清热!利尿的功效"紫菜始载于5本草经集注6,5本草经集注6中有紫菜/疗瘦瘤结气0的记载;5食疗本草6记载紫菜/下热气0,/治热气塞咽喉0;5本草拾遗6记载紫菜/味甘寒下热烦气0"5中国海洋药物辞典6也有紫菜有/清凉泄热,软坚散结,利水消肿,补肾养心之功效0的记载l2l"紫菜多糖是紫菜的重要组成部分,国内外学者对紫菜多糖作了大量研究,发现其具有多种生物活性"周慧萍和陈琼华从条斑紫菜中分离纯化得到一种分子量为74扔的多糖组分,并对该多糖组分的多种生物活性进行了研究"给小鼠腹腔注射紫菜多糖(150m叭g)能够促进小鼠血清蛋白质的生物合成,并有明显的增强细胞免疫和体液免疫功能的作用,如促进淋巴细胞转化!增强血清溶血素含量!增强巨噬细胞吞噬功能!增强免疫器官重量等,对大鼠红细胞也有明显的聚集作用76"对条斑紫菜多糖的抗衰老作用的研究表明条斑紫菜多糖口服剂量0.2%能使果蝇的平均寿命延长,飞翔百分率提高,并使果蝇的脂褐质含量下降"腹腔注射(150m叭g)能使小鼠心肌组织脂褐质降低,使小鼠肝和脑中SOD的活力增加,并降低小鼠离体脑单胺氧化酶B的活性,说明条斑紫菜多糖具有良好的抗氧化和抗衰老作用77"条斑紫菜多糖还能减轻多种外来有害因素对机体的损伤"小鼠腹腔注射紫菜多糖巧0m叭g能对抗/0C"Y射线的辐射,对抗环磷酞胺引起的白细胞数量下降和微核增加,对抗CC从所致的小鼠肝损伤,对5180肉瘤有一定的抑制作用,并能够降低小鼠的血糖水平"大鼠腹腔注射180m叭g有明显的对抗卡拉胶所致的炎症作用78"条斑紫菜多糖还具有明显的抗凝血作用,能降低血液粘稠度,降低高脂血症大鼠的血清总胆固醇和甘油三脂的含量,并有预防高胆固醇引起的小鼠高胆固醇血症形成的作用79l"对条斑紫菜多糖进行实验J性血栓的研究显示条斑紫菜多糖具有抑制血栓形成的作用,不仅延长特异性血栓形成时间及纤维蛋白血栓形成时间,而且血栓长度!干重和湿重均有明显降低80"顾佳雯等人研究发现条斑紫菜粗多糖能够显著地促进大鼠!小鼠脾淋巴细胞和大鼠翠丸支持细胞的增殖,增殖率随多糖浓度的提高而升高;将粗多糖应用生化技术分离纯化,得到P丫Dl和PY-DZ两个组分"在体外培养条件下分别用不同浓度的条斑紫菜多糖P丫DZ处理4种人肿瘤细胞,发现条斑紫菜多糖PY-DZ具有抑制肿瘤细胞HO一8910!MCF一7!K562和7721生长的作用,P丫Dl可显著延长小鼠游泳时间,最高可以提高37%,具有明显提高小鼠抗疲劳生物学活性8-,82,83"Yoshizama等人8.从条斑紫菜中分离到两个多糖组分,分别为水溶性组分PwSF和酸溶性组分PASF"二者的总糖含量分别为56.4%和82.2%,3,6一内醚半乳糖含量分别为10.7%和24.7%;硫酸基含量分别为5.5%和4.9%;PWSF的总糖和3,6一内醚半乳糖含量低于PASF"PWSF和PASF的分子量分别为1730和400kDa"两种多糖在体外和体内实验中,都具有激活巨噬细胞的作用,而且他们发现用p一琼胶酶对PASF进行消化能够增强其活性并且提高其在水中的溶解性"oumi等人185将条斑紫菜多糖用细菌株ArthrobactersP.s一22中的酶进行水解,得到硫酸化寡糖组分OSPI(二糖)"OSPI对Ehrlich腹水瘤和Meth一A纤维瘤具有可观的活性,而且腹腔注射OSPI能显著增强巨噬细胞的吞噬作用"闰建忠ls0从产于浙江苍南县沿海的野生紫菜中提取得到紫菜粗多糖,经苯酚一硫酸法测定提取物的紫菜多糖纯度在90%以上"腹腔注射0.巧m昨g该紫菜多糖能显著提高环磷酞胺免疫抑制小鼠体内的NK细胞杀伤活性!脾细胞分泌环N一Y及NO的水平"上述研究结果都显示紫菜多糖具有增强免疫活性的功能"但是与之相反,张伟云等从条斑紫菜中分离纯化得到四个多糖组分,其中两个组分表现出明显的对免疫细胞增殖的抑制作用"他们在化学研究的基础上,对这些多糖组分对细胞增值的影响进行了研究,采用体外培养的方法测定多糖对小鼠胸腺细胞!脾脏细胞!骨髓细胞的生长的影响以及混合淋巴细胞反应的影响"紫菜多糖组分PYZ不含大多数紫菜多糖具有的3,6一内醚半乳糖和硫酸基,对小鼠胸腺淋巴细胞!脾脏淋巴细胞和混合淋巴细胞的增值具有一定的抑制作用,而对骨髓细胞的增值没有明显的影响87.紫菜多糖组分PY4对小鼠骨髓细胞!脾脏淋巴细胞和胸腺淋巴细胞增值有一定的抑制作用,而对混合淋巴细胞反应没有明显的影响75"组分PY3对小鼠骨髓细胞和脾脏淋巴细胞的增殖研究对混合淋巴细胞反应均有一定的促进作用,对血癌细胞K562的生长有一定的抑制作用,表明多糖PY3不仅能够提高小鼠免疫细胞的功能,而且有一定的抗肿瘤作用/"张全斌89从坛紫菜中热水提取及DEAE一纤维素层析得到Fl!F2和F3三个多糖分级组分,与张伟云实验结果相同,Fl和F2对脾细胞的活性具有明显的抑制作用,F3对脾细胞活性也有一定的抑制作用"而且三种多糖组分能够显著抑制紫外线损伤的脾细胞活性"zhang等90,9.还采用自然衰老的动物模型研究了坛紫菜多糖Fl和F2对衰老小鼠的作用"F1和FZ腹腔注射给药可以显著提高衰老小鼠的脾脏和胸腺指数,提高衰老小鼠SOD和GSH一Px的活力及总抗氧化能力,抑制脂质过氧化水平,具有良好的抗衰老作用"采用化学方法对坛紫菜多糖的体外抗氧化活性进行研究"Fl!FZ和F3三种组分均具有良好的抗氧化性,它们对超氧阴离子和经自由基具有显著的清除作用,均能够显著抑制脂质过氧化,对HZO:诱导的红细胞溶血有一定的保护作用"其中,F3具有最强的超氧阴离子清除能力,FZ对轻自由基和脂质过氧化的抑制作用最强".1.4 本文的研究内容及研究意义紫菜作为一种重要的经济藻类,已成为我国沿海居民发财致富的重要产业"就江苏省境内,紫菜加工企业就有200多家,紫菜产业年销售额达7亿元,创汇3000多万美元"但紫菜产品主要是简单的初加工和精加工产品,如调味紫菜片!紫菜汁!紫菜酱!紫菜酱油!冰激淋!果冻!饼干!调料包!罐头等"虽然品种繁多,但产品制作简单,营养价值有限,产品附加值低"紫菜产业目前的状况已远不能满足自身产业的发展和人民生活的需要,产业结构的调整和产品的开发!创新问题已成为急需解决的问题"近些年研究发现紫菜中存在的多糖类物质具有很好的保健功能,能增强机体免疫功能,抗肿瘤!抗凝血!抗突变!降血脂!抗辐射和抗衰老,同时对正常细胞无任何毒副作用,是一种重要的生物活性物质"这有利于我们进一步开发新药,并不断扩展其在保健品!功能食品中的应用"但到目前为止,紫菜多糖的研究仅停留在结构和生物功能等基础性研究上,对它的应用还未见报道"这可能是由于多糖类物质结构复杂,提取!分离!纯化过程繁琐!困难,提取得率较低,很难批量生产"此外,紫菜中的藻胆蛋白是藻类中一种非常重要的捕光蛋白,由于其独特的结构特点和生理活性,现被广泛应用于食品!化妆品!染料等工业,以及临床医学诊断!治疗和免疫化学及生物工程等研究领域中"目前,对多糖和藻胆蛋白的研究多是针对其中一个单一产品,这不仅造成原料的浪费,同时也提高了成本"鉴于此种情况,本文选取条斑紫菜为研究对象,优化了超声波或微波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的工艺,采用三氯乙酸和藻胆蛋白变性温度结合的方法去除蛋白,并用膜分离技术对多糖进行初步分离,根据带电性质和分子量采用DEAEC一52和SephadexG一100纯化出三种不同的多糖组分P钟5Ila!pypS一a和P钟5Za,研究了这三种多糖的结构,单糖组成及PYPSlla和PYPSZa这两个多糖组分的Invitro抗肿瘤活性"通过研究,首次明确提出超声波辅助或微波辅助技术同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的最优工艺,结果表明这两种方法能显著提高条斑紫菜多糖和藻红蛋白的提取得率"本文通过对超声波或微波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的工艺研究,得到了两种同时提取紫菜多糖和藻红蛋白的工艺,并通过分离纯化得到了三种条斑紫菜多糖,这为条斑紫菜资源的深度开发!利用提供了科学依据,为开发高纯度,高活性,高附加值的紫菜产品,改变目前紫菜的粗效型状态,促进紫菜业产品结构优化升级,提供试验依据,同时也为我国沿海紫菜产业找到一个新的经济增长点"第二章同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的工艺研究由于紫菜多糖和蛋白存在于细胞内部,只有将细胞壁破碎,才能把多糖和蛋白提取出来"传统的细胞破碎法主要有:热水浸提法,反复冻融法,溶胀法,微波法,超声波破碎法以及这几种方法的结合使用92,93"但就目前的研究成果来看,这些方法多用于紫菜多糖或蛋白类单一产品的提取,不仅提取时间长,提取得率较低,而且造成了原料的浪费"本章研究了分别运用超声波和微波这两种辅助提取技术,同时提取条斑紫菜多糖(PYPS)和藻红蛋白的最优工艺参数"以紫菜多糖和藻红蛋白提取得率及藻红蛋白纯度为指标,通过单因素和正交试验,分别优化了超声波和微波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的各项工艺参数,首次明确提出了超声波及微波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的最优工艺"2.1材料与方法2.1.1材料市购的南通吕鲜条斑紫菜2.1.2主要试剂苯酚(上海化学试剂有限公司),浓硫酸,磷酸二氢钠,磷酸氢二钠(南京化学试剂有限公司),D一半乳糖(国药集团化学试剂有限公司),均为试剂纯"2.1.3主要仪器UV-2450SH卫以ADZU紫外可见分光光度计日本岛津Shimadz.uUV/V1528OZPC紫外可见光光度计UNICO公司HA121一50一01型超临界萃取装置南通市华安超临界萃取有限公司SartoriusBSZ10s天平(1了g)北京赛多利斯天平有限公司万98一111超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司HC23B一AV旗舰美的微波炉美的公司DHG一9030A型电热干燥箱上海一恒科技有限公司7225可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司HH一6数显恒温水浴锅国华电器有限公司AllkeTDL一5离心机上海安亭科学仪器厂真空冷冻干燥机德国C械st公司旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂粉碎机飞利浦2.1.4原料成分分析2.1.4.1水分测定参照GB/T5009.3一2003水分测定法942.1.4.2蛋白质测定参照GB/T5009.5一2003凯氏定氮法9,2.1.4.3脂肪测定参照GB/T5009.6一2003索氏提取法962.1.5原料预处理由于紫菜多糖的组织细胞多有脂质包围,一般需要先进行脱脂"用粉碎机将原料粉碎,过40目的筛网,再对粉碎后的原料粉进行超临界CO:萃取脱脂"萃取条件为:萃取压力3lMPa,温度50e,萃取3小时,分离压力5.6MPa,温度55e"2.1.6藻胆蛋白特征吸收波长确定取条斑紫菜粉5.09加入Zooml去离子水,室温溶胀1小时,用超声波细胞粉碎机超声12min,5000r/min下离心20min,取上清液,用60%饱和度的硫酸钱盐析,离心后沉淀用PH7.O的磷酸缓冲液溶解"用可见紫外分光光度计对藻胆蛋白粗提液进行全波段扫描,测得藻胆蛋白中藻红蛋白,藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的特征吸收波长"2.1.7一步提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的工艺流程称取脱脂条斑紫菜干粉(5.009)一)按料液比加水配液,室温下溶胀lh一)超声或微波辅助提取一)30e水浴浸提-)离心分离(5000r/min,20min),取上清液一)分析测定多糖和藻红蛋白提取得率,藻红蛋白纯度2.1.8试验方法的确定2.1.8.1藻红蛋白纯度的的测定藻红蛋白的纯度一般用其在可见光范围内的最大吸收峰的吸光值与其在280n工n处的蛋白质吸光值的比值来表示"对于紫菜藻红蛋白而言,其纯度按公式(2.1)计算:藻红蛋白纯度=On55s/ODZs"(2.1)2.1.8.2藻红蛋白提取得率测定方法据Bonnet等97报道,可运用LOWry等方法测定藻胆蛋白(轻基磷灰石柱分离)的浓度(以细胞色素c或其他蛋白质作标准曲线),并根据L田刀bert一Beer定律计算藻胆蛋白在某一波长处的摩尔消光系数,由此可算出混合藻胆蛋白提取液中各藻胆蛋白的相对浓度"在蓝藻和红藻粗提液中,往往含有两种以上的藻胆蛋白,条斑紫菜中含有丰富的藻红蛋白和少量藻蓝蛋白及异藻蓝蛋白,根据2.1.6中测得的藻胆蛋白的特征吸收波长,本实验中藻红蛋白的提取得率按公式(2.2)计算:藻红蛋白提取得率(%)二nV(0.123OD:5卜0.07OD6,7+0.015OD670)Gx100%(2.2)式2.2中n:提取液稀释倍数;v:提取液总体积(ml);G:原料重量(mg)2.1.8.3紫菜多糖提取得率测定方法许多有关紫菜多糖的研究都是建立在以葡萄糖作标准曲线的基础上,得到的也就是多糖的相对含量,还有就是乘以校正系数0.9来修饰98>"然而,实际上Yasuk"Yoshizawa等99,001报道,紫菜多糖是杂多糖,且半乳糖含量比葡萄糖高,达到水溶性多糖的64.2%,加上不同单糖及不同单糖组合与苯酚一硫酸试剂显色情况不同,因而采用葡萄糖作标准得到的相对含量或者乘以校正系数的测定结果难免会有误差,结果较真实含量往往偏低"本试验采用苯酚一硫酸比色法=-0-l,用D一半乳糖作标准,并用紫菜粗多糖测定出其对半乳糖的换算因子,对条斑紫菜多糖含量进行了测定,结果更接近真实含量"作标准曲线:配0.lmg/ml的D一半乳糖标准液,分别取0,0.2,0.