现代分析技术与应用：第十八章 高效液相色谱法

第十八章第十八章 高效液相色谱法高效液相色谱法 High performance liquid chromatography；HPLCn固定相固定相 刚性固体或硬胶n流动相流动相 液体（有机溶剂或水等）n分离机制分离机制液液分配色谱、液固吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱与亲和色谱高效液相色谱法高效液相色谱法高效高效液相色谱法与液相色谱法与经典经典液相色谱法液相色谱法n高压输液泵高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快输送流动相，流速快，分析速度快n颗粒极细（一般为颗粒极细（一般为1010 m m以下）、规则均匀的以下）、规则均匀的固定相固定相，传质阻抗小传质阻抗小，柱效高，分离效率高，柱效高，分离效率高n高灵敏度检测器高灵敏度检测器，紫外检测器最小检测限可达，紫外检测器最小检测限可达1010 9 9g g，荧光检测器最小检测限可达荧光检测器最小检测限可达1010 1212g g与与气相色谱法气相色谱法相比相比气相气相液相液相分析对象气体及沸点低的化合物（20%）高沸点、热稳定性差，摩尔质量大的物质（80%）流动相气体（仅运载）液体（与组分间有亲和力，参与固定相对组分的竞争）柱温较高温度室温及以上高效液相色谱流程图高效液相色谱流程图第一节第一节 主要类型和原理主要类型和原理n亲合色谱法（亲合色谱法（affinity chromatographyaffinity chromatography；ACAC）n手性色谱法（手性色谱法（chiral chromatographychiral chromatography；CCCC）n胶束色谱法（胶束色谱法（micellar chromatographymicellar chromatography；MCMC）n电色谱法（电色谱法（electrochromatographyelectrochromatography；ECEC）n生物色谱法生物色谱法( (biochromatography;BCbiochromatography;BC) )主要类型主要类型分离机制分类分离机制分类n化学键合相色谱法化学键合相色谱法n离子抑制色谱法离子抑制色谱法n离子对色谱法离子对色谱法主要类型主要类型固定相类型分类固定相类型分类主要类型主要类型n分配色谱法（分配色谱法（partition chromatographypartition chromatography）n吸附色谱法（吸附色谱法（adsorption chromatographyadsorption chromatography）n离子交换色谱法（离子交换色谱法（IECIEC）n空间排阻色谱法（空间排阻色谱法（SECSEC）分离机制分类分离机制分类基本要求：基本要求：n颗粒细且均匀n传质快n机械强度高、耐高压n化学稳定性好，不与流动相发生反应高效液相色谱法高效液相色谱法固定相固定相化学键合相色谱法化学键合相色谱法 n化学键合相化学键合相 采用采用化学反应化学反应的方法将的方法将官能团键合官能团键合在在载体载体表表面所形成的固定相面所形成的固定相n分离几乎所有类型的化合物，分离几乎所有类型的化合物，应用最广应用最广固定相固定相化学键合相色谱法化学键合相色谱法 优点优点n固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；n柱效高；重现性好；n能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高n正相、反相键合相色谱法：正相、反相键合相色谱法：根据化学键合相（官能团）与流动相极性的相对强弱根据化学键合相（官能团）与流动相极性的相对强弱化学键合相色谱法化学键合相色谱法 分类分类非极性非极性非极性烃基非极性烃基C C1818C C8 8C C1 1与苯基等键与苯基等键合合反相色谱反相色谱弱极性键弱极性键醚基和二羟基醚基和二羟基反相或正相色谱反相或正相色谱极性极性氨基氨基氰基键合相键氰基键合相键合合硅胶硅胶正相色谱正相色谱键合相的性质和特点键合相的性质和特点n键合反应键合反应 硅氧烷（硅氧烷（SiSiO OSiSiC C）型：氯硅烷与硅胶进行）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷硅烷 化反应化反应 22SiOHClCH+SiSiSiClH18OR118HC3737RRR1化学键合相色谱法化学键合相色谱法 ODSODS键合相：键合相：n含碳量含碳量：含碳的百分数：含碳的百分数 n覆盖度覆盖度：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例数的比例 n封尾封尾（end-cappingend-capping）：在键合反应后，用三甲基）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。键合相的性质键合相的性质化学键合相色谱法化学键合相色谱法 n使用过程中不流失；使用过程中不流失；n化学稳定性好；化学稳定性好；n适于梯度洗脱；适于梯度洗脱；n载样量大载样量大 注：注：流动相的流动相的pHpH一般应在一般应在2-82-8键合相的特点键合相的特点化学键合相色谱法化学键合相色谱法 其他种类的固定相其他种类的固定相n键合型离子交换剂（键合型离子交换剂（ion exchanger)ion exchanger)。n手性固定相（手性固定相（chiral stationary phase)chiral stationary phase)n亲和色谱固定相亲和色谱固定相化学键合相色谱法化学键合相色谱法要求要求：n与固定相与固定相不发生化学反应不发生化学反应。n对试样有适宜的溶解度。使对试样有适宜的溶解度。使k k在在1 11010范围内，范围内，n与检测器相适应与检测器相适应。 紫外检测器：溶剂截止波长应小于检测波长紫外检测器：溶剂截止波长应小于检测波长n纯度高，粘度小。以降低柱压，提高柱效纯度高，粘度小。以降低柱压，提高柱效 流动相流动相流动相对分离的影响流动相对分离的影响n n: :固定相性能决定固定相性能决定: :溶剂种类溶剂种类k k: :溶剂配比溶剂配比2211-4nkkR化学键合相色谱法化学键合相色谱法流动相流动相n溶剂的极性（强度）溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 n溶剂的选择性溶剂的选择性溶剂分子间的作用力不同，选择性不同溶剂分子间的作用力不同，选择性不同 n混合溶剂混合溶剂（二元或多元流动相）（二元或多元流动相） 正己烷正己烷- -异丙醇，甲醇异丙醇，甲醇- -乙腈乙腈 化学键合相色谱法化学键合相色谱法流动相流动相化学键合相色谱法化学键合相色谱法流动相流动相化学键合相色谱法化学键合相色谱法流动相流动相化学键合相色谱法化学键合相色谱法流动相流动相不同组别的溶剂组合可以提高分离的选择性不同组别的溶剂组合可以提高分离的选择性n正相化学键合相色谱法正相化学键合相色谱法n反相化学键合相色谱法反相化学键合相色谱法n反相离子对色谱法反相离子对色谱法n其他高效液相色谱法其他高效液相色谱法离子色谱法、手性色谱法、亲和色谱法离子色谱法、手性色谱法、亲和色谱法高效液相色谱法的分离高效液相色谱法的分离P389P389内容合并与此部分内容合并与此部分正相键合相色谱法正相键合相色谱法n适用范围：适用范围：中等极性的分子型化合物中等极性的分子型化合物n固定相：固定相：极性键合相极性键合相氰基（氰基（CNCN）：含双键化合物）：含双键化合物氨基（氨基（NHNH2 2）：多基团如甾体、糖类等）：多基团如甾体、糖类等或二羟基键合硅胶或二羟基键合硅胶分离条件的选择分离条件的选择n 流动相：流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂非极性或弱极性溶剂加极性调整剂烷烃加醇类烷烃加醇类n分离机制：分离机制： 分配：组分在两相的溶解分配：组分在两相的溶解 吸附：组分与键合极性基团间的诱导、氢键和定向吸附：组分与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用作用正相键合相色谱法正相键合相色谱法分离条件的选择分离条件的选择n分离选择性分离选择性键合相种类、流动相强度、试样性质键合相种类、流动相强度、试样性质1.1.极性强的组分极性强的组分k k大，后洗脱出柱。大，后洗脱出柱。2.2.流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k k减小，减小，t tR R 减小减小正相键合相色谱法正相键合相色谱法反相键合相色谱法反相键合相色谱法n适用：非极性至中等极性的组分，有机酸、碱及盐等适用：非极性至中等极性的组分，有机酸、碱及盐等 n固定相固定相：非极性键合相：非极性键合相 十八烷基硅烷（十八烷基硅烷（C C1818，ODSODS），应用最广），应用最广 辛烷基（辛烷基（C C8 8）键合硅胶）键合硅胶 短短链烷烃键合相：极性化合物链烷烃键合相：极性化合物苯基键合相：芳香化合物及多羟基化合物苯基键合相：芳香化合物及多羟基化合物n流动相流动相：水水+ +与水混溶的与水混溶的极性调整剂极性调整剂 甲醇水甲醇水, ,最常用；乙腈水等，末端吸收的检测最常用；乙腈水等，末端吸收的检测n弱酸、弱碱或缓冲盐为弱酸、弱碱或缓冲盐为抑制剂抑制剂调节流动相调节流动相PH,PH,抑制组分分解抑制组分分解n0.1-1%0.1-1%醋酸盐、磷酸盐醋酸盐、磷酸盐减弱固定相表面硅醇基的干扰作用减弱固定相表面硅醇基的干扰作用反相键合相色谱法反相键合相色谱法分离条件的选择分离条件的选择溶质的分子结构溶质的分子结构( (极性）极性）n极性越弱，疏水性越强，极性越弱，疏水性越强，k k越大，越大，t tR R也越大也越大n同系物碳数越多，极性越弱，同系物碳数越多，极性越弱，k k越大越大n引入引入极性取代基，降低疏水性，极性取代基，降低疏水性，k k值变小值变小 反相键合相色谱法反相键合相色谱法保留行为的主要影响因保留行为的主要影响因素素固定相固定相n键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质k增大。n硅胶表面键合烷基的浓度越大，溶质的k越大反相键合相色谱法反相键合相色谱法保留行为的主要影响因保留行为的主要影响因素素流动相流动相 n极性越强，洗脱能力越弱，溶质k越大,tR越大n水(弱溶剂)-醇(强溶剂),n水的比例增加，k增大npH：影响弱酸、弱减的离解(离子抑制色谱法）n流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小反相键合相色谱法反相键合相色谱法保留行为的主要影响因保留行为的主要影响因素素离子抑制色谱法离子抑制色谱法n用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的的pHpH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使水缔合作用，使k k变大变大n适用于适用于3p3pK Ka7a7的弱酸、的弱酸、7p7pK Ka8a8的弱碱的弱碱反相键合相色谱法反相键合相色谱法n方法：方法：把把离子对试剂离子对试剂加入到加入到含水流动相含水流动相中，组分离中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ioncounter ion）生成生成中性离子对中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，增加溶质与非极性固定相的作用，使使k k增加，改善分离效果。增加，改善分离效果。 n正相离子对色谱法（基本不用）正相离子对色谱法（基本不用）n反相离子对色谱法（更常用）反相离子对色谱法（更常用）反相离子对色谱法反相离子对色谱法 离子对模型离子对模型33+()+3s3(+固定相固定相+()+B)+B + H+BHRSO NaRSO + Na+BH RSORSO)BH离子对mB+AB AmA(smBAmmmsmsBAAABABBABEK流动相流动相通式通式反相离子对色谱法反相离子对色谱法 n适用范围适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物合物的混合物n酸类或带负电荷物质酸类或带负电荷物质：季铵盐，如四丁基铵磷酸盐：季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBATBA）和溴化十六烷基三甲基铵（）和溴化十六烷基三甲基铵（CTABCTAB）等）等n碱类或带正电荷的物质碱类或带正电荷的物质：烷基磺酸盐或硫酸盐，如：烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（正戊烷基磺酸钠（PICBPICB5 5）、正己烷基磺酸钠）、正己烷基磺酸钠（PICBPICB6 6）反相离子对色谱法反相离子对色谱法 n固定相固定相 表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相n离子对试剂离子对试剂 所带的电荷应与试样离子的电荷相反所带的电荷应与试样离子的电荷相反 n流动相流动相pHpH 使试样组分与离子对试剂全部离子化使试样组分与离子对试剂全部离子化n有机溶剂及其浓度有机溶剂及其浓度反相离子对色谱法反相离子对色谱法分离条件分离条件 n离子对试剂的种类和浓度离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的：碳链长度增加，溶质的k k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k k增大增大 n流动相的流动相的pHpH：有利于组分和离子对试剂离子化时：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的（离子对的形成），组分的k k值最大值最大n固定相固定相 、流动相性质、流动相性质影响保留因子的因素影响保留因子的因素反相离子对色谱法反相离子对色谱法第二节液相色谱法分类及其分第二节液相色谱法分类及其分离条件的选择离条件的选择高效液相色谱法高效液相色谱法n涡流扩散涡流扩散A A=2=2ddp p 球形、小粒度、均匀固定相，匀浆高压填充，以降球形、小粒度、均匀固定相，匀浆高压填充，以降低低A An纵向扩散纵向扩散=2=2DDm m 可以忽略可以忽略 D Dl l很小，室温操作，且很小，室温操作，且U U大于大于U U最佳最佳高效液相色谱法中的速率理论高效液相色谱法中的速率理论P387P387传质阻抗传质阻抗n固定相传质阻抗固定相传质阻抗CsCs ：键合相为单层分子，忽略影响：键合相为单层分子，忽略影响n流动相传质阻抗流动相传质阻抗C Cm m：固定相颗粒力度固定相颗粒力度d dp p，组分在流动相中扩散系数，组分在流动相中扩散系数D Dm m静态流动相传质阻抗静态流动相传质阻抗n细颗粒固定相，低粘度溶剂（甲醇或乙腈）细颗粒固定相，低粘度溶剂（甲醇或乙腈）m2PmmDdC高效液相色谱法中的速率理论高效液相色谱法中的速率理论H H = =A A + + C Cm mu u + + C Csmsmu u 实验条件：实验条件：小粒度、均匀的球形化学键合相小粒度、均匀的球形化学键合相低粘度流动相，流速不宜过快低粘度流动相，流速不宜过快柱温适当柱温适当 高效液相色谱法中的速率理论高效液相色谱法中的速率理论第三节高效液相色谱仪第三节高效液相色谱仪组成组成n进样系统进样系统n色谱柱系统色谱柱系统n检测系统检测系统n数据记录处理系统数据记录处理系统 输液系统输液系统进样系统进样系统色谱柱系统色谱柱系统检测系统检测系统数据记录处理系统数据记录处理系统 输液系统输液系统高压输液泵高压输液泵n恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵常用柱塞往复泵 n双泵：克服流量的脉动双泵：克服流量的脉动, ,串联式和并联式串联式和并联式输液泵应具备的性能：输液泵应具备的性能：n流量精度高且稳定流量精度高且稳定n流量范围宽流量范围宽n能在高压下连续工作能在高压下连续工作n液缸容积小液缸容积小n密封性能好，耐腐蚀密封性能好，耐腐蚀 输液系统输液系统输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项：n防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体n流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质n防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完n不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力n流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气输液系统输液系统分离和进样系统分离和进样系统进样器进样器进样阀（六通阀）、自动进样装置进样阀（六通阀）、自动进样装置色谱柱色谱柱（columncolumn）：柱管和固定相组成）：柱管和固定相组成分析柱、制备柱分析柱、制备柱 性能评价：性能评价：H H、n n、f fs s、k k和和的重复性，或的重复性，或R R分离和进样系统分离和进样系统分离和进样系统分离和进样系统检测系统检测系统要求：要求：n灵敏度高，（检测限低）噪音低灵敏度高，（检测限低）噪音低n线性范围宽线性范围宽n重复性好重复性好n适用范围广（通用型、专属型）适用范围广（通用型、专属型） 紫外检测器紫外检测器n检测原理检测原理朗伯比尔朗伯比尔 (Lambert-Beer) (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比光度）与浓度成正比A A= =ClCln特点特点灵敏度较高（灵敏度较高（1010-6-61010-9-9 g/ml g/ml），噪音低，线性范），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）（分析、制备）n局限：局限：仅限于紫外吸收的物质检测，流动相的截止仅限于紫外吸收的物质检测，流动相的截止波长应小于检测波长。波长应小于检测波长。 n专属型、浓度型检测器专属型、浓度型检测器紫外检测器紫外检测器n固定波长检测器固定波长检测器 ：254nm254nmn可变波长检测器：可变波长检测器：光源：光源：氘灯（和钨灯），氘灯（和钨灯）， 200200400400（800800）nmnmn光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 光源：光电二极管，光源：光电二极管，200200900 nm900 nm紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器荧光检测器荧光检测器检测原理：检测原理：n化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为光，称为荧光荧光n荧光强度荧光强度 ( (F F) ) 与激发光强度与激发光强度 ( (I I0 0) ) 及荧光物质浓度及荧光物质浓度 ( (C C) ) 之间的关系为：之间的关系为： F F=2.3=2.3Q QK KI I0 0C Cl l nQ Q为量子产率，为量子产率，K K为荧光效率，为荧光效率，为摩尔吸光系数，为摩尔吸光系数，l l为光径长度。为光径长度。n特点：特点：选择性好，专属型检测器选择性好，专属型检测器灵敏度比紫外检测器高（检测限灵敏度比紫外检测器高（检测限1010-10-10 g/ml g/ml）n激发波长激发波长( ( exex) )和发射波长和发射波长( ( emem) )的选择的选择荧光检测器荧光检测器u通用型检测器通用型检测器u检测没有紫外吸收的有机物质检测没有紫外吸收的有机物质蒸发光散射检测器n1) 可检测挥发性低于流动相的任何样品n2) 流动相低温雾化和蒸发，对热不稳定和挥发性化合物亦有较高灵敏度n3) 广泛的梯度和溶剂兼容性，无溶剂峰干扰n4) 辅助载气提高了检测灵敏度，保持检测池内的n清洁，避免污染n5) 高精度雾化和蒸发温度控制，保证高精度检测；n6) 可与任何HPLC系统连接蒸发光散射检测器优点优点n和高效液相色谱连接时需要信号转换n价格昂贵n使用不便，需要配置高压氮气或空气，且实验中产生废气有害。蒸发光散射检测器缺点缺点第四节第四节 高效液相色谱分析方法高效液相色谱分析方法n定性分析方法定性分析方法n定量分析方法：外标法、内标法定量分析方法：外标法、内标法主要内容主要内容n化学键合相色谱法的原理，分类n化学键合相色谱法的固定相、流动相n化学键合相色谱法的分离条件n液相组成及各种检测器的适用范围n定量分析方法