水泡性口炎诊断技术

ICS 11220B 41N Y中华人民共Sn国农业行业标准NYT 1 1882006水泡性口炎诊断技术Diagnosis techniques for vesicular stomatitis20060710发布 200610一01实施中华人民共和国农业部发布NYT 1 1882006刖置 水泡性口炎(VS)是由弹状病毒科的水泡性口炎病毒(VSV)引起的马、牛和猪的一种水泡性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病，我国将其列为二类疫病。本病临床上与口蹄疫、猪水泡 病、猪水泡疹很难区别，主要表现为口唇部有水泡、溃疡、糜烂，影响采食，导致生长缓慢，影响经济效益。 OIE采用组织细胞、鸡胚、实验动物等方法分离水泡性口炎病毒，进一步用问接夹心酶联免疫吸附 试验(ISELIsA)和补体结合试验(cF)对分离的病毒进行鉴定；在国际贸易中，OIE指定用液相阻断酶联免疫吸附试验(LPELISA)、病毒中和试验(VN)和补体结合试验(cF)检测水泡性口炎血清样品。本标准中水泡性口炎的病毒分离试验、ISELISA试验和病毒中和试验，是根据OIE哺乳动物、 禽、蜜蜂A和B类疾病诊断实验和疫苗标准手册)(2000版)中的诊断技术以及国内近年来在水泡性口 炎方面的研究成果而制定的，其中病毒分离试验、IS-ELISA试验和病毒中和试验均与OIE的标准性文 件等效。本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业部动物检疫所。 本标准主要起草人：李其平、龚振华、陆明哲、郑增忍、郭福生、蒋正军、王海霞。NYT 11882006水泡性口炎诊断技术1范围 本标准规定了水泡性口炎(VS)的病毒分离鉴定试验、间接夹心酶联免疫吸附试验(ISELISA)和病毒中和试验(VN)的技术要求。 本标准适用于水泡性口炎流行病学调查、临床诊断和实验室检测等。2病原分离与鉴定21病原分离211器材100 mL玻璃细胞培养瓶，恒温水浴箱，C02培养箱，超净工作台，倒置显微镜。212试剂及溶液配制MEM营养液，PBS缓冲液，犊牛血清，75碳酸氢钠溶液，青霉素(104TUmL)与链霉素(104mgmL)溶液，3的谷氨酰胺溶液，Hanks液，灭菌生理盐水，025胰蛋白酶溶液，缓冲甘油(pH 7277)，配制方法见附录A。2 13样品的采集2131采集发病动物口鼻部位的水泡皮和水泡液，水泡皮加人含50甘油的PBS缓冲液中，水泡液 置于含2犊牛血清和5葡萄糖的灭菌生理盐水中，冷藏送检。保存液的体积不能超过水泡皮或水泡 液体积的2倍。2132不能获得水泡皮和水泡液时，牛可用探杯采集食道n因(OP)黏液，猪可采集咽喉拭子，置于无 血清的细胞培养液中，冷藏送检。无血清细胞培养液的体积不能超过黏液或咽喉拭子的2倍。214样品的处理2141将水泡皮剪碎，研磨，悬浮于5倍体积的pH72、02 molL的PBS缓冲液中(含青霉素1 000IUmL、链霉素l 000mgmL)，4浸渍16h-20h，以3000 rmin离心15rain，取上清液，用O2m微孔滤膜过滤。2142将水泡液、OP液、棉拭子浸液加青霉素至1 000IUmL、链霉素至1 000mgmL，离心，取上清液，用02舯微孔滤膜过滤。215细胞接种2151将214的样品1mL接种长成单层的VERO细胞、BHK一21细胞或IBRS一2细胞，37吸 附1 h，中间摇动一次。2152加入9 mL维持液，37*(3、5C02培养箱中培养。2153每天观察细胞病变效应(CPE)，连续观察3天。2154如果细胞出现圆缩、聚集、固缩、脱落等病变，则进一步按方法22进行病原鉴定。盲传3代无病变者按218处理。216鸡胚接种2161将鸡胚卵置于蛋架上，气室朝上，以碘酒、酒精棉球消毒气室，用剪刀去除气室部蛋壳。2162用无菌眼科镊子撕去一小片内壳膜，在绒毛尿囊膜上滴入214中的样品02mL。2163用无菌脱脂棉撕成薄片盖住蛋壳，用蜡封口，于37孵育。12164如果鸡胚2天内死亡，鸡胚周身呈明显充血、出血，尿囊膜肥厚，收获尿囊膜按22方法作进 一步鉴定。盲传3代无病变者按218处理。217乳鼠接种2171将214的样品颈部皮下接种2日-7日龄乳鼠，每只接种02mL。2172每天观察乳鼠病变，连续观察5天。2173如果乳鼠出现死亡、生长不良等病变，则按22方法进一步鉴定。盲传3代无病变者按218处理。218可疑非免疫动物样品盲传3代未分离到病毒者，可进一步采集7 d14 d后的该动物血清，用方法3进行抗体检测。若检测结果为阴性，则判为无、v感染；若检测结果为阳性，则判为有VsV感染。22病原鉴定一间接夹心酶联免疫吸附试验(ISELISA】221器材40孔带盖灭菌酶标板，单道可调(10-L-200止)移液器，8和12道可调(50tL-200“L)移液器，灭菌塑料滴头。222试剂及溶液2221试剂：抗原，豚鼠抗VSv的标准NJ型和IND型血清，兔抗VSV的标准NJ型和IND型血 清，兔抗豚鼠18(3，正常兔血清，卵白蛋白，TMB底物。2222溶液：pH72、02molL的PBS缓冲液，pH 96的碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，PBSTB，配制见 附录A。23样品样品采集、处理与213-214相同。24操作方法241用pH96的碳酸盐碳酸氢盐缓冲液将兔抗、v的NJ型阳性血清、IND型阳性血清和正常兔血清包被ELISA板，每孔50止，于4C过夜。242弃包被液，每孔用磷酸缓冲盐水(PBs)洗1次，加50 pLl的卵白蛋白(用PBS液稀释)，在室温下封板1 h。243弃封闭液，每孔用PBSTB冲洗3次。244将被检样品悬液或21中致病变的分离培养物50 pL加到相应的孔中，每份样品均作双孔，振 荡，37孵育30 min。245弃反应液，每孔用PBSTB冲洗5次。2 46将与包被ELISA板的兔抗VsV标准阳性血清相应的豚鼠抗VSV的标准NJ型和IND型阳性血清用PBSTB稀释，分别加50止到相应的孔中，振荡，37C孵育30min。247重复245。248将过氧化物酶兔抗豚鼠IgG结合物用PBSTB稀释，每孔加入50止，振荡，37孵育30 min。249重复245。2410每孔加活化的TMB底物50止，在室温下反应15min，随后加入50,uL 1M硫酸终止反应，用 酶标仪测定吸光值。2411设标准阳性抗原对照。2412结果判定24121读取样品与抗vsv的NJ型、Inm型阳性血清和正常兔血清反应的吸光值，计算双孔平均值。2NYT 1188200624122对照抗原与其相应血清反应的吸光值较其与另一型血清反应的吸光值和正常兔血清反应的吸光值大20，试验成立。24123如果某个血清型反应的吸光值与另一血清型反应的吸光值和正常兔血清反应的吸光值相比 较，其样品吸光值大于后两者20，则被检样品为感染该相应血清型的VsV。24124如果某个血清型反应的吸光值与另一血清型反应的吸光值和正常兔血清反应的吸光值相比较，其样品吸光值大于后两者，但不超过20，应重复试验，如仍不超过20，则为阴性。3中和试验(本方法用于检测VSV抗体)31器材96孔细胞培养板，其他器材同21。32试剂及溶液配制vsv的NJ型、IND型病毒，VSV的NJ型、IND型阳性血清和阴性血清，细胞培养用培养液及溶液 配制与212相同。33样品的采集和处理 无菌采集血液，常规分离血清，将待检血清样品置56C水浴灭活30 min。34操作方法341病毒半数组织培养感染【TCIDso)的测定3411将jV标准毒株接种于长成单层的IBRS一2细胞，接种量为培养基液的110，37C培养， 待出现病变后，冻融，收获病毒。3412用MEM培养液将vSV病毒作连续10倍稀释，即10、10。2每个稀释度取50皿加入96孔细胞培养板中，随后加入经025胰酶消化的IBRS一2细胞悬液150 vtL(总细胞数约为3105个左右)，每个稀释度作8个孔重复，并设正常细胞对照。置37C5C02培养箱中。3413逐El观察细胞病变，共观察3 d-4 d，记录细胞病变孔数。按照ReedMuench法计算病毒的 TCI耽o。34 2中和试验3421在细胞培养板各孔中加入50 btL MEM培养液，随后在第1孔中加入1：2稀释待检血清50止 混合后，用微量移液器取出50止，加到第2孔中，混匀后取出50止再加入第3孔中，依此类推，直到第10孔，血清稀释度即为1：4、1：8 1：2 048，每份待检血清稀释度作4个孔重复。3422将50pL含1 000个TCII珐。的病毒液加到不同稀释度血清孔中，37*(3作用1 h。3423每血清孔中加入100止经胰酶消化分散的IBRS一2细胞悬液(总细胞数约为3105个左右)。3424设立对照组。34241病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将1 000 TCID5050 mL病毒液作01、1、10、100、1 000倍稀释，每个稀释度作4孔，每fL加50 uL病毒液，然后每孔加150,uL IBRS一2细胞悬液(总细胞数约为3105个)。34242阳性血清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照。3425逐El观察，记录病变和非病变孔数，共观察3 d4 d。病毒回归试验1 000 TCID50值应为500-1 330之间，阳性血清和阴性血清的滴度在其预先测定的平均值2倍以内，待检血清和正常细胞对照成立，测定结果方有效，否则该试验不能成立。343抗体中和效价 按照SpearlnannKarber法计算抗体中和效价。如抗体效价大于1：40，则判为VSV抗体阳性。3NYT”882006附录A (规范性附录) 培养基及溶液的配制A1细胞生长液MEM按常规方法配制 犊牛血清 10双抗溶液 1 谷氨酰胺 1 丙酮酸钠 1用75的碳酸氢钠调pH至70-72。置4保存。 A2细胞维持液按常规方法配制MEM，在MEM中按体积比加入犊牛血清 2双抗溶液 13谷氨酰胺 1用75的碳酸氢钠调pH至70-72。置4保存。 A3双抗(青链霉素)溶液青霉素 100万IU 链霉紊 100万mg 双蒸水 100mL将双蒸水放于500 mL瓶中高压1034 kPa 20 roan。青链霉素用少量双蒸水溶解后，再用双蒸水定 容至100mL。A475的碳酸氢钠溶液 碳酸氢钠(NaHC03)75 g双蒸水 100mL先将滤器灭菌后，加入液体过滤后分装于青霉素瓶中放4C保存备用。A53谷氨酰胺溶液谷氨酰胺 3 g 双蒸水 100mL 过滤除菌，分装于青霉素瓶中冻结保存。A6025胰蛋白酶溶液氯化钠(Naa) 80 g 氯化钾(KCI) 02 g 柠檬酸钠(2个结晶水) 10 g4NYT 11882006 磷酸二氢钠(1个结晶水)005 g葡萄糖 10 g胰蛋白酶 25 g05酚红4mL 加双蒸水 1 000mL 上述试剂依次溶解，胰酶可先用少量水37(3温箱中水浴溶解至透彻清亮，倒人量筒中，用75的碳酸氢钠调pH至76-78，定容至1 000mL，过滤除菌，分装小瓶，置一20冰箱保存。 A7生理盐水氯化钠(NaCI)85 g 双蒸水1 000mL 氯化钠融化后分装，1034 kPa 15 min高压，室温保存。A8Hanks原溶液 氯化钠(NaCl)80 g磷酸氢二钠(12个结晶水)06 g氯化钾(KCI)40 g 磷酸二氢钾(KH2PO)06 g 硫酸镁(7个结晶水)20 g 葡萄糖 1009 无水氯化钙(CaCl2) 14 g 双蒸水 1 000mL在配制时，应先将无水氯化钙用一小烧杯加入约100mL双蒸水，置4冰箱中溶解。等其他药品 融完后，加入混匀，定容至1 000mL。用滤纸过滤后，加入2mL氯仿，经充分混匀后，置4C冰箱中 保存。A9pH 72、02molL PBS溶液 溶液甲(A91)28 mL溶液乙(A92) 72mL氯化钠(NaCl)085 g等氯化钠溶解后，置室温保存备用。A91磷酸氢二钠(12个结晶水)71632 g双蒸水 1 000mLA92磷酸二氢钠(2个结晶水)312 g双蒸水 1 000mL A10 pI-I 96的碳酸盐碳酸氢盐缓冲液碳酸钠(Na2C03) 159 g 碳酸氢钠(NaI-ICCh) 293 g 迭氮钠 02 g双蒸水 加至1 000mL5NYT 11882006A11PB哪吐温一20 005 卵白蛋白 1 正常兔血清 2 正常牛血清 2 PBS补足至 100mL6