人多能干细胞向胰腺β细胞和神经细胞定向分化的机制研究

项目名称：人多能干细胞向胰腺细胞和神经细胞定向分化的机制研究首席科学家：起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部一、关键科学问题及研究内容（一） 关键科学问题 目前人多能干细胞定向分化尚未在“功能成熟”和“分化效率”两个难点上取得突破。基于我们已经建立的稳定体外分化体系，我们认为解决这两个问题的一个关键点在于对分化过程中的干/祖细胞的特化、形成阶段和终末功能细胞成熟阶段的分子调控网络开展系统性研究。干/祖细胞具有扩增并能进一步分化为成熟功能细胞的能力，了解干/祖细胞的产生机制，并扩增和富集干/祖细胞，进而提高分化效率，将为下一步研究终末分化细胞的成熟机制打下重要基础。终末功能细胞成熟阶段则直接关系到终末细胞的功能是否完全。因此我们认为需要在这两个阶段寻找促进干/祖细胞特化、产生和扩增以及终末功能细胞成熟的关键因子，并深入分析其分子调控机理。 解决这两个问题的另外一个关键点在于分析人体内胚胎期细胞分化和成熟过程相对模式生物的独特性，为人多能干细胞体外分化提供新的线索。体外定向分化体系的建立主要依据对体内胚胎期细胞分化和功能成熟的调控机制的研究，但是目前人多能干细胞定向分化主要参考小鼠等模式生物的发育机制研究，而根据这些模式生物的发育机制指导人多能干细胞定向分化存在很大的局限性：一方面种属差异造成人细胞分化和功能成熟具有其独特性，另一方面人胚胎发育时程较其他模式生物更长，发育过程中人体细胞分化和功能成熟的机制比其他模式生物更为复杂。因此，要解决目前体外分化中一系列问题，需要深入研究人体内胚胎期细胞分化和功能成熟的过程，以及该过程相比其他模式生物的独特性。综上所述，结合我们团队在人多能干细胞向胰腺细胞和神经细胞定向分化上的工作基础，本项目提出以下关键科学问题：1）体外分化体系中促进胰腺干/祖细胞和神经干/祖细胞特化、产生的关键因子是什么？这些关键因子是如何被调控的？2）体外分化体系中促进胰腺细胞产生和功能成熟的关键因子是什么？这些关键因子是如何被调控的？3）体外分化体系中终末神经元的生理功能是如何获得的？4）人体内胚胎期胰腺细胞及神经细胞的分化和功能成熟过程相对模式生物有何独特性？如何借鉴这种独特性来为人多能干细胞向胰腺细胞及神经细胞定向分化寻找新的线索？ （二） 主要研究内容 围绕上述关键科学问题，本项目的主要研究包括四个方面： 1.人多能干细胞向胰腺细胞定向分化的机制研究基于我们已建立的稳定的人多能干细胞向胰腺细胞定向分化体系，从mRNA、蛋白表达、表观遗传学等多个水平分析目前体外分化体系中胰腺干/祖细胞、胰腺细胞的基因调控网络，以分析目前分化体系的关键缺陷。根据这些线索，进一步寻找促进胰腺干/祖细胞形成的关键因子以及促进胰腺细胞形成和功能成熟的关键因子，进而阐明这些关键因子的分子调控机制。此外，由于胰腺属于内胚层器官，其干祖细胞早期特化过程的关键调控信号通路与其他内胚层器官如肝脏、胸腺等相比必然有其特异性。我们将系统比较在内胚层发育过程中，胰腺干/祖细胞早期命运决定的关键信号通路与其它内胚层组织细胞的异同，从而寻找特异性调控胰腺干/祖细胞前期特化的关键因子和相关信号通路。2.分析人胰腺细胞分化和功能成熟途径的独特性 一方面，通过分析人体内胚胎期从胰腺开始形成到胰腺细胞功能成熟的过程中不同阶段的胚胎胰腺样本，来系统地分析描绘人体内胚胎期胰腺细胞的分化和功能成熟过程，为体外人多能干细胞向胰腺细胞定向分化提供重要参考；在此基础上，我们还将系统分析内胚层其他器官如肝脏等胚胎期的样本，寻找其特化与发育的关键转录因子和信号通路，并比较其与胰腺组织特化的差异，从而分析人胰腺细胞发育过程的独特性。另一方面，在胰腺干/祖细胞形成阶段、胰腺细胞成熟阶段，从基因表达、表观遗传学等多个角度系统分析胰腺发育过程中的关键调控基因的表达模式，并与模式生物胰腺发育过程相应基因的表达模式进行比较分析，以揭示人体内胚胎期胰腺细胞分化和功能成熟过程的独特性。同时分离人体内胚胎期胰腺细胞分化和成熟过程中不同阶段的细胞，利用我们已建立的分化细胞体内功能成熟体系研究人体内胰腺细胞功能成熟过程，并与模式生物细胞功能成熟过程比较，分析其独特性。根据这些独特性，在体外分化体系中进一步寻找促进胰腺细胞分化和功能成熟的关键因子，并研究其调控机制。3.人多能干细胞向神经细胞分化中早期特化分子机理的研究 采用我们近期建立的人多能干细胞向神经细胞早期分化的高效模型，运用转录组测序和甲基化DNA免疫共沉淀测序技术（MeDIP-seq）检测人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的时空显著变化基因和甲基化修饰变化图谱，分析早期神经分化过程中的关键调控网络。同时，采用人类激酶基因组（kinome） shRNA干扰文库在人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中进行功能筛选，寻找调控人早期神经分化过程中的关键激酶。最后，利用来自人体内胚胎期的神经组织和分离的神经干/祖细胞对筛选鉴定的关键基因进行进一步的验证和作用机理研究。4.人多能干细胞向神经细胞分化的功能性研究 基于已经建立的人多能干细胞向运动神经元和多巴胺能神经元分化体系，系统地从电生理特征、离子通道、神经递质等方面研究终末神经元的功能成熟过程，以揭示体外神经分化过程中神经元的功能形成机制。同时分析人体内胚胎期神经发育后期与神经元功能相关的关键基因表达的时空表达变化，结合体外分化神经元的功能形成的分析研究，分析目前体外分化神经元功能形成过程中的可能缺陷，为获得功能成熟的神经元提供新的线索。二、预期目标（一）总体目标 系统性研究人多能干细胞定向分化为胰腺细胞和神经细胞过程中的分子调控机制；揭示人体内胚胎期胰腺细胞和神经细胞分化和功能成熟的规律与独特性，为体外定向分化提供参考；从而最终能够高效获得人多能干细胞来源的功能成熟的胰腺细胞和神经细胞，为人多能干细胞用于糖尿病和神经退行性疾病的临床治疗奠定理论基础。通过本项目的实施，使我国在多能干细胞向胰腺细胞和神经细胞定向分化研究领域达到国际领先水平，培养一批优秀的中青年学术带头人和学术骨干，建立一支干细胞研究领域的高水平研究团队。 （二）五年预期目标 1. 通过对人多能干细胞向胰腺细胞定向分化过程中胰腺干/祖细胞形成阶段以及胰腺细胞形成和功能成熟阶段的系统分析，鉴定促进胰腺干/祖细胞产生以及胰腺细胞产生和功能成熟的关键因子，进而阐明体外分化过程中胰腺前体细胞、内分泌前体细胞形成以及胰腺细胞形成和功能成熟的调控机制。此外，还将通过人多能干细胞的定向分化体系，系统比较分析胰腺干/祖细胞特化过程的关键因子与其他内胚层组织细胞如肝脏、胸腺在转录因子和信号通路调控等方面的异同，从而寻找到胰腺的特异性调控因子。在此基础上建立高效获得人多能干细胞来源的功能成熟的胰腺细胞的体外分化体系，为人多能干细胞在治疗糖尿病上的临床应用奠定理论基础。2. 通过分析人体内胚胎期胰腺细胞分化和功能成熟的过程，进而与体外分化体系、模式生物的胰腺细胞分化和功能成熟过程进行相互比较，揭示人体内胚胎期胰腺细胞的分化和功能成熟过程相对于模式生物的独特性；此外，还将系统比较人体胚胎期内胚层其他器官如肝脏等发育过程中，与胰腺细胞在关键转录因子和信号通路方面的异同，从人体内器官发育角度寻找胰腺细胞特化与发育的特异性调控机制。这些工作将为体外分化体系的进一步优化和完善提供新的重要线索。 3. 通过功能筛选和基因组高通量分析手段筛选鉴定调控人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的关键基因，阐明关键激酶和其它分子在人早期神经分化过程中的功能以及作用的分子机理，为后期高效获得功能性神经元奠定基础。4.通过系统分析人多能干细胞向运动神经元和多巴胺能神经元定向分化过程中神经元功能形成的过程，揭示体外分化过程中神经元的功能形成机制，进而优化体外分化体系以期获得功能成熟的运动神经元和多巴胺能神经元，为未来临床应用奠定基础。 5. 取得具有国际影响力的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平论文30篇左右。培养高水平博士后510人、研究生30-40人；建立一支活跃在干细胞研究领域的创新团队和中青年学术带头人队伍。三、研究方案（一） 学术思路 目前人多能干细胞向胰腺细胞和神经细胞定向分化的基本体系虽已建立，但在现有体系尚未获得功能完全成熟的细胞，并且分化效率较低。形成这两个问题的主要原因在于，对分化过程中促进细胞分化和功能成熟的关键因子和相关机制缺乏深入的研究。因此，我们将围绕关键科学问题，在已建立的稳定分化体系的基础上，开展人多能干细胞向功能成熟的胰腺细胞和神经细胞高效分化的分子调控机制研究。我们将重点研究体外定向分化过程中的干/祖细胞形成阶段和终末功能细胞成熟阶段的分子调控网络，寻找促进细胞分化和功能成熟的关键因子。分化过程中的干/祖细胞形成阶段对于提高分化效率有着重要的影响，而分化后期的功能细胞成熟阶段则直接关系到能否获得功能完全成熟的分化细胞，因此我们将针对这两个阶段开展重点研究，我们的研究思路如下： 1）结合基因打靶建立报告体系技术和表面分子标记分选两种手段，建立标记、分离和纯化分化特定阶段细胞的体系。2）从mRNA、蛋白、表观遗传等多个水平对干/祖细胞和终末细胞进行系统的研究，分析目前体外分化体系的关键缺陷。3）从细胞功能的角度来分析细胞分化和成熟的方向是否正确。体外细胞分化途径是否正确，一个重要指标就是终末的细胞是否功能成熟。我们将结合终末细胞的体外功能评价体系和分化细胞的体内功能成熟体系来判断干/祖细胞和终末细胞的分化方向，同时进行功能性筛选。4）研究细胞间相互作用对细胞功能成熟的影响。体内发育过程中，细胞之间的相互作用对于细胞功能成熟有重要的影响。但目前体外定向分化中大多关注单一细胞类型的分化过程，而缺乏细胞之间如何相互促进分化成熟的研究，因此需要加强这方面的研究。5）目前人多能干细胞定向分化主要参考小鼠等模式生物的发育机制研究，但人与模式生物的种属差异等因素导致仅根据模式生物的发育机制指导人多能干细胞定向分化存在很大的局限性。我们将分析人体内胚胎期胰腺细胞和神经细胞分化和功能成熟过程相对于模式生物的独特性；以及胰腺相对于人体内胚层其他组织细胞如肝脏在发育调控机制上的异同，从而从器官特化角度寻找胰腺发育的独特性；从而为人多能干细胞体外分化提供新的线索, 以建立高效获得功能成熟的人多能干细胞来源的胰腺细胞和神经细胞的体外分化体系。 （二） 主要技术途径根据上述学术思路，本项目在人多能干细胞向胰腺细胞和神经细胞两个谱系的定向分化上开展研究，其中课题一主要在体外分化体系中研究人多能干细胞向胰腺细胞分化的关键因子和调控机制，课题二主要分析人体内胚胎期胰腺细胞分化和功能成熟过程相对于模式生物的独特性，为体外分化提供新的线索，课题三和课题四分别重点研究人多能干细胞向神经分化过程中早期神经特化和晚期神经元功能成熟的分子调控机制。主要技术途径如下：课题一、二 人多能干细胞向胰腺细胞分化的机制研究技术途径如下图所示：1. 在我们现有稳定的人多能干细胞向胰腺细胞分化体系基础上，利用同源重组技术建立含有关键转录因子报告体系的人多能干细胞系，进一步筛选寻找能够特异标记胰腺干/祖细胞和细胞的细胞表面分子标记，分离纯化分化过程中胰腺干/祖细胞和细胞。同时，通过类似手段分离纯化人多能干细胞分化来源的其他内胚层组织细胞如肝脏细胞。2. 分别对纯化的各类细胞进行详细分析鉴定：1）采用转录组测序、蛋白质组学技术和甲基化DNA免疫共沉淀测序技术（MeDIP-seq）对纯化的分化细胞进行mRNA、蛋白质和表观遗传水平的系统分析，分析体外分化过程中细胞谱系分化途径；2）利用我们已建立的小鼠体内功能成熟的技术平台，将纯化的分化细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，利用小鼠体内微环境以促进其成熟，通过分析移植物的细胞类型组成和功能来判断胰腺干/祖细胞阶段和细胞成熟阶段细胞的分化潜能和成熟度；3） 对细胞进行详细的生理功能检测，包括葡萄糖以及其他胰岛素分泌激动剂刺激的C肽释放、电生理、细胞超微结构等。在上述分析的基础上，分析目前体外分化的胰腺干/祖细胞和细胞的缺陷以及与其它内胚层组织细胞在分化调控方面的差异。3. 分析人体内胚胎期胰腺细胞分化和成熟的调控机制，为体外分化提供线索： 1） 建立人胚胎发育不同时期的胰腺组织芯片（tissue microarray）库、肝脏组织芯片库等，进行高通量免疫荧光染色，检测细胞分化和成熟过程中关键转录因子在人胚胎期胰腺组织中的表达模式，确定内分泌细胞特化和细胞成熟的关键阶段，并通过与其它内胚层组织细胞数据的比较，揭示人胚胎期胰岛细胞分化途径的独特性； 2） 从内分泌细胞特化阶段和细胞成熟阶段的人胚胎期胰腺组织中分离胰岛细胞，通过细胞表面分子标记的筛选寻找人胚胎期胰腺内分泌前体细胞和细胞的表面分子标记，进而纯化人胚胎期胰腺内分泌前体细胞和细胞，进行基因表达谱的分析，并与人多能干细胞体外分化相应阶段的细胞进行比较，寻找调控内分泌细胞特化和细胞成熟的关键基因； 3） 采用反向染色质免疫共沉淀技术（Reverse ChIP）研究直接调控关键转录因子的上游基因群，采用染色质免疫沉淀-测序技术（ChIP-Seq）研究关键转录因子下游调控的基因群，采用甲基化DNA免疫共沉淀测序技术（MeDIP-chip(seq)）研究整体基因的甲基化修饰图谱，研究体内发育和体外分化体系中关键基因调控网络的差异。4. 基于上述体外分化体系中的分析结果以及与体内发育相比的差异，结合胰腺内分泌细胞特化和胰腺细胞成熟的关键基因调控网络的研究结果，进行分化体系的优化：1） 基于tet-on体系，通过基因过表达和RNA干扰两种手段，在体外分化特定阶段调控胰腺内分泌细胞特化和胰腺细胞成熟的关键基因的表达，模拟人体胚胎期胰腺细胞在该阶段的相应关键基因调控网络的变化，进而分析诱导人多能干细胞向功能成熟的胰腺细胞分化的关键基因；2） 以关键调控基因和信号通路为靶点，以细胞功能和分化效率为评判标准，开展化学小分子、人类激酶基因组shRNA干扰文库等多种筛选，寻找促进胰腺细胞分化和成熟的关键因子。5. 研究细胞及其他细胞类型与细胞的相互作用对于胰腺细胞功能成熟的作用：1）通过流式细胞分选获得人成体胰腺组织中的细胞，分别与内分泌前体阶段以及终末分化阶段纯化的细胞进行共培养，通过终末细胞的功能评价分析细胞对细胞分化和成熟的促进作用；2）将内皮细胞分别与内分泌前体阶段以及终末分化阶段纯化的细胞进行共培养，通过终末细胞的功能评价分析内皮细胞对细胞分化和成熟的促进作用；3）在体外分化末期筛选不同的细胞外基质成分，寻找促进细胞成熟的细胞外基质；4）综合上述结果，将细胞或内皮细胞与适当的细胞外基质成分和分化末期的细胞一起进行三维培养，以促进细胞的成熟，分化获得功能成熟的胰岛。课题三、四 人多能干细胞向神经细胞分化的分子机制研究技术途径如下图所示：1. 人多能干细胞向神经细胞定向分化早期关键调控网络的研究1） 基于我们近期建立的人多能干细胞向神经细胞早期高效分化的模型，采用转录组测序技术比较早期分化过程中各时间点基因表达变化，研究人早期神经分化的关键调控网络，对关键基因进行功能分析和深入的分子机理研究。 2） 采用甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-seq）技术检测人多能干细胞向神经干/祖细胞分化过程中DNA甲基化修饰图谱的变化，揭示DNA甲基化修饰调控基因表达谱发生转变的方式与机制，分析人多能干细胞分化成神经干/祖细胞的关键基因调控网络。 3） 利用人类激酶基因组（kinome）shRNA干扰文库在人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中开展功能筛选，寻找调控人多能干细胞向神经细胞早期分化的关键激酶，并深入研究其作用的分子机理。 4） 在人体内胚胎期神经细胞分化的早期阶段，通过定量PCR、免疫荧光检测等手段对以上鉴定的关键基因调控网络和关键激酶的表达进行分析验证，比较人体内神经细胞分化早期和人多能干细胞向神经定向分化早期的关键基因调控网络和关键激酶的异同。 5） 以筛选的关键激酶和其它关键基因作为靶点，开展细胞因子、化学小分子等多种筛选，寻找人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的关键诱导因子。2. 人多能干细胞向神经细胞分化的功能性研究1） 采用免疫荧光和免疫组化等方法对分化体系中神经细胞的类型、分化效率、分化成熟度和纯度等进行初步分析。2） 分析分化过程中神经细胞的电生理特性变化：在电流钳的模式下，记录人多能干细胞定向分化为神经干细胞以及功能性神经元过程中动作电位等生理功能的变化情况。在电压钳的模式下，记录人类多能干细胞定向分化为神经干细胞以及功能性神经细胞过程中K+、Na+、Ca2+等离子通道的变化。3） 分析分化过程中的神经元神经递质功能特性变化：记录与运动神经元和多巴胺能神经元相关的Glycine、GABA、Nicotine、Substance P等几种配位门控离子通道的变化。4） 基于终末神经元的功能成熟机制的研究，结合我们建立的组织芯片库，进行高通量免疫组化染色，分析人体内神经发育后期神经元的离子通道、神经递质等相关重要功能基因的时空表达变化。5） 基于已有分化体系，结合对神经元功能形成过程的机制研究，分析目前体外分化体系中神经元功能的缺陷以及引起这些缺陷的相关基因，并开展化学小分子筛选，完善和优化分化人多能干细胞向神经细胞定向分化的体系。（三） 创新点与特色1. 目前人多能干细胞定向分化主要参考小鼠等模式生物的发育机制研究结果，存在很大的局限性。在我们多年积累建立的符合国际伦理规范的人胚胎期胰腺组织细胞库的基础上，采用人体胚胎发育不同时期的胰岛组织中分离的细胞为研究材料，首次系统深入地分析描绘人体内胚胎期胰腺细胞分化和成熟的途径和规律。创新性地从进化角度分析人体内胰腺细胞谱系发育途径相对于小鼠等模式生物的独特性，首次将人胚胎期细胞分化和成熟规律与人多能干细胞体外分化的研究相结合，为研究体外定向分化研究开拓新的思路。2体内发育过程中，细胞之间的相互作用对于细胞功能成熟有重要的影响。但目前体外定向分化中大多关注单一细胞类型的分化过程，而缺乏细胞之间如何相互促进分化成熟的研究。我们首次系统地研究体外分化过程中细胞及其它类型细胞与细胞之间的相互作用促进细胞功能成熟的机理，有可能在促进细胞功能成熟方面取得重要突破。3. 我们将基因打靶建立报告体系技术和细胞表面分子标记分选两种手段相结合建立分化特定阶段的细胞分离纯化体系，在此基础上结合高通量组学分析技术，为深入研究人多能干细胞向胰腺细胞定向分化机制提供了新的策略和方法。4我们将胰腺细胞的体内功能成熟评价体系和体外功能评价体系结合起来，全面准确地评价人多能干细胞来源的胰腺细胞功能。并将基因调控网络的研究和细胞功能性分析相结合，系统性地研究人多能干细胞向胰腺细胞定向分化的分子机制。5. 高效率的体外分化模型是分化机理研究的基础。我们已建立的高效早期神经分化模型，使我们可以深入研究人多能干细胞向神经细胞定向分化过程中的调控机理。另外我们采用人类激酶基因组（kinome） shRNA干扰文库对人多能干细胞向神经干细胞早期分化过程进行功能筛选，阐明关键激酶在神经早期分化过程中的作用机制，并利用化学小分子调控激酶活性从而调控体外神经分化过程。6. 我们将首次全面系统分析神经元分化过程中动作电位、离子通道、神经递质等的动态变化，深入地了解体外分化过程中神经元的功能形成机制，为进一步优化体外分化过程中后期神经元的功能成熟提供新的研究思路。（四） 取得重大突破的可行性分析1. 在人多能干细胞向胰腺细胞定向分化方面，北京大学邓宏魁研究组具有深厚的工作基础，是国际上最早开展多能干细胞向胰腺细胞定向分化研究的研究组之一。在国际上首次采用模拟胰腺体内发育过程的分步诱导策略诱导小鼠胚胎干细胞向胰腺细胞的定向分化（Shi et al., Stem Cells, 2005），随后建立了人胚胎干细胞和人iPS细胞向胰腺细胞体外定向分化的体系（Jiang et al., Cell Res, 2007; Zhang et al., Cell Res, 2009），并在国际上首次证明人胚胎干细胞来源的胰腺细胞能够逆转糖尿病小鼠模型的高血糖。在此基础上，该研究组近年来开展了对分化体系中胰腺干/祖细胞的研究：首先分析了胰腺早期分化阶段胰腺命运特化的分子机制，并且通过对分化体系的优化，可以高效稳定地获得均质的PDX1阳性的胰腺干/祖细胞（Cai et al., J Mol Cell Biol, 2010）；另外还首次发现分化过程中胰腺干/祖细胞特异的细胞表面分子标记CD24 （Jiang et al., Stem Cells, 2011）。该课题组已建立起人多能干细胞向胰腺细胞定向分化的稳定分化体系，在胰腺干/祖细胞的分离纯化方面具有很好的工作基础和技术平台，同时建立起了小动物移植的体内功能评价体系和完善的体外功能评价体系，并且在分化机制方面已经开展了前期的研究。这些工作为本项目中深入研究人多能干细胞向胰腺细胞分化过程中的机制提供了必备的前提和坚实的基础。2. 在研究人体内胰腺细胞分化和功能成熟方面，中日友好临床医学研究所娄晋宁研究组利用了国内临床资源的优势，通过多年的积累建立了符合国际伦理规范要求的人胚胎胰岛组织细胞库，同时还建立了人胚胎期胰岛细胞分离的技36 术体系。该研究组在动物模型研究方面拥有成熟的技术平台和深厚的工作积累，应用人胚胎胰岛干细胞分化得到的胰岛细胞进行小鼠、大鼠及恒河猴糖尿病动物模型的治疗，均取得了良好的效果。这些工作的开展为本项目中基于人体胚胎期胰腺组织开展的研究以及分化细胞的体内功能评价奠定了基础。3. 在研究人多能干细胞向神经细胞早期分化的分子机理方面，中国医学科学院实验血液学国家重点实验室周家喜研究员长期从事人多能干细胞早期分化相关的研究，最近在优化神经定向分化体系方面取得了创新性的成果。采用化学小分子文库筛选，他们鉴定了TGF-家族受体的抑制剂Compound C能够有效诱导高效的早期神经外胚层分化（Zhou et al., Stem Cells, 2010）。在单层培养的条件下，不需要添加任何生长因子，仅使用Compound C便可获得超过90%PAX6阳性细胞，是目前为止在单层培养条件下获得人类神经干/祖细胞的最有效、最简便的方法。这一分化体系为深入开展人多能干细胞向神经细胞早期分化的机理研究提供了基础。4. 在研究体外分化体系中神经元的功能形成机制方面，中国科学院广州生物医药与健康研究院李志远研究员从事神经元功能研究十余年，特别是在神经元离子通道的研究方面具有坚实的工作基础。最近该研究团队在人多能干细胞向神经细胞定向分化的功能研究方面开展了创新性的工作，在建立人多能干细胞向运动神经元定向分化体系的基础上，系统分析了分化过程中神经细胞的离子通道变化过程（这一工作已经投稿到Cell Stem Cell杂志）。基于对神经元生理功能的长期研究和最近开展的神经定向分化功能研究的前期工作，该研究团队将在本项目中更加深入系统地分析体外分化过程中神经元的功能成熟过程。5. 团队内各研究组之间开展广泛深入的合作，能够保障本项目的顺利开展。邓宏魁研究组和娄晋宁研究组在人多能干细胞向胰腺细胞定向分化的研究方面有着长期的合作关系，共同建立了稳定的人多能干细胞向胰腺细胞定向分化体系，以及完善的细胞功能评估体系和胰腺干/祖细胞鉴定纯化方法。娄晋宁研究组通过多年积累建立的人胚胎胰腺组织细胞库为人胚胎期胰腺细胞分化和功能成熟过程的分析提供了必要的条件。在筛选鉴定分化过程中的关键因子方面，周家喜研究组和邓宏魁研究组建立了化学小分子、激酶基因组（kinome）shRNA干扰文库筛选等技术平台，可同时应用于人多能干细胞向胰腺细胞和神经细胞的定向分化方向研究。李志远研究组建立的细胞电生理功能分析体系也将用于分析胰腺细胞的生理功能。这些合作为项目的有效开展奠定了坚实基础，使得各课题间的研究优势互补和相互促进。6. 本项目具有高水平的学术带头人。项目推荐首席科学家邓宏魁教授是北京大学生命科学学院长江特聘教授，国际干细胞学会（ISSCR）理事会理事。十年来从事人多能干细胞及其定向分化方面的研究，取得了具有国际影响力的研究成果，最近几年在多能干细胞及其定向分化研究方向上的发表论文被引用1000余次。过去五年曾主持“十一五”863计划重大项目“干细胞向胰岛素分泌细胞的定向诱导分化及其治疗糖尿病的临床前研究”，具有很强的科研组织协调能力。其它课题负责人是在国际上具有影响力的海外回国学者，在相关研究领域中均已取得创新性的科研成果。学术骨干队伍中既有科研经验丰富的学科带头人，也有许多精力充沛崭露头角的优秀青年科研人员。结构合理、充满活力的研究队伍将使该项目能够高效地开展。7. 在实验平台方面，本项目包含国家重点实验室、卫生部一级研究所、教育部重点实验室和中科院重点实验室。实验室设备先进，技术力量雄厚，实验需要的细胞高速分选、全基因组测序、全基因组转录组和表达谱研究、反向染色质免疫共沉淀、染色质免疫沉淀-测序、化学小分子筛选、激酶筛选、电生理测定等技术平台处于国内外领先水平，为项目的开展提供技术方法上的保障。（五）课题设置根据上述总体研究方案，我们将设置以下四个课题：1. 人多能干细胞向胰腺细胞定向分化的机制研究； 2. 分析人胰腺细胞分化和功能成熟途径的独特性； 3. 人多能干细胞向神经细胞早期分化的分子机理研究；4. 人多能干细胞向神经细胞分化的功能性研究。1. 课题间相互关系本项目一个突出的创新性在于研究人体内胚胎期细胞分化和成熟途径的独特性并为人多能干细胞体外定向分化提供新的重要线索。经过多年的研究积累我们认识到这方面的研究对人多能干细胞定向分化上的突破有非常重要的价值，而国际上尚未开展这方面的研究。要深入研究人体内胚胎期细胞分化和成熟的途径，需要建立分离纯化人胚胎期分化各阶段细胞的技术体系。我们团队中的娄晋宁课题组在胰岛细胞的分离技术上有坚实的工作基础，已建立了成熟的胰岛细胞分离技术体系，经多年积累建立了合乎国际伦理标准的人胚胎期胰腺组织细胞库；同时团队中的邓宏魁课题组已建立了筛选胰腺干/祖细胞和细胞的特异细胞表面分子标记的技术平台以及利用这些细胞表面分子标记分离纯化胰腺干/祖细胞和细胞的方法，这些前期工作为本项目中分析人胚胎期胰腺细胞的分化和成熟过程奠定了基础。因此在研究人胚胎期细胞分化和成熟途径的独特性方面，我们将集中力量在胰腺细胞方面开展重点研究，在研究经费上给予侧重支持。在人胚胎期神经细胞的分化和成熟途径的研究方面，由于分离胚胎期不同阶段的特定类型的神经细胞目前还是尚未突破的难点。因此我们将利用人体胚胎期神经组织样本，以原位分析神经细胞分化和成熟相关基因的表达模式为主，对体外分化体系中的结果进行进一步验证。在课题组织上，四个课题各有侧重，互为依托。其中，课题一研究人多能干细胞向胰腺细胞定向分化的机制，进一步研究促进胰腺干/祖细胞形成、胰腺细胞形成和功能成熟的关键调控因子和相关机制；课题二分析人体内胚胎期胰腺细胞分化和功能成熟过程相对于模式生物的独特性，为课题一中人多能干细胞向胰腺细胞定向分化提供新的线索，同时为课题三和课题四中原位分析神经细胞分化和成熟相关基因表达模式的研究提供人体胚胎期神经组织样本库；课题三和课题四分别从神经分化早期命运调控机制和后期功能成熟机制两个方面研究人多能干细胞向神经细胞定向分化的调控机制。由于神经细胞和胰腺细胞存在发育早期分化机制保守的特点，课题一和课题二开展的胰腺谱系分化机制分析中的早期分化阶段的研究结果将与课题三开展的神经谱系早期分化的机制研究结果相互比较借鉴。同时，由于神经细胞和胰腺细胞都具有可兴奋细胞的特性，课题四中研究神经元细胞电生理特性的技术体系将应用于课题一和课题二中胰腺细胞的体外生理功能分析，这一技术体系对全面准确地评价分化的胰腺细胞的生理功能具有重要的意义。2. 课题设置概况课题一 人多能干细胞向胰腺细胞定向分化的机制研究研究目标：通过对人多能干细胞向胰腺细胞定向分化过程中胰腺干/祖细胞形成阶段以及胰腺细胞形成和功能成熟阶段的系统分析，鉴定促进胰腺干/祖细胞产生以及胰腺细胞产生和功能成熟的关键因子，进而阐明体外分化过程中胰腺前体细胞、内分泌前体细胞形成以及胰腺细胞形成和功能成熟的调控机制。此外，还将通过人多能干细胞的定向分化体系，系统比较分析胰腺干/祖细胞特化过程的关键因子与其他内胚层组织细胞如肝脏、胸腺在转录因子和信号通路调控等方面的异同，从而寻找到胰腺的特异性调控因子。在此基础上建立高效获得人多能干细胞来源的功能成熟的胰腺细胞的体外分化体系，为人多能干细胞在治疗糖尿病上的临床应用奠定理论基础。主要研究内容：基于我们已建立的稳定的人多能干细胞向胰腺细胞定向分化体系，从mRNA、蛋白表达、表观遗传学等多个水平分析目前体外分化体系中胰腺干/祖细胞、胰腺细胞的基因调控网络，以分析目前分化体系的关键缺陷。根据这些线索，进一步寻找促进胰腺干/祖细胞形成的关键因子以及促进胰腺细胞形成和功能成熟的关键因子，进而阐明这些关键因子的分子调控机制。此外，由于胰腺属于内胚层器官，其干祖细胞早期特化过程的关键调控信号通路与其他内胚层器官如肝脏、胸腺等相比必然有其特异性。我们将在人多能干细胞体外分化平台基础上，系统比较在内胚层发育过程中，胰腺干/祖细胞早期命运决定的关键信号通路与其它内胚层组织细胞的异同，从而寻找特异性调控胰腺干/祖细胞前期特化的关键因子和相关信号通路。经费比例：30%承担单位：北京大学课题负责人：邓宏魁学术骨干：高崇明，刘艳霞，赵东昕，隋鑫，李容课题二 分析人胰腺细胞分化和功能成熟途径的独特性研究目标：1. 通过分析人体内胚胎期胰腺细胞分化和功能成熟的过程，进而与体外分化体系、模式生物的胰腺细胞分化和功能成熟过程进行比较，揭示人体胚胎胰岛细胞的分化和功能成熟过程的独特性，为体外分化体系的进一步优化和完善提供新的线索。2. 系统比较人体胚胎期内胚层其他器官如肝脏等发育过程中，与胰腺细胞在关键转录因子和信号通路方面的异同，从人体内器官发育角度寻找胰腺细胞特化与发育的特异性调控机制。为体外分化体系的进一步优化和完善提供新的重要线索。主要研究内容：1. 系统分析人体胚胎期胰腺内分泌细胞特化和胰腺细胞功能成熟的关键基因及其上下游调控网络人体胰腺在胚胎期8-12周只有极少的内分泌细胞出现；14-16周有胰岛样的结构出现；19周之后类似于成体的胰岛结构基本形成。但对于胰岛细胞在哪个具体时期获得成熟的功能尚不清楚。我们将收集胚胎发育各阶段的胰腺组织，并重点对上述三个阶段进行系统基因表达谱和功能的分析，确定内分泌细胞特化和细胞成熟的关键阶段，进而在这两个关键阶段上分析关键基因及其上下游调控网络。2. 建立全面准确的人胰腺细胞的功能评判标准，以细胞功能鉴定为指标，确定人体内胰腺细胞功能成熟的关键阶段，进一步分析该阶段细胞的转录因子表达特点。3. 研究细胞及其他细胞类型与细胞的相互作用对于胰腺细胞功能成熟的作用。经费比例：28%承担单位：中日友好临床医学研究所课题负责人：娄晋宁学术骨干：周建军，林华，张黎，温见燕课题三. 人多能干细胞向神经干/祖细胞早期分化分子机理的研究研究目标：通过功能筛选和基因组高通量分析手段筛选鉴定调控人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的关键基因，阐明关键激酶和其它分子在人早期神经分化过程中的功能以及作用的分子机理，为后期高效获得功能性神经元奠定基础。主要研究内容：1. 人多能干细胞早期神经分化过程中显著变化基因的鉴定和功能研究基于我们近期建立的人多能干细胞向神经细胞早期高效分化的模型（Zhouet al, Stem Cells, 2010），分别在0h、24h、48 h、72h以及96h收集总RNA，进行人全基因组芯片杂交，分析分化过程中的基因表达谱变化。选取随分化过程持续显著上升或下降的基因（特别是转录因子），利用tet-on体系、shRNA干扰和基因过表达等多种方法进行功能分析，并进一步采用染色质免疫沉淀-测序技术（ChIP-Seq）研究关键基因及其上下游调控网络。2. 人多能干细胞早期神经分化过程中甲基化修饰变化研究采用甲基化芯片或者全基因组甲基化测序技术对人胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞过程中多个时间点基因组DNA甲基化修饰图谱进行时间序列的检测，然后结合已经完成的该过程的时间序列的基因表达谱分析进行DNA甲基化修饰在人胚胎干细胞神经分化过程中动态调控机制的研究，发现该分化过程中关键的DNA甲基化修饰位点或区域以及各阶段关键调控环路和DNA甲基化修饰在这些环路中的作用，揭示DNA甲基化修饰调控基因表达谱发生转变的方式与机制，进一步分析人胚胎干细胞分化成神经前体细胞的关键调控网络。3. 人类多能干细胞早期神经分化过程中关键激酶的鉴定和功能研究由于激酶调控目的基因的表达变化过程中很多情况下自身并不直接发生表达水平的显著变化，所以仅分析基因表达谱很难直接鉴定关键激酶。利用已拥有的激酶基因组（kinome） shRNA干扰文库（约含有3500 个shRNAs，覆盖人类目前鉴定的所有700个激酶）大量包装慢病毒，直接感染H1人胚胎干细胞，然后进行神经分化诱导，直接筛选影响人类多能干细胞早期神经分化的关键激酶，并利用磷酸化蛋白组学和蛋白质谱技术寻找关键激酶的底物，进行深入的分子机理研究。4. 体内和体外早期神经分化机理比较研究在人体胚胎期神经细胞分化过程中，通过定量PCR、免疫荧光检测等手段分析筛选鉴定的关键转录因子和激酶等关键基因的表达模式，比较人体内神经细胞分化早期和人多能干细胞向神经细胞定向分化早期的关键基因调控网络的异同。利用关键激酶和其它关键基因作为靶点，开展细胞因子、化学小分子等多种筛选，寻找人多能干细胞向神经细胞分化过程中的早期关键诱导因子。经费比例：18%承担单位：中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）课题负责人：周家喜学术骨干：许元富，苏培，彭亮 课题四. 人多能干细胞向神经细胞分化的功能性研究研究目标：通过系统分析人多能干细胞向运动神经元和多巴胺能神经元定向分化过程中神经元的功能形成过程，揭示体外分化过程中神经元的功能形成机制，进而优化体外分化体系以期获得功能成熟的运动神经元和多巴胺能神经元，为未来临床应用奠定基础。主要研究内容：1. 系统分析人多能干细胞向神经元定向分化过程中的功能成熟过程（1）基于已经建立的人多能干细胞向运动神经元和多巴胺能神经元分化体系，综合多种分析鉴定方法对分化细胞进行分析。采用甲苯胺兰特异性染色检测神经元的特殊结构尼式小体是否存在。运用免疫荧光染色，鉴定神经干细胞标记物Nestin，星形胶质细胞标记物GFAP，少突胶质细胞标记物Olig2，神经特异性蛋白tubulin、NF200、MAP2、NSE、ChAT和DAT等的表达情况。通过这些研究对分化体系中神经元的类型、分化效率、分化成熟度和纯度等进行初步分析。（2）基于已经建立的人多能干细胞向运动神经元和多巴胺能神经元分化体系，结合常规鉴定结果，进行进一步的功能性分析：在电流钳的模式下，记录人类多能干细胞定向分化为神经干细胞以及功能性神经元过程中动作电位等生理功能的变化情况；在电压钳的模式下，记录人类多能干细胞定向分化为神经干细胞以及功能性神经元过程中K+、Na+、Ca2+等离子通道特征的变化；记录与运动神经元和多巴胺能神经元相关的Glycine，GABA，Nicotine等几种配位门控离子通道特征的变化及神经递质基因的表达情况，系统比较研究终末神经元的功能成熟过程，以揭示体外神经分化过程中神经元的功能形成机制。2. 结合体外分化中神经元功能成熟机制研究，分析人体内胚胎期神经元功能成熟过程基于终末神经元功能成熟机制的研究，结合课题组二建立的人胚胎期神经元组织芯片库，分析人体内神经发育后期神经元的离子通道、神经递质等相关重要功能基因的时空表达变化。3. 优化人多能干细胞向功能性神经元定向分化体系基于已经建立的人多能干细胞向运动神经元和多巴胺能神经元分化体系，以及在对神经元功能形成过程的机制研究，分析目前体外分化体系中神经元的功能缺陷以及引起这些缺陷的关键基因，针对这些基因的调控开展化学小分子筛选，完善和优化人多能干细胞向神经元定向分化的体系。经费比例：24%承担单位： 中国科学院广州生物医药与健康研究院课题负责人：李志远学术骨干：龙雁，程娜，揭艳玲，徐慧娟四、年度计划研究内容预期目标第一年1） 通过人多能干细胞体外定向分化体系，筛选寻找能够特异标记胰腺干/祖细胞和细胞的细胞表面分子标记，分离纯化分化过程中的胰腺干/祖细胞和细胞。2） 通过人多能干细胞体外定向分化体系，分离纯化人多能干细胞分化来源的其他内胚层组织的细胞。3） 建立人体内胚胎期不同阶段各个内胚层组织如胰腺等的组织芯片库。4） 基于已建立的人多能干细胞向神经细胞早期高效分化的模型，采用免疫荧光和免疫组化等方法对分化体系中神经细胞的类型、分化效率、分化成熟度和纯度等进行初步分析；此外，采用转录组测序技术比较早期分化过程中各时间点基因表达变化，研究人早期神经分化的关键调控网络。1） 筛选出1-2个能够特异标记胰腺干/祖细胞和细胞的细胞表面分子标记。2） 建立分离纯化人多能干细胞来源的胰腺干/祖细胞、细胞以及其他内胚层组织细胞的方法。3） 建立人体内胚胎期不同阶段各个内胚层组织的组织芯片库。4） 通过免疫荧光和免疫组化等方法，获得分化体系中神经细胞的类型、分化效率、分化成熟度和纯度等初步分析数据。5） 采用转录组测序技术比较早期分化过程中各时间点基因表达变化，寻找人早期神经分化的关键调控网络。第二年1） 优化细胞纯化方法，采用转录组测序、蛋白质组学技术和MeDIP-seq技术对纯化的分化细胞进行mRNA、蛋白质和表观遗传水平的系统分析，分析体外分化过程中细胞谱系分化途径；分析目前体外分化的胰腺干/祖细胞和细胞的缺陷以及与其它内胚层组织细胞在分化调控方面的差异。2）检测细胞分化和成熟过程中关键转录因子在人胚胎期胰腺组织中的表达模式，确定内分泌细胞特化和细胞成熟的关键阶段，并通过与其它内胚层组织细胞数据的比较，揭示人胚胎期胰岛细胞分化途径的独特性。3）采用MeDIP-seq技术检测人多能干细胞向神经干/祖细胞分化过程中DNA甲基化修饰图谱的变化，揭示DNA甲基化修饰调控基因表达谱发生转变的方式与机制，分析人多能干细胞分化成神经干/祖细胞的关键基因调控网络。4）分析分化过程中神经细胞的电生理特性变化。1） 通过转录组测序、蛋白质组学技术和MeDIP-seq技术分析体外分化过程中细胞谱系分化途径；寻找目前体外分化的胰腺干/祖细胞和细胞的缺陷以及与其它内胚层组织细胞分化调控的分子差异。2） 分析细胞分化和成熟过程中关键转录因子在人胚胎期胰腺组织中的表达模式，通过与其它内胚层组织细胞数据的比较，寻找到人胚胎期胰岛细胞分化途径的特异性调控机制。3）通过MeDIP-seq技术，绘制人多能干细胞分化成神经干/祖细胞的关键基因调控网络。4）分析分化过程中神经细胞的电生理特性变化；为优化定向分化方案提供数据支持。第三年1） 将纯化的分化细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，利用小鼠体内微环境以促进其成熟，通过分析移植物的细胞类型组成和功能来判断胰腺干/祖细胞阶段和细胞成熟阶段细胞的分化潜能和成熟度。2） 采用Reverse ChIP技术研究直接调控关键转录因子的上游基因群，采用ChIP-Seq技术研究关键转录因子下游调控的基因群，采用MeDIP-chip(seq)技术研究整体基因的甲基化修饰图谱，寻找体内发育和体外分化体系中关键基因调控网络的差异。 3） 利用人类激酶基因组（kinome）shRNA干扰文库在人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中开展功能筛选，寻找调控人多能干细胞向神经细胞早期分化的关键激酶，并深入研究其作用的分子机理。1） 建立人多能干细胞分化来源的内胚层组织如胰腺细胞体内成熟和功能评价的技术方案。2） 通过Reverse ChIP、ChIP-Seq、MeDIP-chip(seq)等多种方法，分析体内组织发育与体外定向分化的基因调控网络；并寻找其差异性。3）利用人类激酶基因组（kinome）shRNA干扰文库筛选技术，寻找调控人多能干细胞向神经细胞早期分化的关键激酶，并对其分子机理作深入分析。第四年1）结合胰腺内分泌细胞特化和胰腺细胞成熟的关键基因调控网络的研究结果，进行分化体系的优化；以关键调控基因和信号通路为靶点，以细胞功能和分化效率为评判标准，开展化学小分子、人类激酶基因组shRNA干扰文库等多种筛选，寻找促进胰腺细胞分化和成熟的关键因子。2） 在人体内胚胎期神经细胞分化的早期阶段，通过定量PCR、免疫荧光检测等手段对已鉴定的关键基因调控网络和关键激酶的表达进行分析验证，比较人体内神经细胞分化早期和人多能干细胞向神经定向分化早期的关键基因调控网络和关键激酶的异同。3） 基于终末神经元的功能成熟机制的研究，结合已建立的组织芯片库，进行高通量免疫组化染色，分析人体内神经发育后期神经元的离子通道、神经递质等相关重要功能基因的时空表达变化。1） 在前三年研究基础上，深入优化人多能干细胞向胰腺细胞定向分化技术方法。2）进一步筛选化学小分子以及人类激酶基因组shRNA干扰文库，寻找促进胰腺细胞分化和成熟的关键因子。3）在人体内胚胎期神经细胞分化的早期阶段，通过定量PCR、免疫荧光检测等手段验证关键基因调控网络和关键激酶的表达，比较并获得人体内神经细胞分化早期和人多能干细胞向神经定向分化早期的关键基因调控网络和关键激酶的信息。4） 结合组织芯片库，通过高通量免疫组化染色，获得人体内神经发育后期神经元的离子通道、神经递质等相关重要功能基因的时空表达变化信息。第五年1）研究细胞及其他细胞类型与细胞的相互作用对于胰腺细胞功能成熟的影响：a）通过流式细胞分选获得人成体胰腺组织中的细胞，分别与内分泌前体阶段以及终末分化阶段纯化的细胞进行共培养，通过终末细胞的功能评价分析细胞对细胞分化和成熟的促进作用；b）将内皮细胞分别与内分泌前体阶段以及终末分化阶段纯化的细胞进行共培养，通过终末细胞的功能评价分析内皮细胞对细胞分化和成熟的促进作用；c）在体外分化末期筛选不同的细胞外基质成分，寻找促进细胞成熟的细胞外基质；d）综合上述结果，将细胞或内皮细胞与适当的细胞外基质成分和分化末期的细胞一起进行三维培养，以促进细胞的成熟，分化获得功能成熟的胰岛。2）以筛选的关键激酶和其它关键基因作为靶点，开展细胞因子、化学小分子等多种筛选，寻找人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的关键诱导因子。3）基于已有分化体系，结合对神经元功能形成过程的机制研究，分析目前体外分化体系中神经元功能的缺陷以及引起这些缺陷的相关基因，并完善和优化分化人多能干细胞向神经细胞定向分化的体系。1） 通过FACS分析、共培养、胞外基质筛选、三维培养等多种方法，探索细胞及其他细胞类型与细胞的相互作用对于胰腺细胞功能成熟的影响。2）开展细胞因子、化学小分子等多种筛选，寻找到人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的关键诱导因子。3）通过对神经元功能形成过程的机制研究，分析目前体外分化体系中神经元功能的缺陷以及引起这些缺陷的分子机理，从而完善和优化分化人多能干细胞向神经细胞定向分化的体系。