毕业论文林肯链霉菌产林可霉素发酵培养基的优化32643

安徽学院毕业设计（论文）表格清单表1-1主要仪器-4表1-2主要试剂-4表2-1 种子代谢状况-10表2-2 正交试验的因素水平表-11表2-3 正交试验L9(34)结果处理-12表2-4磷酸二氢钾对产生林可霉素的影响结果-13表3-5 前体酪氨酸对产生林可霉素的影响测量结果-14图表清单图1林可霉素结构式-3图1-1葡萄糖标准曲线-7图1-2平板效价图-8图2-1 菌种在不同时期的菌体状态-10图2-2 不同时间正交试验结果线形图-13图2-3磷酸二氢钾对产生林可霉素的影响结果柱形图-14图2-4前体酪氨酸对产生林可霉素的影响测量结果柱形图-16引 言林肯链霉菌是放线菌属中链霉菌的一种，基丝无横隔，直径大约为0.5-0.8 m。可产生一种林可胺类碱性物质-林可霉素。林可霉素一种林可胺类抗生素，对多数革兰氏阳性菌有较强抑菌活性，特别是对链球菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌及厌氧菌的抗菌作用尤为明显。在人体内分布广泛，对于呼吸系统、骨髓炎及软组织感染等疾病有很好的治疗作用，尤其适用于对青霉素过敏的病人1。因此林可霉素具有很重要的药用价值，同时在工业上也具有很重要的经济价值。林可霉素含A、B两组分，其主要成分为A组分，分子式为C18H34N2O6S，相对分子量为406.56，其结构见图1。两组分在结构上的区别为：A组分在4位上为正丙基，而B组分为乙基，B组分无抑菌作用。在当今科技发达的时代，生物产品已经成为时代的主流。林可霉素作为临床应用的主要抗生素也是人们研究的热点。目前国外对林可霉素的研究主要集中在基因调控、代谢及作用机理方面的研究2-4。国内大部分研究的是其工业应用方面，如菌种的诱变筛选等5-7。但是一个好的菌株出现，不仅仅是诱变筛选的结果，只有选择最佳的生长环境和代谢合成产物的最佳环境才能最大限度的发挥出菌株的潜在能力，实现研究的最高价值。正因为培养基在生产中的重要地位，培养基的优化也成为目前研究的重点，如童婷8、周晓荣9所做的关于培养基成份的优化等方面的研究。碳源是发酵过程中合成菌体及抗生素的能量和碳素来源；氮源是用来构成菌体的蛋白质、核酸等含氮物质以及抗生素等含氮代谢产物的；磷是核酸和蛋白质的必要组成成分，也是重要的能量传递者-ATP的主要成分；酪氨酸是林可霉素合成的前提物质，培养基成分中酪氨酸的含量对产量有一定的影响。鉴于碳氮源、磷酸盐和前体物质的重要性。本实验选择了以淀粉、葡萄糖（碳源），玉米浆、豆饼粉（氮源），磷酸二氢钾（磷酸盐）和前体酪氨酸等因素为研究对象，以确定林可霉素发酵的最佳培养基配比。第一章 材料与方法1.1试验菌林肯链霉菌SL-98、藤黄八叠球菌（由安徽工程科技学院生物技术实验室提供）。1.2 实验主要仪器表1-1主要仪器仪器名称产家恒温恒湿振荡培养箱SPH-2102CSPX-250BS-生化培养箱电子天平FC104双圈牌恒温水浴锅HH-2立式电热压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBSPHSJ-3F实验室pH计 雷磁牌离心机显微镜XSP-2CA滴定装置培养皿牛律杯200ul移液枪 X57404E游标卡尺LINKS BRAND马头牌JYT-5架盘药物天平隔水式电热恒温培养箱电热恒温鼓风干燥箱SW-CJ-2FD双人单面净化工作台上海世平实验设备有限公司上海新苗医疗器械制造有限公司上海精科国华电器有限公司上海申安医疗器械厂上海精密科学仪器有限公司中外合资深圳天南海北有限公司上海天律市东丽教学仪器厂上海五一玻璃仪器厂上海市药品研究所法国制造哈尔滨量具刀具厂上海医用激光仪器厂上海新苗医疗器械制造有限公司上海新苗医疗器械制造有限公司苏州净化设备有限公司此外还需要的仪器有烧杯、电炉、三角烧瓶、接种铲、陶瓦盖等。1.3 试验药品表1-2主要试剂试验药品产家硫酸铵磷酸二氢钾淀粉葡萄糖ARL-酪氨酸酚酞C20H14O4蛋白胨BR蔗糖上海试剂一厂综合经营公司经销国药集团化学试剂有限公司菱湖精细化工厂国药集团化学试剂有限公司中国惠兴生化试剂有限公司天律市化学试剂一厂国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司其他药品还有豆粉、碳酸钙、玉米浆、氯化钠、硝酸钠、KNO3 、FeSO47H2O、MgSO4、琼脂（宝石牌）等。1.4 培养基配方 1.4.1斜面培养基的配制 可溶性淀粉2.0%（单独糊化）、豆饼粉0.5%、琼脂1.7-2.1%，NaCl0.05%、KNO3 0.01%、K2HPO4 0.05%、FeSO47H2O 0.001%(现配现用)、MgSO4 0.05%(最后加入)、蒸馏水配制，pH消前自然，消后6.5-6.7。培养基长度1/2、C总1.7-2.1g/100mL，C还0.6g/100mL，NH2-N 10-16mg/100mL。1.4.2种子培养基的配制淀粉2.0%、葡萄糖1.5%、豆饼粉2.0%、硫酸铵0.15%、玉米浆3.0%、碳酸钙0.4%，消前pH7.0-7.2，消后pH7.2,种子培养基装量10%。1.4.3发酵培养基的配制淀粉2.0%、葡萄糖9.0%、豆饼粉2.0%、玉米浆0.3%、氯化钠0.4%、硝酸钠0.8%、硫酸铵0.7%、碳酸钙0.8%、磷酸二氢钾0.025%，消前pH7.0-7.4，消后pH6.8-7.2（调节后再加入碳酸钙),摇瓶培养基装量10%。1.4.4肉汤琼脂培养基（测量效价培养基）的配制蛋白胨6g/L、酵母膏6g/L、牛肉膏1.5g/L、葡萄糖1g/L、琼脂15g/L， pH7.8-8.0。以上培养基均在121下灭菌20min。1.5试验方法1.5.1 斜面培养方法将生长良好、孢子丰满，没有受到杂菌污染的单菌落用接种针将其挑入斜面，均匀的涂满斜面，把斜面放入恒温培养箱在温度29.5-29.8C、湿度35%条件下培养6.5-7d。斜面指标：密的背后黄色，稀的背后褐色至棕褐色。1.5.2 种子培养方法种子培养基按1.4.2配制后，装量：25mL/250mL，50mL/500mL。接入林肯链霉菌，接种量15-25个菌落/瓶，培养条件：温度30C，湿度45%，转速180r/min，培养54h。当还原糖含量为0.5-0.6g/100mL 、氨基氮为60-80mg/mL、菌浓为22-28%、pH为7.17.4时菌种可以从种子培养基中接种到发酵培养基中。1.5.3 发酵培养方法 按1.4.3配制好发酵培养基后，装量：25mL/250mL，50mL/500mL。待种子生长到一定阶段（达到接种指标后），接入发酵培养基中（接种量6%）培养。培养条件：温度30、湿度45%、转速220r/min，培养9d。1.6 分析测定方法1.6.1氨基氮的测定101.6.1.1 原理 利用甲醛法测定，测定结果是氨基氮和氨盐氮含量的总和。一分子氨盐与甲醛作用，生成六次甲基四胺及一分子无机酸，后者以碱滴定，从而标定出氨氮含量，氨基氮氨基酸的氨基与甲醛结合，使氨基酸碱性消失，再用标准液来滴定羧基，标出氨基氮。4NH4+6HCHO-= (CH2)6NH+6H2O+3H+NaOH + H+=Na+H2O1.6.1.2 试剂与器材1NHCl取在盛有917mL的蒸馏水的试剂瓶中，缓缓加入83mL浓盐酸，待冷却后定溶摇匀。0.05NNaOH称取0.2g加入100mL容量瓶中，定容，摇匀，后标定为0.03761mol/L。中性甲醛溶液在50mL 36%-37%(质量分数) 甲醛溶液中加入1mL 0.5%酚酞乙醇水溶液，用0.05NNaOH滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中，此试剂在使用前配制。酚酞批示剂（0.05%酚酞乙醇水溶液）称取0.5g 酚酞置于100mL小烧杯中，加入100mL无水乙醇充分搅拌使溶解，将溶液转至100mL试剂瓶中待用，pH变色范围为8.0-10.0(无色变红)。0.1%的甲基红批示剂的配制取甲基红0.1g加入0.05mL/LNaOH溶液7.4mL使之溶解，再加水稀释至200mL得到的变色范围pH为4.2-6.3(红变黄)。1.6.1.3 操作步骤 吸取待测液(发酵液上清液)2.5mL于250mL三角烧杯中，加水约50mL，加甲基红批示剂2-3滴，加1NHCl 1-2滴，使成红色，放置3min，然后再以0.05N NaOH调至橙黄色，加入中性甲醛10mL，放置5-10min，加酚酞指示剂1mL，用0.05N NaOH滴定至粉红色为终点。 计算公式：氨基氮含量（N，mg/100mL）=M*V1*m*100/V2=0.03761* V1*14*100/2.5=21.056V1 （式1-1） 1.6.2还原糖的测定111.6.2.1原理在发酵过程分析淀粉和葡萄糖，通过酸水解作用，淀粉可以转化为葡萄糖，单糖分子中的醛基具有还原性，在碱性溶液中能将二价铜离子还原为亚铜离子，剩余的铜在酸性溶液中与碘化钾反应，析出游离碘用标准硫代硫酸钠溶液滴定，从空白与样品所消耗的NaS2O3标准溶液得体积的差值，推算糖的含量(以葡萄糖计)，测定中用到的Cu2+，KI，事先配制碱性溶液，称为斐林试剂.斐林试剂为一碱性Cu2+试剂，内含Cu2+、KI，NaOH及酒石酸钾钠，酒石酸钾钠的作用是与Cu2+生成络合物，避免Cu2+在碱性溶液中生成Cu(OH)2沉淀。1.6.2.2试剂与器材标准葡萄糖溶液准确称取0.6000g（0.0005）分析纯葡萄糖于100mL容量瓶中，加水溶解，定容，摇匀。斐林试剂A液：称取120g无水硫酸铜，用蒸馏水溶解并稀释至2000mL。B液：称取250g NaOH和375g酒石酸钾钠，用蒸馏水溶解并稀释至2000mL（NaOH溶解时要缓慢加入）。C液：称取300g碘化钾，用蒸馏水溶解并稀释至1000mL。将A液和B液混合摇匀后，加入C液充分振荡即可。斐林试剂的标定精确量取10mL的新配斐林试剂至250mL锥形瓶中，加入6.0mol/L HCL溶液6mL，轻轻振荡均匀后，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至黄色消失。记录消耗的标准硫代硫酸钠溶液的体积。1.6.2.3操作步骤1.6.2.3.1.糖标准曲线的制备 精确量取糖标准溶液0.3mL、0.6mL、0.9mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.1mL、2.4mL、2.7mL、3.0mL加入150mL的三角瓶中，精确加入10mL的斐林混合液，100C沸水浴10分钟后，取出冷却至室温，用酸式滴定管加入6.0mL的6.0mol/L的HCL，边加边轻轻震荡，使盐酸与三角瓶内溶液充分接触，用硫代硫酸钠标准溶液滴定溶液将现乳白色时，加入1-2mL 0.5%淀粉指示剂，继续滴定至蓝色刚好消失，同时以10mL斐林试剂作空白，以葡萄糖量（g/100mL）为纵坐标，空白滴定数减去样品滴定数为横坐标，绘出标准曲线图。y = 0.2481xR2 = 0.996600.511.52012345678还原糖含量（g/100mL）Na2S2O4图1-1葡萄糖标准曲线1.6.2.3.2还原糖的测量将发酵液离心分离，取出上清液1mL(如含糖量较高则取0.5mL)于150mL三角烧瓶中，加蒸馏水10mL，摇匀后准确加入斐林试剂20mL，再煮沸3min(准确计时)，冷却后加入6mol/L HCL10mL，立即以0.1015mol/L Na2S2O3标准溶液(已经标定)滴定至淡黄色，加淀粉指示剂1mL，继续滴定到黄色褪去即为终点，读取毫升数。1.6.2.3.3 空白的测定 以蒸馏水10mL,准确加入斐林试剂20mL,加6NHCl 10mL,作空白实验，同样以Na2S2O3标准溶液滴定，得空白Na2S2O3毫升数，查标准曲线求得糖含量。还原糖样品测定计算：以（V空白-V样品）的值查葡萄糖标准曲线图得葡萄糖量或利用线性方程计算出葡萄量，即可得到样品的还原糖会含量（g/100mL）。1.6.3抗生素效价测定技术121.6.3.1原理抗生素生物效价的测定方法有物理方法、化学方法及微生物方法。现在大多数采用微生物方法，因其用量少，灵敏度高。微生物方法有比浊法、琼脂扩散法等，其中琼脂扩散法中的管碟法最为常用。管碟法的原理是利用抗生素在培养基内扩散渗透作用，比较标准品和待检品两者对试验菌产生的抑菌圈的大小，以决定待检抗生素的效价。常用二剂量法计算效价。二剂量法是利用抗生素浓度的对数值与抑菌圈成直线关系的原理，将抗生素的标准品和待检品各稀释为一定的比例的两种剂量，即高剂量和低剂量（2：1或4：1），在同一平板上进行比较，根据它们产生的抑菌圈直径的大小，按照公式计算出待检品的效价。二剂量法是相对效价的计算方法，因此在效价计算中，即使不知道待检品浓度稀释液和低浓度稀释液的具体浓度值，也不会影响效价的计算结果。1.6.3.2材料藤黄八叠球菌、营养琼脂培养基、林可霉素标准品、林可霉素待检品、牛津杯（不锈钢管要求规格一致）、培养皿、无菌吸管、镊子、陶瓦盖、游标卡尺、容量瓶、蒸馏水等。营养琼脂培养基：蛋白胨6g/L、酵母膏6g/L、牛肉膏1.5g/L、葡萄糖1g/L、琼脂15g/L，pH7.88.0。1.6.3.3实验步骤试验菌株的培养在营养琼脂斜面培养基上接藤黄八叠球菌，37C培养1824h，用无菌生理盐水洗下，储存于冰箱中待用。pH6.0磷酸缓冲液的配制准确称取KH2PO48g和K2HPO42g，置1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。林可霉素标准品溶液的配制精确称量林可霉素标准品6.0000g（0.0005），用pH6.0的磷酸盐缓冲溶液溶解成一定浓度的原液，再将此原液逐步释成6U/mL和3U/mL（2：1）两种溶液。待检样品溶液的配制待检样品溶液按标准溶液的配方进行配制，最终得到的高、低浓度与标准品的两种浓度相近。混菌平板的配制制备底层培养基平板，用大口吸管吸取20mL已加热熔化的营养琼脂培养基，注入无菌培养皿内，均匀铺满皿底，待凝固后作为底层培养基。制备含菌薄层平板，先用2mL无菌吸管吸取1.5mL制备好的藤黄八叠球菌菌悬液加至50C保温的100mL营养琼脂培养基中，轻轻摇匀，再用无菌大口吸管吸取6mL加至已冷凝底层培养基，立即摇匀。效价测定（1）加牛津杯：待含菌薄层平板完全凝固后，在培养皿底部划分成四区，并做标记，中心部位贴一标签纸，在纸的四角相应位置注明加入药物的名称。用无菌镊子夹取牛 津杯的果部，将其分别轻放在四个区的中央，用镊子轻轻 图1-2效价测量按牛津杯使其与培养基表面紧密接触，但不能穿破培养基。（2）加药液：用移液枪分别吸取标准品和待检品各两种浓度的药液2mL，分别注满相应的牛津杯内，四个牛津杯内加的药量要一致。换陶土盖：从无菌操作下取下培养皿盖，立即换上已灭菌的陶土盖，平放37C恒温箱内培养18-24h，观察结果。测量抑菌圈直径：用游标卡尺精确测量每种药液的抑菌圈直径。效价计算：直接代入计算公式：lg=V/WlgK=(UH+UL)-(SH+SL)/(SH+UH)-(SL+UL)lg(H/L) （式1-2）Pu=Ps （式1-3）K=H/L （式1-3）式中SH为标准品的高剂量稀释液（6.0u/mL）的抑菌圈直径；SL为标准品的低剂量稀释液（3.0u/mL）的抑菌圈直径；UH为待检品的高剂量稀释液的抑菌圈直径；UL为待检品的低剂量稀释液的抑菌圈直径；为相对效价（待检品效价与标准效价之比）；PS为标准品效价；PU为待检品效价；K为高剂量（H）与低剂量（L）之比。1.6.4菌浓的测定 将培养好的培养液准确量取10mL，2000转离心10min，量取上清液。菌浓10上清液（mL）/10100% 第二章 结果与讨论2.1种子培养林可霉素的种子培养基用来扩大发酵种子量的，种子质量的好坏和种子量都直接关系发酵产物效价的高低。过于年轻的种子移入发酵培养基中，会出现前期生长缓慢，使整个发酵周期延长；过老的种子则会使菌体过早自溶，生产能力下降，因此选择适当的接种龄十分重要。通常，接种龄以菌丝处于生命力极为旺盛的对数期较为合适。本实验对种子的代谢情况进行了考察，其结果见下表：表21 种子代谢状况时间 pH 菌浓 还原糖 氨基氮 （h） (%） （mg/100mL） （ mg/100mL）0 7.14 5 2.88 110.0024 6.92 6 1.72 96.0036 6.86 14 1.03 88.4348 6.78 18 0.89 76.2252 7.18 22 0.64 65.4854 7.23 28 0.48 53.48 24h 36h 48h 54h图21 菌种在不同时期的菌体状态由表2-1中可以看出当种子培养到54h时，已达到1.5.2中种子移种指标，即还原糖0.5-0.6g/100mL 、氨基氮60-80mg/mL、菌浓22-28%、pH7.17.4。从图2-1中看出，在24h时，菌丝体仅呈分支状，在36h菌丝体明显增多，到48h后已经可以看出大量菌丝团的存在，在54h时更可以看出菌团里的营养物质已经被大量的消耗。此时各项指标均已达标，可以移种。在培养的过程中pH会随着培养时间有所上升但中间有一个下降的过程，这可能是菌体在生长过程中对葡萄糖的利用而使pH有所下降。随着菌体的生长，消耗有机酸、酸性物质等酸性物质造成的，也可能是菌体产生了一些碱性物质，使pH上升。到接种与发酵培养时其pH一般可达到7.5左右。2.2发酵培养基的优化2.2.1碳氮源的影响在林肯链霉菌培养基的优化中碳源、氮源以及无机盐离子是很重要的控制因素13，14，他们提供了微生物生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料。C、N源是微生物生长必不可少的两大营养元素。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。在特殊情况下(如碳源贫乏时)，蛋白质水解物或氨基酸等也可作为碳源使用。葡萄糖作为微生物的主要碳源，在培养基中的含量也会对发酵有一定的影响，微生物在生长过程中，葡萄糖属于速效碳源，微生物首先会利用葡萄糖，当葡萄糖的浓度很高时菌体会表现出“葡萄糖效应”，所谓的“葡萄糖效应”是指在微生物培养过程中当周围环境中的葡萄糖浓度过高时会抑制微生物利用其他的碳源，直到葡萄糖耗尽或低于一定浓度为止。这时微生物会表现出“二次生长现象”15。氮源也是微生物生长的主要必须物质之一，微生物在生长期菌体大量繁殖，菌体的繁殖需要染色体的复制，而染色体的复制则需要大量的N元素。次级代谢产物的合成与培养基中的氮源种类、含量和代谢途径等也有很大关系。所以在培养基的优化过程中，氮源的选择以及浓度的大小对结果都有很大的影响。发酵初期较高的有机氮源豆饼粉有利于林可霉素的生长和生产能力的提高。硫酸铵是属于速效氮源的一种，资料表明较高的硫酸铵浓度有利于菌体生长和生产能力的提高，可能是硫酸铵作为了合成林可霉素的一分子了9，但过高的氨含量会产生氨阻遏作用。为了研究林可链霉菌SL-98最佳的培养基配方对其主要的几种营养物质进行了考察。在保持氯化钠0.4%、硝酸钠0.8%、碳酸钙0.8%、磷酸二氢钾0.025%不变的情况下设计了L9(34)16正交试验表考察淀粉、葡萄糖、豆粉、硫酸铵及玉米浆对发酵单位的影响。其因素水平表见表22，正交实验表及数据分析见表23：表22 正交试验因素水平表A(淀粉+葡萄糖) B(豆饼粉) C (玉米浆) D (硫酸铵)1 1+10% 2.5% 0.5% 0.9%2 2+9% 2.0% 0.3% 0.7%3 4+7% 1.5% 0.1% 0.5%表2-3 正交试验L9(34)结果处理试验号ABCD效价U/mL相对效价123456789对照组1112223332123123123212323131221233122312197822702504220423752065212919191719220089.9%103.2%113.8%100.2%108.0%93.9%96.8%87.2%78.1%100%K1K2K3675266445767631165646288596261937008607264646627k1k2k3225122151922210421882096198720642336202421552209R32992349185最佳配比A1B2C3D32536115.3%试验结果表明最佳组合是A1B2C3D3，即淀粉+葡萄糖浓度为1+10%、豆饼粉2.0%、玉米浆0.1%、硫酸铵0.5%。四个因素对试验的影响大小分别为玉米浆淀粉+葡萄糖硫酸铵豆饼粉。玉米浆对试验的影响是主要的，其次是葡萄糖和淀粉。原因可能是因为玉米浆是一种容易被微生物利用的良好氮源，它富含丰富的氨基酸、还原糖、磷、微量元素和生长素，且其中含有的磷酸肌醇对促进林可霉素的合成有积极作用。由表2-3可以看出当培养基为最佳配比A1B2C3D3时其林可霉素产生量与对照组相比提高了15.3%。加入的葡萄糖含量为10%，说明10%葡萄糖浓度为菌体的生长提供了丰富的碳源和能源，而没有产生“葡萄糖效应”。在发酵过程中的分别在第120h、164h、215h左右取上述9组的发酵液，考察了产物合成量，以进一步分析其培养基的影响。050010001500200025003000120h164h215h1号2号3号4号5号6号7号8号9号效价(U/mL)时间(h)图2-2 不同时间正交试验测量结果线形图从2-2图中可以看出2号瓶中加入的量分别为淀粉+葡萄糖（1+10%）、豆饼粉2.0%、玉米浆0.3%、硫酸铵0.7%。120h时 2号瓶所测林可霉素效价几乎是最低的，这可能是葡萄糖含量较高的原因，这可以从1号和3号中得到验证。从120h到164h 2号瓶效价能力增加的速度并不快，但从164h到215h 2号效价能力增加的速度却超过了其他各组，原因可能是2号培养基适合菌体的生长，前期时菌体大量繁殖，使后期产生效价的速度加快。从前3组中还可以看出随着豆饼粉、玉米浆和硫酸铵含量的减少最终效价是逐渐提高的。7号瓶中加入的量分别为淀粉+葡萄糖（4+7%），豆饼粉2.5%，玉米浆0.1%，硫酸铵0.7%。在120h测量的抗生素效价是九组当中是最高的，与8、9号以及前3组比较可以看出很可能是因为葡萄糖的原因。7号瓶中葡萄糖加入量为7%是最少的，葡萄糖的量能促进林肯链霉菌的生长，但同时也表明葡萄糖很可能对林可霉素的合成有一定的抑制作用。而到215h抗生素效价能力反而比164h还要低，可能是培养基中的营养物质消耗过快，进入衰亡期的时间提前，产生的抗生素可能作为一种碳氮源而被利用了。2.2.2 磷酸盐的影响磷是核酸和蛋白质的必要组成成分，也是重要的能量传递者-三磷酸腺苷的成分，在代谢途径的调节方面，磷起着重要的作用。抗生素生物合成中磷酸盐调节最重要的有三种机制：磷酸盐对初级代谢的刺激，菌体内ATP迅速增加，并使糖分解从单磷酸己糖途径转变成糖酵解途径，菌体趋向于生长；磷酸盐限制抗生素合成途径中前体物质的生成，从而限制抗生素产物的启动合成17；磷酸盐可抑制抗生素的磷酸化前体的代谢有关的磷酸酯酶的作用等。本实验设计了不同的磷酸二氢钾浓度（其他发酵培养基中物质的量参照1.4.3和正交试验结果），对发酵效价进行了考察。表2-4 磷酸二氢钾对产生林可霉素的影响结果磷酸二氢钾含量00.005%0.015%0.025%0.035%0.045%效价(U/mL)15562134237325202212165305001000150020002500300000.0050.0150.0250.0350.045磷酸二氢钾量（%）林可霉素含量（U/mL）图2-3 磷酸二氢钾对产生林可霉素的影响结果柱形图从图2-3可以看出随着磷酸二氢钾浓度的增加其产生的林可霉素效价也在提高，试验表明当磷酸盐的浓度达到0.025%时其产生的林可霉素效价是最高的。比0号瓶（没有加磷酸盐）的效价高了62%。在小于0.025%或等于这个浓度时磷酸盐对林肯链霉菌的生长起到促进作用，说明产生林可霉素时磷酸盐的存在不会影响到林可霉素的合成。而当浓度大于0.025%时磷酸盐对林可霉素的合成使有很强的抑制作用，这可能是当菌体到合成抗生素时磷酸盐仍然存在，直到磷酸盐消耗完才开始合成林可霉素，这就推迟了林可霉素合成的时间。有实验表明林可霉素的产生几乎都是在磷酸盐消耗完以后才开始的18。2.2.3酪氨酸的影响林可霉素属于糖类抗生素，由一氨基酸组分（脯氨酸的结构类似物，酪氨酸的衍生物：丙基脯氨酸）和一糖组分（甲硫林可糖胺）构成19。氨基酸部分是由莽草酸先合成酪氨酸，最后转化为丙基脯氨酸，所以酪氨酸是产物合成的前体物质之一，对林可霉素的产生有促进作用。本实验设计了不同的酪氨酸浓度（发酵培养基中物质的量参照1.4.3和正交试验优化结果），初步考察了酪氨酸浓度对林可霉素的产生和影响。表3-5 前体酪氨酸对产生林可霉素的影响测量结果酪氨酸含量00.05%0.1%0.15%0.2%效价(U/mL)25002057280528722532050010001500200025003000350000.050.10.150.2林可霉素含量（U/mL）酪氨酸含量（%）图2-4 前体酪氨酸对产生林可霉素影响的柱形图图2-4表明总体来说前体酪氨酸的加入对产生林可霉素效价的大小是有促进作用的,酪氨酸是林可霉素前体的一种，他的加入相当于添加了一种诱导剂，他可能解开了阻碍次级反应的抑制物，使林肯链霉菌过早进行林可霉素的合成。所以有酪氨酸的发酵培养基比没有酪氨酸的发酵培养基所产生的效价要高，当加入的酪氨酸浓度达到0.15%时比没加的效价提高了大约14.9%。一般向林肯链霉菌的发酵培养基中加入前体物质的话都会使产生林可霉素增加的。但试验表明能对次级代谢途径产生促进作用的一般都会对初级代谢途径产生抑制作用20。所以当酪氨酸浓度过高时产生林可霉素的能力便会下降。结论与展望结论：通过试验可以看出在正交试验四个因素当中，对林可霉素的产生影响是不同的，其中玉米浆影响最大，各因素的主次顺序为CADB，即玉米浆葡萄糖硫酸氨豆饼粉。根据正交试验数据最佳配比关系是A1B2C3D3，即淀粉+葡萄糖浓度为1+10%、豆饼粉2.0%、玉米浆0.1%、硫酸铵0.5%时，产生的效价能力是最高的，与对照组相比提高了15.3%。1 碳氮源对产生林可霉素的影响碳源是发酵过程中合成菌体及抗生素的能量和碳素来源。本试验中加入的碳源是葡萄糖和淀粉。葡萄糖是速效碳源，在微生物生长繁殖时最易被利用，但浓度过高时会产生葡萄糖效应，对抗生素的生物合成具有抑制作用。试验结果表明当葡萄糖浓度达到10%时仍对微生物有较好促进作用。但葡萄糖浓度过低时对菌体的生长显然是不利。氮源是用来构成菌体的蛋白质、核酸等含氮物质以及抗生素等含氮代谢产物的。本试验加入了两种氮源：豆饼粉和硫酸氨，结果表明豆饼粉对试验的影响是很小的，可以作为试验的误差分析。氮源类主要影响试验的是硫酸氨，但浓度过高会产生氨阻遏效应，影响抗生素的生物合成。从试验结果我们可以看出最佳配比的硫酸氨浓度是0.3%。说明当浓度为0.7%时可能已经对林可霉素的产生有阻遏作用。2 无机盐磷酸二氢钾对产生林可霉素的影响磷是核酸和蛋白质的必要组成成分，也是重要的能量传递者-三磷酸腺苷的成分，在代谢途径的调节方面，磷起着重要的作用。试验表明当磷酸盐的浓度为0.025%时在产生的效价是比较高的，达到了2520U/mL，比没有加磷酸盐的效价提高了62%。但由于磷酸盐对林肯链霉菌产生林可霉素的次级代谢途径有阻碍作用，所以当浓度大于0.025%时便会延迟或减少林可霉素的合成。3 酪氨酸前体对产生林可霉素的影响试验表明当发酵培养基中加入酪氨酸时其效价能力比原来要高，当加入的酪氨酸浓度达到0.15%时其效价能力提高了大约14.9%，但估计酪氨酸的加入并不是提高了林可霉素产生速率，只是加入的酪氨酸提前了产生林可霉素的时间。4.总结发酵培养基对合成林可霉素的影响主要在林肯链霉菌的初级代谢和次级代谢上，往往有些对初级代谢起生长促进作用物质反而对次级代谢反应产生抑制作用，相反有些则可能对产生林可霉素的次级反应起促进作用而对菌体生长繁殖产生抑制，所以我们必须找出这些物质的关系，在保证林肯链霉菌充分生长繁殖的基础上及时启动对林可霉素产生的次级代谢反应，这就是试验的目的。展望： 最近几年来，我国在林可霉素医疗效果上发展迅速，产量不断增大，技术水平也不断提高。国外在经过近几十年的发展后，林可霉素的发酵水平尤其是美国其发酵单位已达到2-3万U/mL。国内起步比较晚，起步效价很低，目前国内发酵水平仍然不高。与国外的生产水平相比仍有很大的差距。因此研究林可霉素发酵工艺提高生产水平，无论对医疗还是在与国外的竞争上都具有很重要的意义。本试验也着重于培养基的优化上，但与前人所选取的因素不同，以淀粉+葡萄糖、豆饼粉、玉米浆和硫酸铵四个因素做正交试验，在此基础上选出最佳的配比关系,确定他们合成林可霉素影响的大小，这对以后的工作有很大帮助。试验还选取了酪氨酸前体做单因素试验，这在国内是不多的。但这次试验还有很多不足之处，如由于时间的原因，本试验对很多物质的单因素试验没有过多的设及，如能对培养基中的各种物质做进一步的单因素分析，并深层探过这些物质对产生林可霉素的调控机制。将会对以后的试验和工业生产有很大的帮助。但目前国内的研究重点主要是在林可霉素的诱变、筛选以及发酵工艺的条件优化上,而国际上主要侧重于合成林可霉素的基因研究，他们探讨的是微生物的基因那些是控制生长的那些是控制合成林可霉素的，而这些相应的基因又是如何调节。将来国内研究的重点也会转到林肯链霉菌生长发酵的基因上，只有在掌握了生长发酵的本质，我们便可以在基因的水平上通过定点突变大幅度提高产抗生素效价能力。致 谢毕业设计论文能够顺利地完成，首先要感谢我的专业课老师。正是在他们的悉心教导下，才得以让我灵活运用所学到的扎实的基础理论知识。通过本次毕业设计论文的整体把握和具体的实验日程安排，我学到了很多。不仅综合运用了所学的理论知识，还学会了从教科书、图书、期刊等途径获取有用的资料，并在做实验的过程中自己动手，不断掌握、透彻掌握和熟练运用蛋白酶解工艺和生化基本分离鉴定实验的原理和方法。认识到科学研究的真谛。用科学的态度去做科学性的研究，用科学的理论思维去探索和创新，一丝不苟，不断探索！最后，本人忠心感谢，感谢他们在实验中给于的细心指导和帮助！谢谢！ 作者：李阳 2007年6 月10日参考文献1李丽燕 .微生物药品化学. 北京中国医药科技出版社.1990.2 Verdier L, Bertho G, Gharbi-Benarous J, Girault JP .Lincomycin and clindamy- cin conformations. A frag- ment shared by macrolides, ketolides and lincosamides determined from TRNOE ribosome-bound conform ationsJ. Bioorg Med Chem 2000,8: 2251243.3Dietmar Neusser,Heike Schmidt.The genes lmbB1 and lmbB2 of streptomyces Lincolnensis encode enzymes involved in the conversion of L-tyrosine to propylproline during the blosynthesis of antibiotic Lincmycin AJ.Arch Microbiol.1998,169:322-332.4 Spizek J, Rezanka T. Lincomycin, cultivation of producing strains and biosynthesisJ. Appl Microbiol Biotechnol.2004,63:510-519.5朱立元,刘瑞华.林可霉素高产菌种的选育J. 安徽医药.2001,5(2):89-90.6杨玲,喻红,邹晖,邹美珍.紫外诱变选育林可霉素高产菌株J.江西化工.2005,4:137-138.7付晖.林可霉素高产菌株HBP-46号的筛选J.华夏医学.2002,15(6):744-746.8童婷.林可霉素发酵培养基优化实验研究J. 江西南昌，2006:173-174.9周晓荣，姚曙光.林可霉素发酵培养基的改进J 安徽医药,2003,7(5):332.10张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验方法和技术M.高等教育出版社,1997:165-166.11林加涵,魏文铃,彭宣宪.现代生物学实验M.高等教育出版社,2001:2-5.12中国药品检验标准操作规范S,2001.415.13姚汝华.微生物工程工艺原理M.广州华南理工出版社,1996:128.14王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学M.高等教育出版社,564.15田云龙.碳源和氮源对中生菌素发酵影响的研究D.中国农业科学院研究生院,18.16 北大数学力学系概率论统计组.正交设计法.北京:石油出版社,1976:67.17 Weinberg E D Dev lnd Microbiol.1974,15:70-81.18 金奢,杨蕴刘,焦瑞身.林肯链霉菌合成林可霉素代谢调节的研究J.生物工程学报,1998,14（1）.19 Chang F N.In :Hahn F E eds. Antibiotics,New York :Springer Press,1979:127.20 Aharonowitz, Y. and Demain, A.L. 1978. Carbon catabolite regulation of cephalosporin production in Streptomyces clavuligerus. Antimicrob. Agents. Chemother.附 录A表格表1 糖标准曲线测量数据滴定数(mL)空白-样品（mL）空白123456789109.268.707.967.166.505.804.844.063.402.921.820.561.302.102.763.464.425.205.866.347.44表2正交试验第120小时的测量结果123456789pH菌浓(%)N(mg/mL)C(g/mL效价u/mL8.025250.54.0511888.125344.24.0510728.044333.75.1311078.214837.94.0915466.715230.53.8914177.484538.64.1210246.865040.53.9519457.684646.34.3514007.384848.65.001579表3 正交试验第164小时测量数据123456789pH菌浓(%)N(mg/mL)C(g/mL效价u/mL8.184850.72.0615248.124948.63.5111668.155039.81.6420018.305243.52.6416007.804646.62.5119727.854848.93.1015887.905142.72.5023098.173850.61.9817597.624249.31.751653表4 正交试验第215小时(1-4)192小时(5-9)测量数据123456789pH菌浓(%)N(mg/mL)C(g/mL效价u/mL8.534258.60.8119788.224565.30.6422708.103753.50.6525048.295160.30.5822048.004564.00.6223758.114555.60.7620658.145250.10.8221298.174762.20.6419197.865154.00.761719表5 无机盐磷酸二氢钾对林可霉素产生的影响测量结果磷酸二氢钾（%）000050015002500350045效价pH菌浓15568.0137%21348.1542%23738.1245%25207.9843%22128.2539%16538.1540%表6 酪氨酸对合成林可霉素的测量结果酪氨酸浓度（%）00050101502效价pH菌浓25008.0538%20578.1242%28058.2240%28727.9347%25328.0244%图2 测量效价时平板ag an employment tribunal clai Emloyment tribunals sort out disagreements between employers and employees. You may need to make a claim to an employment tribunal if: you dont agree with the disciplinary action your employer has taken against you your employer dismisses you and you think that you have been dismissed unfairly. For more informu, take advice from one of the organisations listed underFur ther help. Employment tribunals are less formal than some other courts, but it is still a legal process and you will need to give evidence under an oath or affirmation. Most people find making a claim to an employment tribunal challenging. If you are thinking about making a claim to an employment tribunal, you should get help straight away from one of the organisations listed underFurther help. ation about dismissal and unfair dismissal, seeDismissal. You can make a claim to an employment tribunal, even if you haventappealedagainst the disciplinary action your employer has taken against you. However, if you win your case, the tribunal may reduce any compensation awarded to you as a result of your failure to appeal. Remember that in most cases you must make an application to an employment tribunal within three months of the date when the event you are complaining about happened. If your application is received after this time limit, the tribunal will not usually accept i. If you are worried about how the time limits apply to you