4高效液相色谱法

第四章第四章 高效液相色谱法高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 本章要求本章要求 了解高效液相色谱法的优缺点了解高效液相色谱法的优缺点 了解高效液相色谱仪的结构了解高效液相色谱仪的结构 掌握常用检测器的原理及应用范围掌握常用检测器的原理及应用范围定义：以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法定义：以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）：）：20世纪世纪60年代末年代末70年代年代技术：技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器特点：速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化特点：速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化一、一、 概述概述4.1 高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介1高效液相色谱法与经典液相色谱法比较高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 高速：高速：HPLC分离效率高，速度快，一次几分钟和几十分钟分离效率高，速度快，一次几分钟和几十分钟就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上。就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上。 高效：高效：HPLC高压高压(26 MPa)下操作，填料颗粒小下操作，填料颗粒小(250 m)，规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高(N=400060000 块块/m)，分离效率高。，分离效率高。 高灵敏度：高灵敏度：现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测限可达限可达10-9 g；荧光检测器最小检测限可达；荧光检测器最小检测限可达10-1110-13 g。 高自动化：高自动化：HPLC进样量小进样量小(XX0 L)。带有自动进样装置。带有自动进样装置和工作站。和工作站。2高效液相色谱法与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法的比较 适用范围适用范围 GC适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物，适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物，HPLC不受此种限制。气相色谱一般都在不受此种限制。气相色谱一般都在较高温度较高温度下进行，下进行，而高效液相色谱法则经常可在而高效液相色谱法则经常可在室温条件室温条件下工作。下工作。 流动相流动相 GC流动相仅运载样品，不起分离作用，但无毒，易于流动相仅运载样品，不起分离作用，但无毒，易于处理。而处理。而HPLC流动相除了运载样品外，还有分离作用，可流动相除了运载样品外，还有分离作用，可改变流动相组成，进行有效的分离。但流动相一般有毒，费改变流动相组成，进行有效的分离。但流动相一般有毒，费用高。用高。 色谱柱色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效很高很高(理论塔板数理论塔板数N=104106)。HPLC柱较短，一般为柱较短，一般为1525 cm，柱效，柱效(理论塔板数理论塔板数N=103104)，低于，低于GC柱。柱。 检测器检测器 与与GC相比，相比，HPLC检测器种类较多。检测器种类较多。 制备色谱制备色谱 GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。HPLC可进行制备，即制备色谱。可进行制备，即制备色谱。一一高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪的结构 4.2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪一般一般分为分为4个主要个主要部分：部分：高压输液系统、进样系统、分高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度洗此外还配有辅助装置：如梯度洗脱、自动进样及数据处理等。脱、自动进样及数据处理等。工作过程如下：工作过程如下： 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 数据分析系统输液系统输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统HPLC的系统组成的系统组成数据处理系统数据处理系统1. 高压输液系统：高压输液系统： 一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。成，其中高压输液泵是核心部件。高压泵应满足如下要求：高压泵应满足如下要求：流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。能抗溶剂的腐蚀，耐酸、耐碱。能抗溶剂的腐蚀，耐酸、耐碱。有较高的输送压力。一般分离，有较高的输送压力。一般分离，6.0104 Pa压力；高效分压力；高效分离，要求达到离，要求达到1.53.0107 Pa的压力或更高。的压力或更高。 泵的死体积要小，便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。泵的死体积要小，便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种: : 恒流泵恒流泵 是在一定操作条件下，输出流量恒定，与是在一定操作条件下，输出流量恒定，与色谱柱引起阻力变化无关。色谱柱引起阻力变化无关。 恒压泵恒压泵 能保持输出压力恒定，其流量随色谱系统能保持输出压力恒定，其流量随色谱系统阻力而变化，保留时间的重现性差。阻力而变化，保留时间的重现性差。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵，恒流泵又称机械目前恒流泵正逐渐取代恒压泵，恒流泵又称机械泵，又分泵，又分机械注射泵和机械往复泵机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多两种，应用最多的是的是机械往复泵机械往复泵。 在分离过程中，使流动相的在分离过程中，使流动相的组成、极性、组成、极性、pH等等按一定程序连续变化，使样品中各组分能在按一定程序连续变化，使样品中各组分能在最最佳条件下佳条件下出峰，保留时间短、拥挤不堪甚至重出峰，保留时间短、拥挤不堪甚至重叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离。得很好的分离。通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力，梯，梯度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。梯度洗脱的优点：梯度洗脱的优点： 改善峰形；改善峰形； 提高柱效；提高柱效； 减少分析时间；减少分析时间；使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，保持良好的柱性能使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，保持良好的柱性能（但进行下次分析时，更换流动相达到平衡时间长）。（但进行下次分析时，更换流动相达到平衡时间长）。 梯度洗脱梯度洗脱与气相色谱的与气相色谱的程序升温程序升温十分类似，两者的目的相十分类似，两者的目的相同，不同的是程序升温是通过同，不同的是程序升温是通过改变柱温改变柱温，而液相色谱的梯，而液相色谱的梯度洗脱是度洗脱是通过改变流动相的组成、极性、通过改变流动相的组成、极性、pH来达到来达到改变改变k的目的的目的。在高效液相色谱中，常用的进样方式：在高效液相色谱中，常用的进样方式：高压阀进样：高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样量需用不同的量需用不同的定量管定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。，同时峰的扩展也比注射进样大。微量注射器进样：微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品，也可由微量注射器注入取样环少量样品，即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。2. 进样系统进样系统3. 分离系统分离系统-色谱柱色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限，内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长故金属管用得较多。一般色谱柱长1530 cm，内径，内径为为45 mm，凝胶色谱柱内径，凝胶色谱柱内径312 mm，制备柱内径，制备柱内径较大，可达较大，可达25 mm 以上。以上。 固定相固定相 表面多孔固定相表面多孔固定相 全多孔微粒固定相全多孔微粒固定相直径直径210 m，孔径，孔径2100 nm， 比表面积比表面积x00 x0m2/g。现在最广泛采用的填料是全多孔微粒硅胶现在最广泛采用的填料是全多孔微粒硅胶12 m直径直径1025 m 化学键合固定相化学键合固定相 化学键合相色谱柱化学键合相色谱柱 虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或全多孔硅胶上作固定相，但有许多缺点，因此现在多全多孔硅胶上作固定相，但有许多缺点，因此现在多采用化学键合固定相。采用化学键合固定相。化学键合固定相是在表面多孔化学键合固定相是在表面多孔或全多孔硅胶表面上利用化学反应法通过化学键把有或全多孔硅胶表面上利用化学反应法通过化学键把有机分子结合在载体表面。机分子结合在载体表面。 键合类型：键合类型： 疏水基团：如疏水基团：如C8、C18； 极性基团：极性基团：如丙氨基如丙氨基(-C3H6NH2)、氰乙基、氰乙基(-C2H4CN)； 离子交换基团，如阴离子交换（离子交换基团，如阴离子交换（-NR3Cl）、阳离子）、阳离子（-SO3H）；键合途径：）；键合途径： SiOC 键型键型 SiOSiC 键型键型 (最常用最常用) SiC 键型键型Si-OHROHSi-O-RH2OSi-OH R3SiClSi-O-SiR3HClSi-OHSOCl2Si-Cl(+SO2+HCl)Si-R(+MgCl2)RMgClo煤煤油油H2OCH3CNCH3OH 流动相流动相 正相色谱正相色谱 极性：流动相固定相极性：流动相固定相 反相色谱反相色谱 极性：流动相固定相极性：流动相固定相a 流动相纯度要高，与流动相纯度要高，与固定相不相溶固定相不相溶，不发生不发生化学反应化学反应b 价格便宜，毒性小，易于纯化价格便宜，毒性小，易于纯化c 对试样溶解度适宜，不发生沉淀对试样溶解度适宜，不发生沉淀d 粘度小粘度小e 与检测器匹配与检测器匹配极性顺序：水乙腈甲醇四氢呋喃环己烷煤油极性顺序：水乙腈甲醇四氢呋喃环己烷煤油4. 检测系统检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器在液相色谱中，有两种基本类型的检测器: 溶质性检测器溶质性检测器：仅对被分离组分的物理或化学特性仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，有紫外有响应，有紫外UVD、荧光、荧光FD、二极管阵列检测器、二极管阵列检测器DAD等。等。 总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或化学性质总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，有示差折光检测器有响应，有示差折光检测器RID、电化学检测器、电化学检测器ECD、蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器ELSD和质谱检测器和质谱检测器MSD等。等。 P65，表，表4-3药典中的液相色谱检测器药典中的液相色谱检测器常用的检测器常用的检测器:(1) 紫外光度检测器：紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅是一种选择性浓度检测器，仅对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。 作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。 结构：结构：1低压汞灯低压汞灯 2透镜透镜 3遮光板遮光板 4测量池测量池 5参比池参比池 6紫外滤光片紫外滤光片 7双紫外光敏电阻双紫外光敏电阻现在多数采用氘灯作为紫外光源现在多数采用氘灯作为紫外光源 灯灯流动池流动池 光电二极管光电二极管RS 样品入口样品入口Hg 254Zn 214Cd 229D2 可变可变UV 检测检测器器To amplifier优点：灵敏度高（最小检测度优点：灵敏度高（最小检测度109 g/mL），对温度和），对温度和流速不敏感，可用于流速不敏感，可用于梯度洗脱梯度洗脱；缺点：只能用于对紫外光有吸收组分的测定，溶剂的选缺点：只能用于对紫外光有吸收组分的测定，溶剂的选择受限制。择受限制。 在高效液相色谱中应用最广，约占在高效液相色谱中应用最广，约占70%。适于梯度。适于梯度洗脱，对流动相速度变化不敏感，流动相组成的变化对洗脱，对流动相速度变化不敏感，流动相组成的变化对检测器响应几乎无影响。检测器响应几乎无影响。 对于在紫外对于在紫外-可见光区无强吸收的组分，需要经过可见光区无强吸收的组分，需要经过衍生化，才可以用紫外检测器，如糖类衍生化，才可以用紫外检测器，如糖类、氨基酸氨基酸、类脂类脂化物化物。不能用在紫外不能用在紫外-可见光有吸收的溶剂作流动相。可见光有吸收的溶剂作流动相。溶溶剂剂透过波长下限透过波长下限溶溶剂剂透过波长下限透过波长下限水水180n-庚烷庚烷197甲醇甲醇210环乙胺环乙胺200n-丙醇二酸丙醇二酸205四氯化碳四氯化碳265乙腈乙腈190氯仿氯仿245THF230苯苯280丙酮丙酮330甲苯甲苯285乙酸甲酯乙酸甲酯260二氯甲烷二氯甲烷232乙酸乙酯乙酸乙酯260四氯乙烯四氯乙烯280硝基甲烷硝基甲烷3801,2-二氯乙烷二氯乙烷225常用溶剂透过波长限：常用溶剂透过波长限：(2) 光二极管阵列检测器：光二极管阵列检测器： 是一种更为先进的检测器。从氘灯辐射通过移动是一种更为先进的检测器。从氘灯辐射通过移动部件（光闸），直接通过吸收池、狭缝、光栅，分部件（光闸），直接通过吸收池、狭缝、光栅，分光后分别照射约千个二极管阵列检测器上，约光后分别照射约千个二极管阵列检测器上，约10 ms给出一次信号，保证保留时间极短的色谱组分的给出一次信号，保证保留时间极短的色谱组分的光谱图不失真。因此数据重现性好，灵敏度高，适光谱图不失真。因此数据重现性好，灵敏度高，适于痕量分析于痕量分析。 P66 图图4.10所示所示 光电二极管阵列光电二极管阵列检测检测器器 氘灯氘灯 棱镜棱镜池子池子 全息光栅全息光栅二极管阵列二极管阵列512 Diodes190 - 950 nm优点：优点：获得吸收值是保留时间和波长函数的类似于等获得吸收值是保留时间和波长函数的类似于等高线的三维图；由于获得多种信息，使每一个组分在高线的三维图；由于获得多种信息，使每一个组分在整个波长范围内的光谱信息大大增加，及时得出每一整个波长范围内的光谱信息大大增加，及时得出每一组分的色谱图相应的光谱数据，确定最佳选择性和灵组分的色谱图相应的光谱数据，确定最佳选择性和灵敏度的波长；可以与色谱工作站联用，对每一个峰从敏度的波长；可以与色谱工作站联用，对每一个峰从程序库中进行检索来确定该化合物。程序库中进行检索来确定该化合物。例如：菲的三维谱图如下例如：菲的三维谱图如下 荧光检测器：荧光检测器：是利用某些试样具有荧光特性来检验的。许多有机化合物是利用某些试样具有荧光特性来检验的。许多有机化合物具有天然荧光活性，其中带有芳香基团的化合物具有荧具有天然荧光活性，其中带有芳香基团的化合物具有荧光活性很强。一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比。光活性很强。一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比。荧光检测器是一种选择性检测器，适合于含有荧光检测器是一种选择性检测器，适合于含有-共轭体系共轭体系的大分子、结构复杂的化合物，如稠环芳烃、甾族化合的大分子、结构复杂的化合物，如稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等物质的测定。物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等物质的测定。最小检测限可达最小检测限可达10-11 10-13 g，可以用，可以用梯度洗脱梯度洗脱。(4) 示差折光检测器：示差折光检测器： 是一种中等灵敏度是一种中等灵敏度(106 g /mL)的通用型检测器。的通用型检测器。是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的差别进行检测的。差别进行检测的。可分为三类：可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常。常用前两种。用前两种。优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器；优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器；缺点：对温度变化敏感，缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱。应用范围：聚合物应用范围：聚合物, , 糖。还用于分析以紫外检测和荧光糖。还用于分析以紫外检测和荧光检测器无法检测的样品。检测器无法检测的样品。(5) 蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSD） 结构结构光光源源检检测测器器雾雾化化散散射射光光蒸蒸发发柱柱检检测测HPLCN2 ELSD是是90年代研制的，是年代研制的，是利用在一定条件下粒子的数量不变，利用在一定条件下粒子的数量不变，光散射强度正比于光散射强度正比于由溶质浓度决定的粒子的大小而进行测量的。由溶质浓度决定的粒子的大小而进行测量的。 ELSD原理是原理是基于光线通过微小的粒子时产生光散射现象基于光线通过微小的粒子时产生光散射现象。由色。由色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中被高速的载气流（氮气或空谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中被高速的载气流（氮气或空气）喷成一种薄雾，进入蒸发器后蒸发成蒸气，再被气）喷成一种薄雾，进入蒸发器后蒸发成蒸气，再被光阱光阱捕集，以捕集，以防止反射。防止反射。蒸气态的溶剂蒸气态的溶剂通过光路后，光线反射到检测器后被记录通过光路后，光线反射到检测器后被记录成成基线基线。云雾状溶质颗粒云雾状溶质颗粒通过光路时，使光线散射后被光电倍增管通过光路时，使光线散射后被光电倍增管收集得到收集得到样品信号样品信号。 ELSD是示差折光检测器的新型替代品，样品主要用于不产生荧是示差折光检测器的新型替代品，样品主要用于不产生荧光和又无紫外吸收的有机物如糖类、高级脂肪酸、磷脂、甘油三酯、光和又无紫外吸收的有机物如糖类、高级脂肪酸、磷脂、甘油三酯、维生素、甾类皂苷等物质的测定。对梯度洗脱和流动相系统温度变维生素、甾类皂苷等物质的测定。对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感；化不敏感；可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱。ELSD的优缺点：的优缺点： 通用性强，灵敏度高。通用性强，灵敏度高。 对流动相系统温度变化不敏感，可进行梯度洗脱。对流动相系统温度变化不敏感，可进行梯度洗脱。 响应因子具有一致性。响应值仅取决于光束中溶质颗粒的大小响应因子具有一致性。响应值仅取决于光束中溶质颗粒的大小和数量，检测器对有的物质几乎具有相同的响应因子。和数量，检测器对有的物质几乎具有相同的响应因子。 可消除流动相和杂质的干扰，提高分辩率。用于磷脂、皂甙、可消除流动相和杂质的干扰，提高分辩率。用于磷脂、皂甙、糖、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数小的化合物检测。糖、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数小的化合物检测。 便于应用质谱分析。因为蒸发光散射质量检测器与质谱条件的便于应用质谱分析。因为蒸发光散射质量检测器与质谱条件的要求是一致的。要求是一致的。 受样品组分和流动相挥发性因素限制。要求样品组分应是非挥受样品组分和流动相挥发性因素限制。要求样品组分应是非挥发性或半挥发性的，而流动相应是挥发性溶剂。发性或半挥发性的，而流动相应是挥发性溶剂。 对某些样品线性范围窄，有时不呈现线性关系，定量分析复杂。对某些样品线性范围窄，有时不呈现线性关系，定量分析复杂。 电化学检测器：电化学检测器：安培检测器：安培检测器：由三电极系统与恒电位仪相连接。工作电极为玻璃或石墨电极，由三电极系统与恒电位仪相连接。工作电极为玻璃或石墨电极，辅助电极是铂丝；从柱后流出物进入反应池，在工作电极表面发生氧化辅助电极是铂丝；从柱后流出物进入反应池，在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极之间有电流通过，电流大小与被测物浓度成正比。或还原反应，两电极之间有电流通过，电流大小与被测物浓度成正比。只能检测电化学活性物质。该检测器选择性好，灵敏度高。如：对肾上只能检测电化学活性物质。该检测器选择性好，灵敏度高。如：对肾上腺素和去甲肾上腺素，检测限达腺素和去甲肾上腺素，检测限达10-12g。极谱检测器：极谱检测器： 基于被测组分可在电极上发生氧化还原反应而设计的一种检测器。可用基于被测组分可在电极上发生氧化还原反应而设计的一种检测器。可用于测定具有极谱活性的物质，如药物、维生素、有机酸、苯胺等。它的于测定具有极谱活性的物质，如药物、维生素、有机酸、苯胺等。它的灵敏度高，适于痕量分析。灵敏度高，适于痕量分析。电导检测器：电导检测器：主要用于离子色谱。原理是基于物质在某些介质中电离后所产主要用于离子色谱。原理是基于物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质的含量。电导检测器对生电导变化来测定电离物质的含量。电导检测器对pH 7时不够灵敏，时不够灵敏，受温度影响较大。受温度影响较大。 P65表表6-35. 附属系统附属系统 包括脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、馏分收集以包括脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中及数据处理等装置。其中脱气和梯度洗脱装置脱气和梯度洗脱装置是高压是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。液相色谱仪中尤为重要的附属装置。 脱气的目的：脱气的目的：是为了防止流动相从高压柱内流出是为了防止流动相从高压柱内流出，释释放出气泡放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检常检测测；溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动；溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应；溶解气体还会引起某样品相或固定相发生化学反应；溶解气体还会引起某样品的氧化降解，带来误差。通常办法是把气泡排出。的氧化降解，带来误差。通常办法是把气泡排出。 常用方法：常用方法： 低压脱气，电磁搅拌，水泵抽真空，加热。低压脱气，电磁搅拌，水泵抽真空，加热。 以以He脱气，脱气，He在液体中溶解度最小。在液体中溶解度最小。 超声波脱气。超声波脱气。 在线真空脱气。在线真空脱气。 由于塑料膜管线由于塑料膜管线的膜可让气体透过液的膜可让气体透过液体无法透过，所以通体无法透过，所以通过真空泵脱气降压实过真空泵脱气降压实现在线脱气。现在线脱气。4.3 高效液相色谱的应用高效液相色谱的应用定性应用：保留时间、相对保留值、保留指数定性应用：保留时间、相对保留值、保留指数定量应用：外标法、内标法、归一化法定量应用：外标法、内标法、归一化法联用技术：联用技术： HPLC-MS HPLC-MS-MSHPLC-PDADHPLC-IRHPLC-NMR离子色谱法是色谱法的一个分支，是一种比较常用的分析技术。它离子色谱法是色谱法的一个分支，是一种比较常用的分析技术。它将色谱的将色谱的“高效高效”分离技术和离子的自动检测技术相结合的一种分分离技术和离子的自动检测技术相结合的一种分析技术。通常从离子交换柱中流出的各种离子可用电导检测器直接析技术。通常从离子交换柱中流出的各种离子可用电导检测器直接检测离子含量。检测离子含量。以双柱型离子色谱仪测定水中以双柱型离子色谱仪测定水中F-为例：为例： 分离柱：分离柱： 低容量阴离子交换树脂；低容量阴离子交换树脂； 抑制柱：抑制柱： 强酸型阳离子交换树脂；强酸型阳离子交换树脂； 淋洗液：淋洗液： Na2CO3 NaHCO3或或 (NaOH)离子色谱法原理离子色谱法原理 试样溶液与强电解质淋洗液一起，流经低容量离子交换柱，待试样溶液与强电解质淋洗液一起，流经低容量离子交换柱，待测离子顺次流入抑制柱，以中和淋洗液，电导显著降低，并使阴离测离子顺次流入抑制柱，以中和淋洗液，电导显著降低，并使阴离子转变为强电离的酸，进入电导检测器进行检测。此时，待测离子子转变为强电离的酸，进入电导检测器进行检测。此时，待测离子的浓度在一定范围内与溶液的电导率成线性关系，可以定量分析。的浓度在一定范围内与溶液的电导率成线性关系，可以定量分析。离子色谱离子色谱 计算机计算机积分仪积分仪记录仪记录仪贮液器贮液器样品注入样品注入泵泵分离柱分离柱抑制柱抑制柱电导池电导池 用电导检测器分析阴离子用电导检测器分析阴离子 本章要求本章要求 了解高效液相色谱法的优缺点了解高效液相色谱法的优缺点 了解高效液相色谱仪的结构了解高效液相色谱仪的结构 掌握常用检测器的原理及应用范围掌握常用检测器的原理及应用范围