薄层色谱和纸层析

11.6 11.6 色谱分离法色谱分离法一、色谱分离法的历史二、基本概念三、萃取色谱分离法四、薄层色谱和纸色谱五、色谱分离法的应用第七小组制作色谱分离法的历史色谱分离法的历史 1901年，俄国植物学家茨维特将植物色素提取液加年，俄国植物学家茨维特将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在在柱中得到分离而形成洗柱子，结果使不同的色素在在柱中得到分离而形成不同颜色的谱带。混合色素通过碳酸钙微粒被分离成不同颜色的谱带。混合色素通过碳酸钙微粒被分离成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分离成不不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分离成不同色带的光谱现象一样。同色带的光谱现象一样。 1906年在一篇论文中将这种方法正式命名为色谱法，年在一篇论文中将这种方法正式命名为色谱法，色谱法由此得名色谱法由此得名。基本概念：基本概念：色谱分离法，简称色谱法也称层析法和色层法。色谱分离法，简称色谱法也称层析法和色层法。两相：两相：固定相和流动相固定相和流动相色谱法就是基于被分离物质在两相中分配系数的微小差别进色谱法就是基于被分离物质在两相中分配系数的微小差别进行分离，是一种多级分离技术。行分离，是一种多级分离技术。基本原理：基本原理：当固定相和流动相作相对移动时，被测物质在两相之间进当固定相和流动相作相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的分配，使原来微小的差异进一步扩大，从而行反复多次的分配，使原来微小的差异进一步扩大，从而使各组分分离。使各组分分离。优点：优点：分离效率高，能将各种极性相似的物质进行分离。分离效率高，能将各种极性相似的物质进行分离。萃取色谱分离法萃取色谱分离法方法原理：萃取色谱是将溶剂萃取与色谱分离技术相结合的萃取色谱是将溶剂萃取与色谱分离技术相结合的液相分配色谱，一般在柱上进行，为柱色谱。液相分配色谱，一般在柱上进行，为柱色谱。固定相：固定相：涂渍或吸留于多孔、疏水的惰性载体的有机萃取涂渍或吸留于多孔、疏水的惰性载体的有机萃取剂剂流动相：流动相：含有合适的无机化合物的水溶液含有合适的无机化合物的水溶液分离过程：把含有待测组分的试液置于色谱柱上层，把含有待测组分的试液置于色谱柱上层，加入流动相，被分离组分从柱顶随着流动加入流动相，被分离组分从柱顶随着流动相逐渐向下移动的同时，它们不断的在两相逐渐向下移动的同时，它们不断的在两相之间进行萃取和反萃取多次分配。相之间进行萃取和反萃取多次分配。快速柱色谱柱层析系统影响分离的主要因素影响分离的主要因素 固定相 载体 流动相一、固定相a.固定相固定相：有机萃取剂，或者有机分子以化学键与：有机萃取剂，或者有机分子以化学键与硅胶表面的硅羟基反反应所形成的化学键合固定相。硅胶表面的硅羟基反反应所形成的化学键合固定相。b.固定相的萃取剂的条件：固定相的萃取剂的条件：能被载体牢固吸附，在流动相中不溶解。能被载体牢固吸附，在流动相中不溶解。c.如何选择萃取剂？如何选择萃取剂？有机萃取剂种类很多，根据分离对象的不同进行选择。有机萃取剂种类很多，根据分离对象的不同进行选择。选择萃取剂的几个要点：选择萃取剂的几个要点：1、溶质在萃取剂中的溶解度要远远大于在原溶剂中、溶质在萃取剂中的溶解度要远远大于在原溶剂中的溶解度。的溶解度。2、萃取剂不能与原溶液中的溶质、溶剂反应。、萃取剂不能与原溶液中的溶质、溶剂反应。3、萃取剂要与原溶剂密度不同。、萃取剂要与原溶剂密度不同。4、萃取剂要不与原溶剂互溶、萃取剂要不与原溶剂互溶 二、载体a.固定相载体的要求：固定相载体的要求：惰性、多孔和孔径分布均匀、比惰性、多孔和孔径分布均匀、比表面大，有良好的物理和化学稳表面大，有良好的物理和化学稳定性。定性。b.常用的载体材料：常用的载体材料：硅藻土、硅胶、聚四氟乙烯及聚硅藻土、硅胶、聚四氟乙烯及聚乙烯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、泡沫塑乙酸乙烯酯共聚物、泡沫塑料、活性炭纤维等。料、活性炭纤维等。三、流动相a.通常，以无机酸作为流动相，所用无机酸通常，以无机酸作为流动相，所用无机酸的种类和浓度对分离因数影响较大，有时的种类和浓度对分离因数影响较大，有时加入无机盐以改变分离效果。加入无机盐以改变分离效果。b.常用：常用：硝酸、盐酸、硫酸及这些酸与无机盐的混硝酸、盐酸、硫酸及这些酸与无机盐的混合溶液。合溶液。由于流动相为水溶液，可以改变流动相的由于流动相为水溶液，可以改变流动相的酸度和加入络合剂提高分离效果。特别是酸度和加入络合剂提高分离效果。特别是含有某些络合物的流动相，会使一些组分含有某些络合物的流动相，会使一些组分被反萃取而实现分离。被反萃取而实现分离。萃取色谱法多用于无机分析。萃取色谱法多用于无机分析。操作步骤：a.用浸渍法制备固定相并平衡用浸渍法制备固定相并平衡将有机萃取剂溶于挥发性溶剂中，配成适当浓度将有机萃取剂溶于挥发性溶剂中，配成适当浓度的溶液，将适当粒度的载体加入并搅拌或振荡一的溶液，将适当粒度的载体加入并搅拌或振荡一段时间，让溶剂挥发，制得固定相。然后用段时间，让溶剂挥发，制得固定相。然后用510倍于载体体积的流动相流过色谱进行平衡。倍于载体体积的流动相流过色谱进行平衡。装柱要求装柱要求：装填均匀、致密、无气泡。：装填均匀、致密、无气泡。b.进样进样将试样液调至萃取所需的最佳条件，将试样液调至萃取所需的最佳条件，上柱，并控制一定流速流经色谱柱。上柱，并控制一定流速流经色谱柱。c.洗涤洗涤用同样的流速和与试液相似的水溶用同样的流速和与试液相似的水溶液洗涤柱床，以洗去柱内未被萃取液洗涤柱床，以洗去柱内未被萃取的其他成分。的其他成分。d.洗脱分离洗脱分离控制一定的温度和适合的流速，用流控制一定的温度和适合的流速，用流动相洗脱被分离组分。根据分离组分动相洗脱被分离组分。根据分离组分的性质选择最佳的流动相组成，使各的性质选择最佳的流动相组成，使各组分完全分离，多采用分步洗脱方法。组分完全分离，多采用分步洗脱方法。e.色谱柱的再生色谱柱的再生一般有两种分离方法：一般有两种分离方法：1、讲附有固定相的载体取出用有机溶剂洗、讲附有固定相的载体取出用有机溶剂洗去萃取剂，加热干燥除去残留有机溶剂，去萃取剂，加热干燥除去残留有机溶剂，重新用固定相浸渍载体。重新用固定相浸渍载体。2、在柱顶部加入萃取剂的有机溶剂溶、在柱顶部加入萃取剂的有机溶剂溶液，缓慢流过色谱柱，柱上浸渍补充载液，缓慢流过色谱柱，柱上浸渍补充载体附着的固定相，再用水洗去柱内的过体附着的固定相，再用水洗去柱内的过量有机相。量有机相。色谱分离原理小结 不同组分性质上的微小差别是色谱分离的必要条件 不同组分在两相中进行成千上万次的质量交换（分配）是色谱分离的充分条件为什么说色谱法是高效分离方法？ 沉淀、萃取单级分离相比，色谱是连续多级分离过程。物质间的分离特性差异在色谱过程被放大了，因此说色谱法是高效分离方法。 色谱分配系数色谱分配系数在色谱分离时，溶质随着流动相向前迁移，在这个过程中，它既能进入固定相，又能进入流动相，即在两相之间进行分配。分配系数定义为 对于确定的色谱体系，K值在低浓度和一定温度下是个常数，它的大小取决于的溶质的溶解、吸附、离子交换等性质。在色谱分离过程中，K值大的溶质，在固定相的停留时间长，移动速度慢。两个化合物之间的K值相差越大，越容易分离。薄层色谱和纸层析薄层色谱和纸层析 薄层色谱和纸色谱按固薄层色谱和纸色谱按固定相分类都属于定相分类都属于平面色谱平面色谱，按两相状态分类均为按两相状态分类均为液相色液相色谱法谱法 薄层色谱法是以铺在平面上支持薄层色谱法是以铺在平面上支持物体（如玻璃片）上的吸附剂薄层为物体（如玻璃片）上的吸附剂薄层为固定相的一中液相色谱法；纸色谱法固定相的一中液相色谱法；纸色谱法的载体多为滤纸，固定相是滤纸上吸的载体多为滤纸，固定相是滤纸上吸着的水分。着的水分。纸色谱纸色谱法（纸色谱法（Paper Chromatography, PC）是一类以滤纸）是一类以滤纸为载体的色谱法。它具有简单、分离效能较高、所需仪器为载体的色谱法。它具有简单、分离效能较高、所需仪器设备价廉、应用范围广泛等特点，因而在有机化学、分析设备价廉、应用范围广泛等特点，因而在有机化学、分析化学、生物化学等方面得到应用。化学、生物化学等方面得到应用。纸色谱实验方法纸色谱原理 滤纸由纤维素组成，通常它可以吸附滤纸由纤维素组成，通常它可以吸附20 %20 %的水，其中约的水，其中约6 %6 %的水是的水是与纤维素结合成复合物，构成纸色谱的固定相。而流动相为不与水相与纤维素结合成复合物，构成纸色谱的固定相。而流动相为不与水相溶的有机溶剂。这样的纸色谱法属于分配色谱。在纸色谱分离过程中，溶的有机溶剂。这样的纸色谱法属于分配色谱。在纸色谱分离过程中，由于滤纸纤维素的由于滤纸纤维素的毛细管现象毛细管现象，使溶剂在纸上渗透展开，使溶剂在纸上渗透展开 (development)(development)，这样样品组分在两相中作反复多次分配达到分离。，这样样品组分在两相中作反复多次分配达到分离。毛细管现象薄层色谱薄层色谱薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者毛细管、钢笔或者 其他工具将样品点染于薄板一端，其他工具将样品点染于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗简单，被用于对样品的粗 测、对有机合成反应进程的测、对有机合成反应进程的检测等用途。检测等用途。 薄层色谱固定相为吸附剂薄层色谱固定相为吸附剂（例如硅胶、活性氧化铝、纤（例如硅胶、活性氧化铝、纤维素等），一般将其均匀的涂维素等），一般将其均匀的涂在玻璃板上制成薄层板。在玻璃板上制成薄层板。一、方法原理一、方法原理 薄层色谱分离装置图示薄层色谱分离装置图示 1.1.首先把试液点在薄首先把试液点在薄层的一端离边缘一定距离层的一端离边缘一定距离处处2.晾干3.3.把点有试液的薄层板把点有试液的薄层板浸入到作为展开剂的流浸入到作为展开剂的流动相中（不要把试样点动相中（不要把试样点浸入），流动相装在加浸入），流动相装在加盖的层析缸中，并具有盖的层析缸中，并具有一定饱和的流动相蒸气一定饱和的流动相蒸气压。压。4.由于固定相吸附剂的毛细管作用，流动相沿着固定相薄层上升，遇到试样点，试样溶于流动相并在流动相和固定相之间进行吸附-解吸-再吸附-再解吸的多次分配过程。易被吸附的物质移动慢些，较难吸附的物质移动快些，由于试样中各组分对吸附剂的亲和力强弱不同而得以分离。二、比移值二、比移值ab原点原点 在平面色谱中，通常用比移值（在平面色谱中，通常用比移值（RfRf) )衡衡量各组分的分离情况。根据左图得到量各组分的分离情况。根据左图得到 Rf=a/bRf=a/ba a为斑点为斑点 中心到原点的距离（中心到原点的距离（cmcm）,b ,b为溶剂为溶剂前沿到原点的距离（前沿到原点的距离（cmcm）。）。 在确定的色谱条件下，在确定的色谱条件下，R Rf f值应为一常数，值应为一常数，其值在其值在0 10 1之间。利用之间。利用RfRf值的特征性可对各值的特征性可对各组分进行定性鉴定。实际分离中，各种物质组分进行定性鉴定。实际分离中，各种物质的的R Rf f值应控制在值应控制在0.05 0.850.05 0.85之间，两物质的之间，两物质的RfRf值差值应大于值差值应大于0.050.05才能分离。才能分离。影响影响Rf的主要因素的主要因素1.1.展开剂的展开剂的pHpH：弱酸和弱碱的离解受：弱酸和弱碱的离解受pHpH影响，离影响，离解度越大，极性越强，越易分配在极性强的一相；解度越大，极性越强，越易分配在极性强的一相；2.2.温度：温度变化会引起分配系数变化，也可能温度：温度变化会引起分配系数变化，也可能改变展开剂的组成；改变展开剂的组成；3.3.展开距离：在相同的条件下，展开距离大，展开距离：在相同的条件下，展开距离大，RfRf值大；值大；4.4.层析缸的饱和程度：未饱和时，层析缸的饱和程度：未饱和时，RfRf值可能增大；值可能增大；5.5.共存物质。共存物质。三三. .固定相固定相 薄层色谱的固定相除铺在玻璃板上的吸附剂硅薄层色谱的固定相除铺在玻璃板上的吸附剂硅胶、活性氧化铝、纤维素、及聚酰胺外，还有胶、活性氧化铝、纤维素、及聚酰胺外，还有在惰性薄层上涂的固定液，进行吸附分配分离。在惰性薄层上涂的固定液，进行吸附分配分离。 固定相的要求：固定相的要求：1. 1.有一定的比表面积、机械强有一定的比表面积、机械强度和稳定性；度和稳定性；2.2.在流动相中不溶解；在流动相中不溶解；3.3.具有可具有可逆吸附能力。逆吸附能力。 一些化合物的吸附能力大小顺序为：一些化合物的吸附能力大小顺序为： 饱和烃饱和烃不饱和烃不饱和烃醚醚酯酯醛醛酮酮胺胺羟基羟基化合物化合物酸和碱酸和碱四、流动相 正相薄层色谱中，流动相多为含有少许有机酸或碱的有机正相薄层色谱中，流动相多为含有少许有机酸或碱的有机溶剂；反相色谱则多采用无机酸水溶液。溶剂；反相色谱则多采用无机酸水溶液。 薄层色谱的展开剂主要根据试样的性质及分离机制选择。薄层色谱的展开剂主要根据试样的性质及分离机制选择。对于吸附性薄层色谱，主要考虑流动相级性，级性大小与洗脱能力成正对于吸附性薄层色谱，主要考虑流动相级性，级性大小与洗脱能力成正比，一些主要纯溶剂的极性大小顺序为：比，一些主要纯溶剂的极性大小顺序为： 石油醚石油醚 环乙烷环乙烷 四氯化碳四氯化碳 苯苯 甲苯甲苯 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 乙醚乙醚 乙乙酸乙酯酸乙酯 丙酮丙酮 正丙醇正丙醇 乙醇乙醇 甲醇甲醇 吡啶吡啶 酸酸 流动相可以用单一溶剂，也可用混合溶剂，来调整流动相的流动相可以用单一溶剂，也可用混合溶剂，来调整流动相的极性。极性。 一般对于极性物质，选择吸附活性小的吸附剂和极性大的流一般对于极性物质，选择吸附活性小的吸附剂和极性大的流动相；对于非极性物质，选择吸附活性大的吸附剂和极性小或非极性的动相；对于非极性物质，选择吸附活性大的吸附剂和极性小或非极性的流动相。流动相。萃取色谱分离法 萃取色谱分离法，萃取色谱分离法，用于无机物分离，实际上是一种反相分配色谱法，它具有萃取方法的简便性，又有色谱分离的高效性。实验时，通常是将有机萃取剂溶于挥发性溶剂中配成适当浓度的溶液，把载体浸渍在此溶液中，搅拌或振荡一端时间后，让溶剂挥发制成固定相。这里简单介绍一个应用：萃取色谱分离法 Th()Th()、Zr()Zr()和和UO22+UO22+混合物的反相分配色谱分混合物的反相分配色谱分离离 采用三正辛烷-纤维素色谱柱，分别10 mol.l-1 HCl，6 mol.l-1 HCl和0.05HNO3为洗脱液，可以将Th()、Zr()和UO22+很好地分离。薄层色谱法的应用 薄层色谱法薄层色谱法操作简便，广泛应用于各种有机物和无机物的分离鉴定，如用于研究反应历程，也可以在实验室制取少量纯品。这里简单介绍几个方面的应用： 1、反应终点的控制及产物的分离控制反应终点的控制及产物的分离控制 在化学反应进行到一定时间后，取少量反应液点样分析，了解还剩下多少原料未起作用，从而判断和控制反应终点。 对难分离的反应产物可采用柱色谱纯化，这时可采用点板分析确定分离程度。薄层色谱法的应用 2、产品质量控制及杂质检验产品质量控制及杂质检验 过去，有机产品的质量一般常以熔点等物理常数作为鉴定的指标来进行控制。用薄层色谱法来控制杂质限量，则灵敏度更高，结果更可靠，在一些国家的药典中已有使用。为此，取一定量的试样，点样展开后显色，除了主斑点外，不出现其它杂质斑点，或杂质斑点的大小及颜色深度不超过对照用的标准斑为产品合格。薄层色谱法的应用 3、分离检测植物中的维生素分离检测植物中的维生素B1B1，B2B2，B6B6固定相：硅胶G+0.5%CMC水溶液(1:3),质量体积比 流动相(展开剂)：氯仿-乙醇-丙酮-氨水(20:20:20:10,V/V)提取液:水饱和的正丁醇-6%TritonX-100乙醇(23:2),体积比用薄层双波长扫描仪测定。纸色谱法应用举例 纸色谱法纸色谱法不仅适用于分离水溶性或极性较大的有机物的分离和检出，也可以用于分离和检出无机化合物。这里简单介绍几个方面的应用： 1、氨基酸分离氨基酸分离氨基酸的分离一般需用双向展开先用酚/水（7：3）展开剂做第一次展开再用丁醇/醋酸/水（4:1:2）展开剂作第二次展开然后用茚三酮溶液显色，可分离出约20种氨基酸。纸色谱法应用举例2、菠菜提取液的辐射纸色谱菠菜提取液的辐射纸色谱 新华1#滤纸 展开剂展开剂为： 石油醚-乙醚-甲醇(30:10:0.5)The endThank you!Group 7