玉米赤霉烯酮ELISA快速检测试剂盒操作说明书(一)

精品资料博恒 ?玉米赤霉烯酮ELISA 快速检测试剂盒操作说明书1 、 简介本试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附ELISA 原理快速定量检测谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮（ ZearaLenone,ZEN ） 。谷物 / 饲料的前处理包括：提取、过滤、稀释，处理时间大约为 20-40 分钟。本试剂盒的检测限为：10 ppb ;谷物/饲料中ZEN的回收率 80%;批内、批间变异 系数 15% 。2 、 试剂盒组成A. 24/48/96 孔 ZEN 酶标板：3/6/12条X8 孔B. 20 X浓缩洗涤液：25mL （用蒸储水稀释20倍使用）1瓶C. ZEN 抗体 : 3/6/12mL1 瓶 （红盖 ）D. 酶标二抗： 3/6/12 mL1 瓶 （绿盖 ）E. 显色液： 3/6/12 mL1 瓶 （蓝盖）F. 终止液 :3/6 mL1 瓶（黄盖 ）G. ZEN 标准品 :1.5/2mL/ 瓶（ 0、 30 、 60 、 200 、 500ppb ） 各 1 瓶H. 操作说明书 1 份注意 ：标准品含有低浓度 ZEN 、终止液含 2 N H 2SO 4 ，需小心取用；勿在有效期外使用本 试剂盒。3 、 贮存条件与有效期2- 8 避光贮存，忌 0 以下冻存，有效期见试剂盒内盖。4 、 样品处理程序实验准备：配制 60% 甲醇水溶液（ v/v ， 60:40 ）和 20% 甲醇水溶液（ v/v ， 20:80 ） 。注意：请精确配制上述溶液，以免影响检测的准确性 。称取 5 g 具有代表性的粉碎样品于100 mL 带塞三角瓶内， 准确加入 25 mL 60% 甲醇水溶液。将加入了甲醇水溶液的样品放入振荡器内（或用手强力振荡） ，充分振荡3 分钟后，用whatman 1 号滤纸过滤，收集滤液。取滤液 2mL ，加入 6 mL 20% 甲醇水溶液，混匀，用 whatman 1 号滤纸过滤，此为样品待检液。、，、.一、一注意? 某些样品待检液（如花生等）久置影响检测结果的准确性，为保证检测的准确性，样品 提取后请即时检测。? 若样品待检液不立即检测，请将其存储于棕色玻璃瓶内，2-8 C避光保存。? 试剂盒在使用前，请将试剂盒内所有试剂放到室温（20- 25 C）进行温度平衡。试齐IJ用完后立即将其放置回 2- 8 C冰箱内保存。? 在每个步骤操作时， 速度要快，不要使板孔暴露在空气中时间过久，避免酶标板变干。未用完的酶标板需密闭于自封带内，防止受潮且避光保存于2-8 C冰箱内。? 在温育时，避免光照，建议将酶标板置于湿盒内（在有盖容器内放置一块平整湿纱布）进行温育。? 若样品数量超过20份，请用多通道加样器操作。5、定量检测程序5.1 实验准备：从冰箱取出试剂盒，恢复至室温后，打开自封袋，取出所需数量的板条插入微孔架，记录空白、ZEN标准品号及样品的位置（可参照下表所示）。其余板条封口后放入冰箱。将 20 X浓缩洗涤液用超纯水或蒸储水稀释20倍，待用。123- 12A空白样品B标准品样品C标准品样品D标准品样品E标准品样品F标准品样品G样品样品H样品样品5.2 加样：空白孔加入100 L洗涤液（不加ZEN抗体）。ZEN标准品孔和样品孔相应地加 入标准品（ ）和样品待检涌0山/孔（如上表所示加入），再加入ZEN抗体 （50 L /孔），此时各孔中溶液体积为100山。将酶标板在水平桌面上轻微振荡（注意避免液体溅出），使之混匀，放入湿盒内（在有盖容器内放置一块平整湿纱布），37 c温育30分钟。注意：此操作步骤要快，尽量保持前后孔温育时间一致，每次加样须更换新的 吸头。5.3 洗板：甩出孔中的液体，用洗瓶或移液器将洗涤液加入各孔中（满孔），再次甩出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤三次 （共洗四次）。5.4 加酶标二抗：将洗好的酶标板平放，加入酶标二抗100 山/孔，置于湿盒内， 37 c温育30分钟。5.5 洗板：参照5.35.6 显色：将洗好的酶标板平放，加入显色液100 L /孔，37 c显色5分钟（若显色较浅， 可适当延长，但不宜超过 10分钟）。5.7 终止及测定：将显色完毕的酶标板取出，加入终止液50 瓜/孔，轻微震荡混匀，以空白孔调零，在450 nm 处测量吸光值 A （在加入终止液5分钟内读取吸光值）。5.8 结果判定：以ZEN标准品浓度 30ppb、60ppb、200ppb、500ppb 的常用对数值（1gC） 为横坐标，各浓度标准品相应的吸光值A与0ppb的标准品A值的比值（B/B 0%）为纵坐标B/B 0%=标准品（或样品）的吸光值 /0ppb 标准品的吸光值X100%,绘制标准曲线。根据样品孔的吸光值计算样品的B/B 0%值，查标准曲线，可得到相应样品中ZEN的含量（已考虑样品提取的稀释倍数，结果无需换算）。（或可直接用 RADEWIN 等专用ELISA分析软件对数据进行分析得出结果）。如果检测结果高于检测上限，请将待测样品提取液用30%甲醇水（v/v , 30:70 ）稀释后再检测，测定结果乘以相应的稀释倍数。6、限量（定性）检测程序样品处理程序见四，适用于同时定性检测多个限量标准不同的样品，以 ZEN标准品 号（60ppb）作参照进行定性比较，不需作标准曲线。待测样品提取液根据限量标准的不同， 用30%的甲醇水溶液按下表稀释：限量标准& 60ppb& 500ppb待检样品提取液1mL0.3mL30%的甲醇水02.2mL稀释倍数150/66.1 实验准备：从冰箱取出试剂盒，恢复至室温后，打开自封袋，取出所需数量的板条插入 微孔架，记录空白、ZEN标准品号（60ppb）及样品的位置，其余板条封口后放入冰箱。6.2 反应：空白孔加入100 匹 洗涤液（不加ZEN抗体）。ZEN标准品孔和样品孔相应地加 入标准品号（60ppb）和稀释后的待检样品提取液各505/孔，再加入ZEN抗体（50人/孔），将酶标板在水平桌面上轻微振荡（注意避免液体溅出），使之混匀，置湿盒内，37 c温育30分钟。注意：此操作步骤要快，尽量保持前后孔温育时间一致，每次加样 须更换新的吸头。6.3 洗板：参照5.36.4 加酶标二抗：参照5.46.5 洗板：参照5.56.6 显色：参照5.66.7 终止及测定：参照5.7 （目测法不加终止液 ）6.8 结果判定：目测法（未加终止液前目测）：比较样品孔与标准品参照孔的颜色，若样品 孔显色比标准品参照浅，则为阳性，样品中 ZEN的含量超出限量标准；若深者，则为 阴性；若颜色接近，则需用酶标仪测吸光值比较。仪器法：酶标仪检测在450nm 波长处各孔的吸光值 A,若样品的 A值 标准参照的 A值，为阳性，表示样品中ZEN的含量超出限量标准；若样品A值标准参照 A值，为阴性。7、自备仪器及试剂酶标仪（内置 450nm 滤光片）或黄曲霉毒素B1 专用测定仪20-200山微量移液器及配套吸头恒温培养箱（0-50）、冰箱、感量0.01g 的天平、小型粉碎机或碾钵玻璃器皿：三角瓶、烧杯、分液漏斗、蒸发皿、量筒、具塞试管、滴管、移液管等其他：甲醇、 whatman 1 号滤纸、吸水纸等8 、 国家标准GB/T 19540-2004 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 薄板层析法和ELISA 分析法GB 2715 2005粮食卫生标准小麦和玉米中玉米赤霉烯酮限量指标为60科g/kgGB 13078.2-2006饲料卫生标准饲料和玉米中玉米赤霉烯酮的允许量500科g/kg地址：南昌市高新区火炬大道201 号江西留学生创业园 邮编： 330029电话： 0791-8130250传真： 0791-8130250可编辑修改