实验二植物总RNA的提取

实验二、植物总实验二、植物总RNARNA的提取的提取一、实验目的一、实验目的： 1.了解真核生物基因组RNA提取的一般原理。2.掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。3.了解RNA纯度的检测。 二、一般原理二、一般原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分其它成分,使蛋白质与核酸分离使蛋白质与核酸分离,失活失活RNA酶酶,同时能保持同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，离心分离后，RNA处于水相中，将水相转处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀管后用异丙醇沉淀RNA。 TrizolTrizol试剂配制试剂配制 苯酚饱和液（苯酚饱和液（38%38%）-380-380ml/L ml/L 硫氰酸胍盐（硫氰酸胍盐（0.80.8M-118.16gM-118.16g） 硫氰酸铵（硫氰酸铵（0.40.4M M）- 76.12g - 76.12g 醋酸钠醋酸钠pH 5pH 5（0.1M0.1M）- 33.4ml - 33.4ml 甘油甘油 50 50ml ml 加水至加水至1 1L L 。 三、材料三、材料 植物组织植物组织四、设备四、设备 移液器，冷冻高速离心机，低移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，陶瓷研钵，1.5ml离心管。离心管。 五、试剂五、试剂 1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3、氯仿:异戊醇 24 : 1 （v/v) 、氯仿。4、异丙醇、无水乙醇、70乙醇。 5、Trizol试剂。六、操作步骤六、操作步骤1、取植物嫩叶，液氮研磨，每取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube分装分装0.1克样品；克样品；.每管每管加入加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的体积的10%。 、室温下静置、室温下静置5分钟分钟以利于核酸蛋白质复以利于核酸蛋白质复合体的解离合体的解离 、加入、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管摇荡离心管15秒，室温静置秒，室温静置3分钟分钟 、 10000r/min离心离心5分钟分钟、取上清液（水相）转入一新的离心管，加、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置入等体积异丙醇，室温放置3分钟，分钟，10000r/min离心离心5分钟。分钟。 、弃去上清液，加入至少、弃去上清液，加入至少1ml的的70%乙醇，涡乙醇，涡旋混匀，旋混匀，4下下10000r/min离心离心5分钟。分钟。、小心弃去上清液，然后室温或真空干、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降分钟，注意不要干燥过分，否则会降低低RNA的溶解度。然后将的溶解度。然后将RNA溶于溶于20微升微升TE或或DEPC处理过的水中，必要时可处理过的水中，必要时可55-60水溶水溶 10分钟。分钟。RNA可进行可进行mRNA分离，或贮存于分离，或贮存于70%乙乙醇并保存于醇并保存于-70七、检测七、检测1、DNA的紫外分光光度计检测的紫外分光光度计检测OD260/OD2801.81OD260=40 g/mL DNA2 2、甲醛变性琼脂糖电泳检测、甲醛变性琼脂糖电泳检测八、注意事项八、注意事项（1）Trizol、DEPC等有毒，与皮肤接触会引起伤害。操作过程带手套，在通风条件下操作。（2）避免带入RNase进入样品带手套，别用手碰任何与样品接触的物品。使用新的已灭活RNase的塑料器皿与用具。 （3）爱护仪器设备,安全操作作业：作业：1、RNA酶的变性或失活剂有那些？其中酶的变性或失活剂有那些？其中在总在总RNA的抽提中主要可用哪几种？的抽提中主要可用哪几种？2、怎样从总、怎样从总RNA中进行中进行mRNA的分离和的分离和纯化。纯化。补充：检测方法.此外分光光度计检测值时，相当于含g/mL DNA.时，DNA较纯小于.时，蛋白含量较高，大于.则含有或有断裂.琼脂糖电泳检测